一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用与流程

1.本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用。


背景技术：

2.牛支原体(mycoplasma bovis,m.bovis)被认为是牛的重要新兴病原体之一，能够引起牛的呼吸系统疾病、乳腺炎、中耳炎、结膜炎和多系统炎症混合感染等临床相关疾病，尤其能够引起犊牛肺炎。m.bovis重要传染源为患病动物和带菌动物，一旦入侵牛群，很难根除。该病原是影响世界各地肉牛和奶牛养殖业的重要因素，并且是我国的重要致病因子之一，严重威胁着养殖业的健康发展。
3.目前国内还没有商品化m.bovis疫苗，因此快速、准确诊断是防控m.bovis感染的关键环节，并且不同诊断方法的技术敏感性和特异性等优缺点主要取决于其诊断靶标和诊断体系。随着诊断技术的不断发展，血清学检测和分子生物学检测方法逐渐代替分离病原这种耗时、费力且易交叉污染病原学诊断，成为主要的诊断方法。目前血清学诊断被认为是快速检测m. bovis感染的方法之一，适用于经过抗生素治疗或者处于慢性感染过程的m.bovis病例，其中间接elisa是用m.bovis蛋白作包被抗原，这一检测方法是当今最主要的血清学检测方法。目前己有使用m.bovis的p48蛋白、pdhb蛋白、vsp等特异性蛋白构建代替m.bovis全蛋白包被微板直接竞争elisa的检测方法，该方法具有较高的灵敏性，且与其他相关支原体无交叉反应，但是被检血清中m.bovis抗体水平的高低与m.bovis的患病率之间并没有直接的关系，这一缺陷限制了对m.bovis的精准确诊。聚合酶链式反应等分子生物学检测技术也是检测m.bovis的常见方法之一。研究人员基于sybr green染料开发一种针对uvrc基因的实时荧光定量聚合酶链式反应检测试剂盒，与其他相关细菌和其他支原体无交叉反应性，具有良好特异性，并且其敏感性可达100fg。m.bovis的微阵列分析和检测m.bovis oppd基因的实时pcr技术被用于乳幼牛呼吸道支原体群的有用工具，成为一种前沿、灵敏、特异的微阵列分析技术。但目前的聚合酶链式反应等检测方法虽然耗时短，但结果判读容易受到电泳等条件影响，不易精准判断，并且需要一些大型仪器设备和专业人员操作实验，使用复杂繁琐、不易在基层推广。
4.随着新冠疫情的爆发，快速诊断试剂条因其快速、准确等优点，适用于基层检测的便利性而备受体外诊断行业瞩目。而免疫胶体金层析法是近年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于层析作用，样品中的抗原到达固定有抗体的区带与抗体发生特异性结合，用免疫胶体金标记的抗体可显示特定颜色，从而直接判定结果。与其他检测技术相比，免疫胶体金试纸条的待检样品无需特殊处理，且用量极小(可低至50～100μl)，5～10分钟即可判定结果；同时该方法不需要实验室平台和特殊仪器，没有诸如放射性同位素等有害物质污染环境，试验结果还可长期保存。近年来该技术已在兽医临床疫病检测中得到了广泛的应用。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
6.本发明是这样实现的，一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条，包括样品垫，金标p48结合垫，nc膜，吸水垫，pvc底板；pvc底板中央贴有nc膜，nc膜上缘粘贴有吸水滤纸， nc膜下缘依次粘贴样品垫和标记有p48蛋白的胶体金标p48结合垫，p48多克隆抗体、p48 蛋白分别标记nc膜上的c线、t线；所述p48蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示；优化后的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述p48多克隆抗体为利用p48蛋白为抗原制备而成。
7.本发明还提供了如上述的一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
8.s1：获取p48蛋白；所述p48蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，优化后的核苷酸序列如seq id no.2所示；
9.s2：利用p48蛋白为抗原制备p48多克隆抗体；
10.s3：用p48蛋白标记胶体金，制备金标p48蛋白；
11.s4：准备样品垫，金标p48结合垫，nc膜，吸水垫，pvc底板；将金标p48蛋白涂布在金标垫上，在nc膜上划出c、t线，其中c线包被p48多克隆抗体、t线包被p48蛋白；在pvc底板中央贴上nc膜，nc膜上缘粘贴吸水滤纸，nc膜下缘依次粘贴样品垫和标记有 p48蛋白的胶体金标p48结合垫。
