使用CAS9/RNP和AAV病毒的组合来产生用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体（CAR）-原代NK细胞的制作方法

2022-02-18 22:56:45 来源：中国专利 TAG：

CRISPR/Cas9技术最近已用于工程细胞。已经证明该技术是一种通过创建DNA断裂或进行小的取代或小的插入来沉默基因的稳健方法。然而，该技术受到技术障碍的困扰。用于将CRISPR/Cas9(与任何供体DNA或RNA一起)递送到细胞中的技术(诸如显微注射、电穿孔和核感染)不适合体内使用。此外，敲入突变在体外、体内和临床应用中通常效率非常低。使用病毒载体将CRISPR/Cas9(与任何供体DNA或RNA一起)递送到细胞中可解决体内适用性，但对转基因大小具有限制且可能诱导宿主免疫应答，导致大量程序相关的细胞凋亡和基因工程改造的细胞的有限产生。需要用于工程细胞的遗传和载体的新方法。

技术实现要素：

公开了用于将CRISPR/CAS9基因编辑系统递送至细胞的与AAV质粒相关的方法和组合物。在一些方面中，AAV质粒进一步包含转基因。

在一个方面中，本文公开了用于成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR) /CRISPR相关的9(Cas9)整合系统的质粒，其中该质粒依次包括左同源性臂、剪接受体、转基因和右同源性臂，其中该左同源性臂和右同源性臂的长度各自为800bp或更短(诸如，例如在质粒1和2中为30bp，在质粒3和4中为300bp，在质粒5和6中为500bp，或800bp)。在一些方面中，质粒可以进一步包含转基因与右同源性臂之间的聚腺苷酸化信号。

本文还公开了任何前述方面的质粒，其中左同源性臂和右同源性臂的长度相同或不同。

在一个方面中，本文公开了用于CRISPaint(或非同源末端连接)方法的质粒，其由 1或2个前间区序列邻近基序(PAM)和CRISPR RNA(crRNA)以及转基因组成，其中编码的核酸的顺序包括PAM、gRNA和转基因，并且其中当使用2个PAM和gRNA 时，编码的核酸的顺序包括第一PAM、第一gRNA、转基因、第二PAM和第二gRNA。

在一个方面中，本文公开了任何前述方面的质粒，其中该质粒的同源性臂或PAM与人的染色体19的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性杂交。

还公开了任何前述方面的质粒，其中该转基因包含编码肿瘤抗原的嵌合抗原受体的多核苷酸。

在一个方面中，本文公开了包含任何前述方面的质粒的腺相关病毒(AAV)载体(诸如，血清型AAV6的AAV载体)。在一个方面中，AAV可以是单链AAV或自互补AAV。

本文还公开了任何前述载体，其中该载体进一步包含编码gRNA(crispr RNA (crRNA)、示踪RNA(tracrRNA))和CAS核酸内切酶的质粒。

在一个方面中，本文公开了包含任何前述方面的质粒或载体的修饰的细胞。

本文还公开了治疗受试者的癌症的方法，包括向患有癌症的受试者施用任何前述方面的修饰的细胞。

在一个方面中，本文公开了通过同源定向修复对细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、 NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞，包括但不限于原代或扩增细胞)进行遗传修饰的方法，该方法包括：a)获得核糖核蛋白 (RNP)复合物和AAV载体，该复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2 类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该AAV载体包含质粒，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因侧接同源性臂，并且其中该同源性臂的长度为800bp或更短；和b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中，其中通过将腺相关病毒(AAV)感染到细胞中而将转基因引入到细胞中，其中该RNP复合物与该细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且该细胞的DNA修复酶将该转基因插入到该靶序列处的宿主基因组中(例如，通过同源修复)，从而产生修饰的细胞。在一些方面中，可以通过电穿孔将RNP复合物引入到细胞中。在一些方面中，可以在相同或不同的AAV 中通过病毒递送(即，双重感染)将RNP复合物引入到细胞中。

在一个方面中，本文公开了通过非同源末端连接对细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞，包括但不限于原代或扩增细胞)进行遗传修饰的方法，该方法包括a)获得核糖核蛋白 (RNP)复合物和AAV载体，该复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2 类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该AAV载体包含质粒，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因与一个PAM和crRNA相邻或侧接两个PAM和crRNA；和b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中，其中该转基因通过用腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到该细胞中，其中核糖核蛋白(RNP) 复合物与细胞的基因组DNA内的切割靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶将转基因插入到靶序列处的宿主基因组中(例如通过非同源末端连接)，从而产生修饰的细胞。

本文还公开了对任何前述方面的细胞进行遗传修饰的方法，其中在感染和/或电穿孔之前，在IL-2和/或经辐照的饲养细胞的存在下将原代细胞孵育4天。

本文还公开了对任何前述方面的细胞进行遗传修饰的方法，进一步包括在感染和/或电穿孔之后，用经辐照的表达mbIL-21的饲养细胞扩增修饰的细胞。

附图说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并与描述一起示出了所公开的组合物和方法。

图1示出了使用AAV载体用于递送CRISPR/Cas9和转基因的CRISPR/Cas 9复合物的示意图。该示意图详细说明了CRISPR/Cas9系统在通过同源性定向修复整合转基因中的作用，示出了染色体19上的AAVS1靶位点，并提供了同源性臂为30、300、500或 800bp的供体质粒的详情。

图2示出了含CRISPR/Cas9的质粒的示意图。

图3A和3B示出了用于非同源末端连接方法的转基因的质粒的示意图，诸如HITI 或CRISPaint(在本文中被称为质粒9和10(3B))，其具有单个PAM crRNA，以及质粒11和12(3A)，其添加了第二PAM crRNA。应当注意，该图示出了gRNA，据了解 gRNA包含PAM和crRNA。

图4A和4B示出了用于转染NK细胞的AAV血清型的测定。图4A示出了在不同转染条件下各种AAV血清型的GFP的表达。图4B示出了NK细胞中AAV 6基因组DNA 的拷贝数。

图5A、5B和5C示出了使用PCR评估mCherry报告基因整合到HEK293细胞的 AAVS1基因座中(5A)。示出了用于扩增mCherry1(正向引物为SEQ ID NO:2，反向引物为SE QID NO:3)和mCherry2(正向引物为SEQ ID NO:4，反向引物为SE QID NO: 5)的正向引物和反向引物。此外，使用流式细胞术(5B)和荧光显微镜检查(5C)研究了mCherry的稳定基因表达。*这些结果代表了12个设计的AAV构建体中的2个。所使用的gRNA：GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO:1)。

图6A和6B示出了使用PCR(6A)评估mCherry报告基因整合到人原代NK细胞的AAVS1基因座中。使用流式细胞术(6B)研究了mCherry扩增后的稳定基因表达。*这些结果代表了12个设计的AAV构建体中的2个。

图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G和7H示出了包含质粒1、2、3、4、5、6、7和 8的mCherry转基因的示意图，显示左同源性臂(LHA)、剪接受体、转基因、多聚腺苷酸化终止子和右同源性臂(RHA)的相对位置；以及整个构建体的相应序列。图7A 和7B示出了30bp同源性臂质粒1和2的示意图和序列(SEQ ID NO:13)。图7C和7D 示出了300bp同源性臂质粒3和4的示意图和序列(SEQ ID NO:14)。图7E和7F示出了500bp同源性臂质粒5和6的示意图和序列(SEQ ID NO:15)。图7G和7H示出了包含800bp LHA和1000bp RHA的800bp同源性臂质粒7和8的示意图和序列(SEQ ID NO:16)。

图8示出了NK分离和扩增的方案。从健康供体的血沉棕黄层中分离出原代人NK 细胞，并且使用mbIL21 K562扩增7天。

图9示出了分离的NK细胞的流式细胞术结果，显示NK细胞的纯度。通过CD3和 CD56的染色评估从血沉棕黄层分离的细胞的T细胞污染。根据流式细胞术结果，分离的淋巴细胞＞90％CD3-阴性，CD56-阳性。