12.进一步地，使用划膜仪按照1μl/cm的用量在nc膜上划出t、c线。
13.进一步地，t线包被p48蛋白的浓度为2.0mg/ml。
14.进一步地，p48蛋白的获取方法为，将编码p48蛋白的核苷酸序列进行密码子优化后插入原核表达载体进行表达获得。
15.进一步地，所述密码子优化包括将第258处、714处、765处、1341处、1358处、1375 处、1382处的tga密码子优化为tgg。
16.本发明还提供了如上述的一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条在牛支原体抗体检测中的应用。
17.进一步地，所述试纸条在对牛支原体抗体进行检测的方法为，将待检样品滴在样品垫处或将试纸条的样品垫部分插入到待检样品液体中，平放10min后观察结果即可。
18.本发明立足于为兽医临床提供牛肺炎支原体基层现场快速准确的检测诊断技术，结合蛋白基因序列分析进而优化密码子，筛选p81、p48等优势反应原性蛋白，利用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株和制备多克隆抗体，发明一种基于双抗原夹心elisa建立的检测m.bovis的胶体金免疫的快速诊断的试剂条。
19.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
20.m.bovis的血清学检测方法有elisa、间接血凝试验、免疫组化试验等。而这些方法各有所长，免疫组化技术是在组织细胞原位通过抗原—抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，有准确地判断是否有病原感染，还能清晰地反映病原在组织器官和细胞中的定位及分布的长处。但技术要求相对较高、鉴定周期较长，不能用于快速诊断。
21.本技术制备的的双抗原夹心免疫试纸条与市售bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒相比，符合率为94.92％，197份样品中检出46份阳性血清，优于市售bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒，继续优化，有望成为国内初筛m.bovis抗体的适用于临床的快速、简便、特异、敏感的胶体金免疫检测试纸条试剂。
22.本发明利用p48蛋白作为免疫胶体金的诊断抗原，并制备了抗体检测胶体金试纸条，该试纸条具有较好的特异性和灵敏度，同时具有良好的重复性和稳定性，室温条件可存放至少2个月。
附图说明
23.图1是pet32a
‑
p81
‑
de3、pet32a
‑
p48
‑
de3最佳诱导时间的确定；a：pet32a
‑
p81
‑
de3最佳诱导时间的确定m：蛋白质分子质量标准；1：pet
‑
32a未诱导；2：pet
‑
32a
‑
p81未诱导；3：37℃诱导1h；4：37℃诱导2h；5：37℃诱导3h；6：37℃诱导5h；7：37℃诱导7h；8：37℃诱导8h；b：pet32a
‑
p48
‑
de3最佳诱导时间的确定；m：蛋白质分子质量标准；1：pet
‑
32a未诱导；2：pet
‑
32a诱导后；3：25℃诱导2h；4：25℃诱导4h；5：25℃诱导8h；6：25℃诱导10h；7：25℃诱导12h；
24.图2是p81、p48蛋白表达形式的确定；a：p81蛋白表达形式的确定m：蛋白质分子质量标准；1：p81诱导后的全菌蛋白；2：p81诱导后的沉淀；3：p81诱导后的上清b：p48蛋白表达形式的确定；m：蛋白质分子质量标准；1：p48诱导后的全菌蛋白；2：p48诱导破碎后的上清；3：p48诱导破碎后的沉淀；
25.图3是纯化的p81、p48蛋白；m蛋白质分子质量标准1、2纯化的p81蛋白3、4纯化的p48蛋白
26.图4是p81、p48蛋白的westernblot结果；a：p81、p48蛋白与m.bovis阳性血清的westernblot结果；m：蛋白质分子质量标准；1：p81蛋白与m.bovis阳性血清反应的阳性条带；2：p48蛋白与m.bovis阳性血清反应的阳性条带；b：p81、p48蛋白与m.bovis阴性血清的westernblot结果；m：蛋白质分子质量标准；1：p81蛋白与m.bovis阴性血清反应的阳性反应条带；2：p48蛋白不与m.bovis阴性血清反应；
27.图5是m.bovis全蛋白、外膜蛋白的sds
‑
page；1,2：m.bovis外膜蛋白；3,4：m.bovis全蛋白；
28.图6是m.bovis全蛋白、膜蛋白的westernblot结果；a：m.bovis全蛋白、膜蛋白与m.bovis阳性血清的westernblot结果；m：蛋白质分子质量标注；1：m.bovis膜蛋白；2：m.bovis全蛋白b：m.bovis全蛋白、膜蛋白与m.bovis阴性血清的westernblot结果m：蛋白质分子质量标注；1：m.bovis膜蛋白；2：m.bovis全蛋白；
29.图7是纯化的多克隆抗体反应原性验证；m蛋白分子标准；1：阴性对照；2
‑
4：抗p48多克隆抗体与全蛋白产生的阳性条带；
30.图8是胶体金试纸条的结果判定；
31.图9是试纸条的特异性验证；1:绵羊肺炎支原体阳性血清；2：大肠杆菌阳性血清；3：多杀性巴氏杆菌阳性血清；4：牛病毒性腹泻病毒阳性血清；5：牛种布氏杆菌阳性血清；6：牛型结核分枝杆菌阳性血清；7：m.bovis阳性血清；8：m.bovis阴性血清；
32.图10是试纸条的敏感性验证。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
35.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
36.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
37.本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
38.本发明披露了一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用。本发明中涉及的牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、m.bovis阳性血清均为动物科技学院陈创夫教授提供，绵羊肺炎支原体阳性血清为生命科学学院石峰教授提供；新西兰大白兔购于石河子大学实验动物中心。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
39.实施例1重组蛋白的制备
40.1、基因序列分析及优化
41.m.bovis p81、p48基因序列全长分别为2100bp、1407bp，其中p81基因编码699个氨基酸，在第165、690、1 455、1 674位存在tga密码子，p48基因(ncbi，dq354911)编码468个氨基酸，氨基酸序列见seq id no.1所示。在第258处、714处、765处、1341处、 1358处、1375处、1382处共7处存在tga密码子。为了让目的基因在大肠杆菌表达系统中高效、完整表达，将tga优化为tgg并在p48基因5'端加上bamhⅰ(ggatcc)酶切位点，3'端加上xhoⅰ(ctcgag)酶切位点，优化后的核苷酸序列如seq id no.2所示，送去上海生工公司合成并克隆于表达载体pet
‑
32a( )，质粒保存于dh5α菌株中，命名为pet32a
‑
p48
‑
dh5α，pet32a
‑
p81
‑
dh5α保存。
42.构建的重组表达质粒经bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后均得到了与预期片段大小相符的目的条带，分别为2100bp、1407bp，结合测序结果，表明目的基因已经被成功插入pet
‑
32a表达载体，且与优化后的序列完全一致。
43.2、蛋白的诱导表达
44.提取的重组表达质粒pet32a
‑
p81，pet32a
‑
p48按常规化学方法转化至bl21(de3)
感受态细胞，得到重组表达菌pet32a
‑
p81
‑
de3、pet32a
‑
p48
‑
de3。
45.重组表达菌pet32a
‑
p81
‑
de3、pet32a
‑
p48
‑
de3接种于含有200μg/m l氨苄青霉素的200 ml的lb液体培养基中，37℃恒温220r/min振荡扩大培养，当od
600nm
值≈0.6～0.8时，加入 200μl终浓度1mmol/l的iptg，25℃过夜或者37℃诱导8h表达。结果如图1， pet32a
‑
p81
‑
de3、pet32a
‑
p48
‑
de3分别经过诱导表达出大量的分子量分别为94kda、65kda 的p81、p48蛋白，蛋白分子量大小与预期相符，并且符合在一定范围内，随着诱导时间的增加蛋白量也在增加。
46.3、重组蛋白p81、p48的表达形式确定
47.大量诱导pet32a
‑
p81
‑
de3、pet32a
‑
p48
‑
de3离心收菌，裂解后分别取上清、沉淀进行 sds
‑
page鉴定表达形式，结果见图2，p81蛋白在沉淀中大量存在，故主要以包涵体的形式表达；p48在上清中大量存在，故主要以可溶性蛋白形式表达。
48.4、重组蛋白p81、p48的纯化