图10示出了ATAC-seq分析显示NK细胞中的AAVS1具有合适的基因插入的染色质可及性(chromatin accessibility)。ATAC-序列峰代表开放染色质区域。数据显示，在原始和扩增第7天的NK细胞中，AAVS1具有相似的染色质可及性。

图11示出了靶向人原代NK细胞中目的基因的Cas9/RNP的产生和电穿孔。为了制作gRNA，将预转录的crRNA和示踪RNA在95℃下退火5分钟。然后在室温下将预翻译的Cas9核酸内切酶蛋白与gRNA混合10分钟。将Cas9/RNP和电穿孔增强剂添加到 NK细胞中。然后将混合物转移至Lonza4D核感染比色皿中。使用Lonza 4D采用EN-138 程序对细胞进行电穿孔。

图12示出了ICE分析，显示使用Cas9/RNP在NK细胞中成功的基因(AAVS1)靶向。ICE使用桑格测序数据对CRISPR编辑进行定量分析。使用这种方法，我们发现超过85％的NK细胞成功靶向AAVS1基因座。

图13示出了敲除AAVS1不会改变NK细胞的细胞毒性。钙黄绿素-AM细胞毒性测定显示，AAVS1-KO和野生型NK细胞对AML细胞系的NK细胞介导的杀伤没有差异。这证明了在NK细胞中靶向AAVS1基因座的安全性。

图14示出了鉴定AAV的最佳血清型以转导人原代NK细胞。在4种不同血清型的AAV中，只有用AAV6转导的NK细胞显示GFP的表达(上图)。在300K的MOI下 NK细胞转导48小时后可以检测到AAV6病毒基因组(下图)。

图15示出了HR指导的基因插入需要HA的最佳长度。非同源物末端连接(NHEJ) DNA修复机制在Cas9 DSB后被激活，其导致基因敲除。同源性修复(HR)DNA修复机制是在存在具有Cas9靶向位点(AAVS1)的最佳同源性臂的DNA模板的情况下其激活导致基因插入的途径。我们为左侧HA设计了30bp、300bp、500bp和800bp的HA，为右侧HA设计了30bp、300bp、500bp和1000bp。HR模板在ssAAV6或scAAV6载体的ITR中克隆。

图16A和16B示出了通过CRISPaint方法的基因整合不需要HA用于Cas9靶向位点的侧接区域。对于通过CRISPaint方法进行的非同源物基因插入(图15A)，在ITR中包括单(PAMg)或双(PAMgPAMg)AAVS1靶向位点(crRNA PAM序列)。CRISPaint 有助于克服设计用于HR基因插入的HA的耗时过程(图15B)。

图17示出了流式细胞术结果，显示在HEK293细胞中的成功的转基因表达。将1μg 编码DNA的mCherry电穿孔到HEK293细胞中以测定载体的准确性显示了成功的基因表达。流式细胞术显示mCherry的稳定表达。

图18示出了在原始和扩增NK细胞中研究HR和CRISPaint调节酶的表达水平。与原始NK细胞相比，扩增第7天的NK细胞中HR相关酶被上调。在原始NK细胞和扩增 NK细胞之间的非同源物相关酶LIG4没有差异。这一数据表明，扩增第7天的NK细胞具有用于电穿孔和用AAV6转导的潜在最佳条件，用于通过HR和CRISPaint的定向基因插入。

图19示出了Cas9/RNP的电穿孔和用于基因插入的AAV6转导的组合。使用500K、 300K或150K MOI的递送编码DNA的mCherry的HR和CRISPaint病毒的ssAAV6或 scAAV6来转导用Cas9/RNP电穿孔的扩增第7天的NK细胞。