49.p81蛋白采用包涵体纯化方法，沉淀先用30ml binding buffer(25mmol/l tris
‑
hcl，500 mmol/l nacl，1％tritonx
‑
100，ph 8.0)吹打混匀，4℃过夜融解后10 000r/min(离心半径 13cm)离心15min，取上清，0.45μm过滤，p48蛋白取裂解后的上清过滤后直接进行纯化操作，含500mmol/l咪唑的10mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)溶液洗脱蛋白，纯化结果见图3，重组蛋白纯度在85％以上，无杂带，经bca蛋白定量法测定p48蛋白浓度为6mg/ml，p81蛋白为5mg/ml。
50.5、重组蛋白p81、p48的反应原性比较
51.含有纯化且无杂带的p81、p48蛋白的两块nc膜分别放入两个杂交瓶，分别加入5ml 1:1000倍稀释的m.bovis阳性血清、m.bovis阴性血清，37℃作用1h，洗涤后加入1:5000 稀释后的hrp
‑
兔抗牛igg，37℃作用1h，避光显色，结果见图4，分别在94kda、65kda 处出现单一条带，p81蛋白既与阳性血清反应又与阴性血清反应，而p48蛋白与阳性血清反应但不与阴性血清反应，p81、p48蛋白均具有良好的反应原性，p48蛋白的特异性相对p81 蛋白良好，但p81蛋白无特异性。
52.本技术本实施例获得m.bovis的p81、p48重组蛋白，其中，p81蛋白主要以包涵体的形式表达，p48蛋白主要以可溶性蛋白形式表达。在纯化蛋白时包涵体蛋白的纯化更复杂一些。p81、p48蛋白均具有良好的反应原性，而p48蛋白具有较好的特异性。
53.实施例2全蛋白、膜蛋白的特异性比较
54.1、m.bovis全蛋白、外膜蛋白的sds
‑
page及western blot检测
55.按照本领域常规方法将m.bovis菌株扩增后灭活，并提取全蛋白。按照支原体外膜蛋白提取试剂盒(bb
‑
31515)的操作说明进行具体步骤，得到牛支原体外膜蛋白。
56.通过bca定量法检测m.bovis全蛋白的浓度为5mg/ml，外膜蛋白的浓度为6mg/ml，用1
×
pbs(ph 7.4)稀释至2mg/ml后，各取80μl样品处理，进行sds
‑
page电泳。结果见图5，m.bovis外膜蛋白主要包括分子量为25kda、35kda、42kda、55kda、65kda、 94kda的蛋白，而m.bovis全蛋白主要包括分子量为65kda、94kda的蛋白。
57.western blot检测结果见图6所示，m.bovis全蛋白、外膜蛋白均与m.bovis阳性血清反应，产生阳性条带，具有良好的反应原性，也均与m.bovis阴性血清反应，产生阳性条带。
58.2、基于四种蛋白建立间接elisa
59.包被：用0.05m ph 9.6的碳酸盐包被液对全蛋白、外膜蛋白、p81蛋白、p48蛋白分别稀释至最佳浓度，包被96孔可拆卸酶标板，100μl/孔，4℃过夜；
60.洗涤：次日倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
61.封闭：5％脱脂奶粉加入包被的96孔板，300μl/孔，37℃封闭2h；
62.洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
63.加样：阴、阳性血清样品分别用pbst稀释至最佳稀释度，100μl/孔，同一样品做3个重复检测孔，同时设置空白孔，于37℃孵育1h；
64.洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
65.加酶标抗体：用pbst稀释hrp
‑
兔抗牛igg至最佳稀释度，100μl/孔，37℃孵育1h；
66.洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
67.显色：加入tmb底物显色液，100μl/孔，37℃避光显色20min；
68.终止反应：加入2mol/l h2so4，50μl/孔，终止反应；
69.读数：酶标仪读取在450nm处检测的吸光值(od
450nm
值)。
70.并进一步地对最适包被浓度、兔抗牛二抗最佳工作浓度、血清样品最佳稀释度进行摸索。
71.在不同包被浓度下，p81蛋白和膜蛋白随着包被浓度的增加，其p/n值基本不变，保持在1.0左右，阴阳性血清的od
450nm
值相差不大，蛋白特异性不好；p48蛋白的p/n值明显凸显出良好的优越性，且随着包被浓度的增加，p/n值呈现正态分布，阳性血清od
450nm
值大于 1.0且阴性血清od
450nm
值在0.2左右，阴、阳性血清的od
450nm
值相差很明显，蛋白特异性良好；全蛋白较为突出，但p/n值不随蛋白包被浓度的增加而改变，且阴性血清的od
450nm
值均大于0.4。选定m.bovis的p48蛋白作为m.bovis血清学检测的特异性优势抗原。
72.确定p48蛋白最适包被浓度为5.0μg/ml，hrp
‑
兔抗牛igg最佳稀释度为1:5000。确定p48蛋白包被量、hrp
‑
兔抗牛igg稀释度后处理96孔酶标板，将阴、阳性血清样品分别作 1:20、1:40、1:80、1:160倍比稀释度，100μl/孔，37℃孵育1h，可以发现p48蛋白的p/n 值仍然最高，特异性良好，血清在1:40稀释度时为最佳。
73.实施例3基于p48蛋白建立双抗原夹心elisa及评价
74.1、兔抗p48多克隆抗体的获取
75.动物免疫：健康的6周大小的新西兰大白兔(2.0kg左右)用75％酒精棉球擦拭耳部消毒，至静脉充分扩张暴露于皮毛中，用10ml注射器平行插入耳静脉抽10ml血，用酒精棉球按住伤口压迫止血；37℃灭活30min，4℃过夜使其凝结释放血清，配平10000r/min离心 10min，抽取血清收集于离心管中，
‑
20℃保存。取1ml本技术制备的p48蛋白，加入等体积弗氏完全佐剂，用匀浆仪将其充分搅拌混匀，形成遇水不散的水包油，制成免疫原；注射大白兔的背部、皮下，选8
‑
10个点免疫；一免10天后，加强免疫，免疫量减半为500μg p48 蛋白，再加入等体积弗氏不完全佐剂，注射方法同上，10天后，再加强免疫，免疫量为500μgp48蛋
白，再加入等体积弗氏不完全佐剂，注射方法同上。
76.包被p48蛋白建立间接elisa，阴性参照为预取血血清，空白参照为不加血清，具体操作步骤同实施例2的操作步骤，抗体效价检测达到10万以上后，采取颈动脉采血法对兔子进行放血。收取血清送往华大基因公司利用protein a抗体纯化柱进行纯化，检测抗体纯度及效价。
77.纯化的多克隆抗体以蛋白marker中标准蛋白在凝胶中相对迁移率及蛋白分子量为标准，进行sds
‑
page检测，根据抗体重链和轻链在凝胶中迁移情况，可以估算出抗体的分子量为 80kda，重链亚基为55kda，轻链亚基为25kda，凝胶成像仪上image master vds软件分析表明，纯化的多克隆抗体的纯度为90.1％。当纯化的多克隆抗体稀释至1:204800时，p/n值为1.0左右，故制备的多克隆抗体效价为204800。
78.2、兔抗p48多克隆抗体的反应原性检测
79.取纯化的全蛋白80μl，加入20μl 5
×
sds
‑
page loading buffer混匀，置于沸水浴中5min 后，冷却至室温，高速离心30s，取20μl上清，直接加入sds
‑
page凝胶加样空内进行常规电泳，加入5ml1:1000倍稀释的兔抗p48蛋白多克隆抗体，37℃作用1h进行western blot 实验。
80.包含全蛋白的nc膜与兔抗p48多克隆抗体37℃孵育1h，显示多克隆抗体可以与全蛋白良好结合，产生阳性条带，同时说明了p48蛋白具有良好的反应原性和免疫原性，结果见图7。
81.3、基于p48蛋白的双抗原夹心elisa的建立
82.1)包被：用0.05m ph 9.6的碳酸盐包被液对p48蛋白稀释至最佳浓度，包被96孔可拆卸酶标板，100μl/孔，于4℃过夜；
83.2)洗涤：次日倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次， 2min/次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
84.3)封闭：最适封闭液加入包被的96孔可拆卸酶标板，300μl/孔，37℃孵育2h；
85.4)洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
86.5)加样：m.bovis阴、阳性血清分别用pbst稀释至最佳稀释度，100μl/孔，同一样品做3个重复检测孔，同时设置空白孔，于37℃孵育1h；
87.6)洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
88.7)加酶标抗原：取已稀释的hrp
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p48，100μl/孔，37℃孵育1h；
89.8)洗涤：倒出液体，用pbst洗涤液300μl/孔，置于微孔板振荡器，洗涤3～5次，2min/ 次，于吸水纸上拍干至内无液滴；
90.9)显色：加入tmb底物显色液，100μl/孔，37℃避光显色20min；
91.10)终止反应：每孔加入50μl终止液(2mol/l硫酸)，终止反应；
92.11)读数：酶标仪测定在450nm处检测的吸光值(od
450nm
值)。
93.进一步地，对p48蛋白最适包被浓度、hrp