图20示出了流式细胞术结果，显示了在CRISPR修饰的NK细胞中稳定的mCherry 表达，该修饰的NK细胞以AAV6的较高MOI转导。在用500K MOI或300K MOI的递送HR-800bp的ssAAV或递送CRISPaint PAMgPAMg的scAAV转导的细胞之间，我们没有看到mCherry阳性NK细胞的百分比的任何显著差异。因此，对于剩下的实验，我们使用了300K MOI和150K MOI的AAV6。

图21示出了CRIPSR修饰的原代NK细胞的流式细胞术结果，展示了高效转基因表达。我们用Cas9/RNP电穿孔NK细胞，并用300K MOI或150K MOI的ssAAV或递送HR的scAAV6或CRISPaint DNA模板进行转导。CRISPR修饰后六天，流式细胞术结果显示，使用scAAV6以300bp的最小最佳同源性臂长度针对Cas9靶向位点的侧接区域递送编码mCherry的DNA，在原代NK细胞中导致高效的基因插入。较大的HA(包括500bp 和较小转基因的800-1000bp)也可以用于将基因插入NK细胞中。我们还表明，对于大的转基因，30bp的HA也可以用于基因插入。此外，我们证明CRISPaint是一种用于将基因插入人原代NK细胞中的有效方法。

图22示出了mCherry阳性NK细胞可以在表达mb-IL21的饲养细胞上扩增。用 ssAAV6-HR-800bp和scAAV6-CRISPaint-PAMgPAMg产生的并且具有较低的效率的 mCherry NK细胞使用饲养细胞进行FACS分选并生长20天。分选后20天的流式细胞术结果显示，在通过HR和CRISPaint产生的CRISPR修饰的NK细胞中稳定且富集的 mCherry表达。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有说明，否则它们不限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或者除非另有说明，否则它们不限于特定的试剂，同样地它们当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是旨在限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数指代物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“药物载体”包括两种或更多种此类载体的混合物等。

范围在本文中可以被表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。在表述这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应理解，特定值构成另一实施例。将进一步理解的是，每个范围的端点相对于另一个端点是显著的，并且独立于另一个端点。还应当理解，存在本文公开的多个值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，则“约10”也被公开。还应当理解，当公开值时，还公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的。例如，如果值“10”被公开，则“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定的数据点“10”和特定的数据点15，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及在10与15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，其将被定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括事件或情况发生的例子和不发生的例子。

“引物”是探针的子集，该探针能够支持某一类型的酶促操作，并且可以与靶核酸杂交，使得酶促操作可以发生。引物可以由本领域中可获得的不干扰酶促操作的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。

“探针”是能够与靶核酸相互作用的分子，通常以序列特异性方式，例如通过杂交相互作用。核酸的杂交在本领域中是熟知的，并在本文中进行讨论。通常，探针可以由本领域中可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。

“编码”特定RNA的DNA序列是被转录成RNA的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可以编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)(因此DNA和mRNA都编码蛋白质)，或者DNA多核苷酸可以编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如，tRNA、rRNA、microRNA (miRNA)、“非编码”RNA(ncRNA)、向导RNA等))。

“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是一种核酸序列，当被置于适当调控序列的控制之下时，该核酸序列被转录成mRNA(在DNA的情况下)并在体外或体内被翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由5’末端(N末端)处的起始密码子和3’末端(C末端)处的翻译终止无义密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及合成的核酸。转录终止序列通常将位于编码序列的3’末端。

如本文中用于核酸、多肽、细胞或生物体的术语“天然存在的”或“未修饰的”或“野生型”是指在自然界中发现的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，存在于生物体(包括病毒) 中的多肽或多核苷酸序列是野生型的(并且是天然存在的)，该生物体可以从自然界中的来源分离并且没有被人在实验室中有意地修饰。