‑
p48最佳稀释度、p48蛋白包被最佳条件、封闭液及封闭时间、阴、阳性血清最佳稀释度及反应时间、hrp
‑
p48反应时间、底物反应时间、阴、阳性血清临界值等参数或条件进行优化。
94.确定了p48蛋白最适包被浓度为4.0μg/ml，hrp
‑
p48的最佳工作浓度为1:4000；最佳包被时间为4℃过夜加37℃孵育2h；5％脱脂奶粉为最佳封闭液，1％明胶、2％bsa次之；最佳封闭时间为37℃封闭2h；最佳稀释度为1:80，最佳反应时间为1.5h；hrp
‑
p48的最佳作用时间为37℃孵育1h；底物显色最适时间为室温避光反应20min。经计算阴性血清 od
450nm
平均值＝0.249，标准方差＝0.029，根据方程阴阳性临界值＝阴性样本平均值 3
×
标准方差(3sd)＝0.336，临界值为0.336，在规定的实验条件下，血清样本作1:80稀释，其od
450nm
值大于临界值，即待检血清样本od
450nm
值≥0.336，判为阳性，否则判为阴性
95.4、双抗原夹心elisa方法的评价
96.特异性试验：利用建立的双抗原夹心elisa方法检测牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、m.bovis阳性血清与健康牛血清进行检测，根据上述已确定的阴阳性临界值判定检测结果，验证所建立的间接elisa法的特异性，分析是否与以上几种阳性血清有无交叉反应。
97.结果显示：牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、m.bovis 阴性血清的od
450nm
值均小于临界值0.336为阴性，m.bovis阳性血清od
450nm
值为2.07大于临界值0.336为阳性，结果见下表，证明该方法特异性良好。
98.表1特异性结果
[0099][0100]
敏感性试验：用建立的双抗原夹心elisa方法检测作1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、 1:6400、1:12800、1:25600倍比稀释后的m.bovis阳性血清，进行elisa试验，以测定结果为阳性血清的最高稀释倍数为其敏感性。
[0101]
结果显示：以检测结果为阳性的血清的最高稀释度为该方法的敏感性，elisa检测为阳性的最高稀释度为1:6400，故检测下限为1:6400稀释的血清，结果见下表。
[0102]
表2敏感性结果
[0103][0104]
重复性试验：用建立的双抗原夹心elisa方法包被96孔板，检测5份m.bovis阳性血清，同一份血清做3个重复检测孔，同时设置标准阳性、阴性与空白对照，计算平均值和标准方差，计算板内变异系数(cv)。另外采用三个批次处理的3块酶标板，分别检测这5份 m.bovis阳性血清，测定od
450nm
值，计算这5份m.bovis阳性血清的平均值和标准方差，计算在不同板间的变异系数(cv)，评价该双抗原夹心法的重复性。
[0105]
结果显示：同一酶标板检测五份阳性血清od
450nm
值的平均数、标准方差，不同酶标
板检测五份阳性血清od
450nm
值的平均数、标准方差的结果，见下表，批内、批间试验变异系数均<10％，证明该方法具有良好的重复性。
[0106]
表3重复性结果
[0107][0108][0109]
5、双抗原夹心elisa方法的应用
[0110]
建立的双抗原夹心elisa方法和bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒(lot no.l.179411) 分别检测临床采集的100份样品，测定od
450nm
值，根据上述已确定的阴阳性临界值判定检测结果，得出符合率。
[0111]
结果显示：在临床检测的100份牛血清样本中，m.bovis双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒检测出32份阳性，78份阴性；进口bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒(lot no.l.179411) 检测出34份阳性，76份阴性。两种试剂盒的总符合率为96％，结果见表4。
[0112]
表4建立的双抗原夹心elisa法与进口bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒的符合率
[0113][0114]
间接elisa法检测抗体存在假阳性率高、特异性差等的问题，使得各个检测试剂研发机构采用多种方法来消除阴性本底，间接法非特异性反应产生的原因，包括样品中非特异性的抗体与包被抗原中的杂蛋白、包被介质或封闭液的结合造成的非特异性显色，与酶标记物非特异性吸附在固相载体造成的非特异性显色等情况。然而，双抗原夹心法对包被抗原和封闭用的均有较强的吸附作用，相比于间接法，有更好的特异性，使其阴性本底较间接法更易控制，夹心法可以促进弱阳性样本的检出。
[0115]
本技术本实施例制备了效价良好的兔抗p48多克隆抗体，验证了本技术制备的p48蛋白具有良好的反应原性、免疫原性，基于p48蛋白建立双抗原夹心elisa方法，一方面为研制可替代昂贵的进口商品化elisa试剂盒提供研究基础，另一方面为后续建立检测牛全血中 m.bovis抗体胶体金免疫试纸条奠定研究基础。
[0116]
实施例4牛支原体抗体检测胶体金免疫试纸条的建立
[0117]
1、金标p48蛋白的制备、最佳条件的摸索
[0118]
取10枚1.5ml干净的离心管，分两组置于托板上固定，1ml/管，将胶体金溶液置于其中，缓慢滴加0.1mol/l的碳酸钾(k2co3)溶液，边滴加变快速混匀，将ph分别调节至7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0，每个ph有相同两组；利用1
×
pbs(ph 7.4)缓冲液将p48蛋白浓度稀释至
1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml滴加到胶体金溶液中，每个浓度有相同两组，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃条件下静置1h；最后分别加入100μl/孔， 10％的nacl溶液，充分混匀后4℃静置1h，观察溶液的变化情况，同时利用酶标仪读取读取od
450nm
值，选择od
450nm
值最高所对应的ph值及标记抗体量作为胶体金标记抗体的最佳条件。
[0119]
确定好最佳ph和最佳标记量后，2000r/min离心20min，留上清，14000r/min，4℃离心1h，留上清，按照1:10的比例滴加2％的bsa溶液，混匀，4℃条件下再次静置30min； 2000r/min，4℃离心15min，留上清到干净的离心管中，弃去未标记的胶体金沉淀物；上清 10000r/min，4℃离心30min，弃上清，保留标记的胶体金颗粒沉淀，分装，4℃备用。
[0120]
结果显示，当加入蛋白浓度小，不足以稳定胶体金溶液时，颜色由红色变为蓝色出现聚沉现象，当加入蛋白的量达到或超过最低稳定量，红色保持不变的最低蛋白量就是最适蛋白量，测得od
450nm
值。在ph为8.2时吸光值最大，表明与胶体金连接效果最理想，正如偏碱性的条件下，带负电的胶体金可以与带正电的蛋白质通过物理特性稳定结合，在胶体金溶液 ph值一定的条件下，其吸光度随着蛋白量的增加而逐渐增高，加入3mg/ml鼠抗地高辛igg 时od
450nm
值显着提高，持续增加吸光值逐渐变低，因此，当胶体金溶液的ph为8.2，加入 3mg/ml的p48蛋白标记时最佳。
[0121]
2、p48蛋白、金标p48蛋白最佳稀释倍数的优化
[0122]
t线即检测线包被p48蛋白，用1
×
pbs(ph 7.4)缓冲液稀释为1mg/ml、2mg/ml、4 mg/ml、5mg/ml，c线即检测线包被抗p48多克隆抗体，将其稀释100倍，操作划膜仪按照 1μl/cm分别在nc膜上划出c、t线，室温干燥过夜。金标p48蛋白溶液，用1
×
pbs(ph 7.4) 缓冲液分别稀释4、6、10倍，30μl/cm，均匀涂布在金标垫上，室温干燥过夜，次日把各部分组合成试纸条，阴、阳性血清10倍稀释至100μl，空白对照是1
×
pbs(ph 7.4)100μl 滴加在上样垫上，根据显色结果分析不同条件组合检测线的颜色强度、稳定性、显色时间等特性，选择最适的金标p48蛋白和p48包被抗原的稀释倍数。
[0123]
结果显示，随着金标p48蛋白溶液浓度的增加，c线的显色程度越来越强，直至稀释到 10倍时强度不在增强；p48蛋白稀释至4.0mg/ml时，t线颜色开始越来越亮，根据c、t线的显色情况确定，当胶体金标p48稀释10倍、p48蛋白稀释至2.0mg/ml时，t、c线颜色一致，确定为最佳条件。
[0124]
3、兔抗p48多克隆抗体最佳稀释倍数的优化
[0125]
上述最佳条件确定后，包被于c线的的兔抗p48多克隆抗体分别用1
×
pbs(ph 7.4)缓冲液稀释50、100、150、200倍，阴、阳性血清稀释10倍至100μl，空白对照是1
×
pbs(ph 7.4)100μl滴加在上样垫上，根据显色结果分析不同条件组合检测线的颜色强度、稳定性、显色时间等特性，选择t线和c线颜色强度保持一致的条件，选择最佳的多克隆抗体的稀释度。
[0126]
结果显示：兔抗p48多抗浓度增高时，质控线颜色强度明显高于检测线，当稀释倍数为 100时，两条检测线均清晰可见，而且颜色强度保持一致，因此，兔抗p48多克隆抗体稀释度为1:100时最佳。
[0127]
4、试纸条的组装、检测和结果的判定
[0128]
准备好样品垫、金标p48结合垫、nc膜、吸水垫、pvc底板，在pvc底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘依次粘贴样品垫、
标记有p48蛋白的胶体金结合垫，兔抗p48蛋白多克隆抗体、p48蛋白分别标记c线、t线，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条，固定在塑料外壳内，室温下密封避光干燥保存备用。
[0129]
将待检样品滴在样品垫处3～5滴或将试纸条的样品垫部分插入到待检样品液体中(注意液体的液面勿超过金标垫)，同时平放，10min后观察检测结果，若仅在质控线地方出现红色的条带，为阴性结果；若在检测线和质控线的地方均出现红色条带，为阳性结果，见图8。
[0130]
5、特异性试验
[0131]
牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、m.bovis阳性血清、阴性血清各取10μl稀释至100μl后滴加于试纸条上样垫，5min后读取结果，进行特异性试验。
[0132]
结果如图9，牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、m.bovis 阴性血清滴加的试纸条均显示为c线的一条红色条带，结果为阴性。m.bovis阳性血清滴加的试纸条显示为两条红色条带，为阳性。结果说明，本技术本实施例建立的试纸条能够检测 m.bovis阳性血清，并且与其他致病菌无交叉反应，表明试纸条特异性良好。
[0133]
6、敏感性试验
[0134]
m.bovis阳性血清用1
×
pbs(ph 7.4)稀释10倍、20倍、40倍、80倍、100倍、200 倍、300倍，各取100μl滴加到试纸条上，5min内观察检测结果，进行敏感性试验。
[0135]
结果如图10所示，其中，1为10倍；2为20倍；3为40倍；4为80倍；5为100倍；6为200倍；7为300倍。m.bovis的阳性血清稀释10倍、20倍、40倍、80倍、100倍、200 倍、300倍，各取100μl滴加确定的核酸试纸条样品垫上，5min后观察检测结果，当抗体稀释200倍、300倍时，只有一条红色条带，稀释至16倍时，出现两条红色条带，说明检测 m.bovis抗体检测的敏感性为1:16。
[0136]
7、重复性试验和稳定性试验
[0137]
随机抽取三份不同m.bovis阳性血清，稀释0倍、20倍、40倍、100倍分别滴加在同一批次制备的胶体金试纸条上观察显色情况，进行重复性试验。
[0138]
随机从不同批次的试纸条中抽取36个胶体金试纸条，第一组是室温存放1个星期的试纸条；第二组是室温存放1个月的试纸条，第三组是室温存放2个月的试纸条，三个平行验证，对稀释0倍、20倍、40倍、100倍的同一份阳性血清进行稳定验证试验，观察显色情况，进行稳定性试验。
[0139]
结果显示，随机取三份不同的阳性血清，分别稀释0倍、20倍、40倍、100倍，分别滴加在同一批次制备好的不同胶体金试纸条上进行重复性试验，观察显色情况，结果见下表，检测结果不因不同批次的pcr反应产物而改变，因此，试纸条重复性良好。
[0140]
表5试纸条的重复性试验显色结果
[0141][0142]
随机取同一份阳性血清分别稀释释0倍、20倍、40倍、100倍，分别滴加在室温存放3 个月、6个月、12个月的不同批次的试纸条上进行稳定试验，观察显色情况，结果见下表，不同存放时间的试纸条检测线颜色强度差异不大，检测结果保持一致，稳定性良好，该试纸条常温下至少可以存12个月。
[0143]
表6试纸条的稳定性试验显色结果
[0144][0145]
8、抗体检测试纸条的应用
[0146]
将采集的42份m.bovis阳性血清、155份阴性血清分别经bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒(lot no.l.179411)和建立的抗体检测试纸条检测，将两种方法检测结果进行平行比较。
[0147]
将本研究制备的试纸条与市售进口bovicheck牛支原体抗体检测试剂盒(lotno.l.179411)检测方法相比，结果见下表，合计197份血清抗体，两种检测方法的符合率为 94.92％，且胶体金试纸条所需样本的含量较少，可在10分钟内完成检测。
[0148]
表7两种检测方法的比较结果
[0149][0150]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。