向受试者“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、由皮、经皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病变内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的储器、肠胃外(例如皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病变内和颅内注射或输注技术)等。如本文所使用的“共同施用(Concurrent administration)”、“联合施用(administration in combination)”、“同时施用(simultaneous administration)”或“同时施用(administered simultaneously)”是指化合物在相同的时间点施用或基本上紧随其后施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在相同时间点施用化合物时获得的结果无法区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如大于身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送至受试者。相比之下，“局部施用”是指通过将药剂引入或递送至紧邻施用点的一个或多个区域且不全身性地引入治疗有效量的药剂的途径将药剂引入或递送至受试者。例如，局部施用的药剂在施用点的局部附近很容易检测到，但在受试者身体的远端部分中检测不到或检测到的量可以忽略。施用包括自我施用和由其他人施用。

药剂的“有效量”是指足以提供所需效果的药剂的量。药剂的“有效”的量因受试者而异，取决于许多因素，诸如受试者的年龄和一般状况、特定的一种或多种药剂等。因此，并不总是可以指定量化的“有效量”。然而，在任何受试者的情况下，合适的“有效”量可由本领域普通技术人员通过常规实验确定。此外，如本文所使用的，并且除非另有特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效果所必需的药剂的“有效量”可以根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可以调整剂量方案，以提供最佳的治疗效果。例如，可以每天施用几个分剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少剂量。

“药学上可接受的”组分可以指不是生物学上或以其他方式不期望的组分，即该组分可以并入本发明的药物制剂中并且如本文所述施用于受试者，但不会引起显著的不期望的生物学效应或以有害方式与包含它的制剂的任何其他组分相互作用。当用于人体施用时，该术语通常意味着该组分已经符合毒理学和制造测试的要求标准，或被包含在由美国食品和药品管理局编写的“非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)”中。

“药学上可接受的载体”(有时被称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药物或治疗用途可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所使用的，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域中熟知的用于药物制剂并如本文进一步所述的其他材料。

如在“药理学活性的”衍生物或类似物中的“药理学活性的”(或简称为“活性的”)可以指衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)具有与母体化合物相同类型的药理活性并且在程度上近似相等。

“治疗剂”是指具有有益的生物学作用的任何组合物。有益的生物学作用包括治疗作用(例如，治疗障碍或其他不希望的生理状况)和预防作用(例如，预防障碍或其他不期望的生理状况(例如，非免疫原性癌症))。该术语还涵盖本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的药理学活性的衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，然后，或当具体地鉴定特定的药剂时，应理解，该术语包括药剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地实现所需的治疗结果的量。在一些实施例中，期望的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，期望的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。该术语还可以指有效地促进所需的治疗效果(例如疼痛减轻)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间的量)。精确的所需治疗效果将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中药剂的浓度等)以及本领域普通技术人员所理解的多种其他因素而变化。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间内向受试者施用多剂量的组合物之后实现所需的生物或医学应答。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开的全部内容据此通过引用并入到本申请中，以便更充分地描述本申请所属领域的现状。所公开的参考文献还单独地且具体地通过引用并入本文，用于在依赖该参考文献的句子中所讨论的包含在其中的材料。

B.质粒和遗传修饰细胞的方法

在一个方面中，本文公开了用于将供体转基因递送至细胞并将该转基因与CRISPR/Cas9结合整合入细胞中的质粒。

核酸内切酶/RNP(例如，Cas9/RNP)由三种组分构成，即与CRISPR基因座复合的重组核酸内切酶蛋白(例如，Cas9核酸内切酶)。与CRISPR基因座复合的核酸内切酶可以被称为CRISPR/Cas向导RNA。CRISPR基因座包含合成的单向导RNA(gRNA)，其由可以与靶序列复合互补重复RNA(crRNA)和反式互补重复RNA(tracrRNA)杂交的RNA组成。因此，CRISPR/Cas向导RNA与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是II型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是Cas9多肽，并且相应的CRISPR/Cas向导RNA是Cas9 向导RNA。与依赖外源DNA的方法相比，这些Cas9/RNPs能够以更高的效率切割基因组靶，因为它们以功能复合物的形式递送。此外，从细胞中快速清除Cas9/RNPs可以减少非靶效应，诸如凋亡的诱导。

为了制备RNP复合物，可以在95℃下在约50mM和约500mM之间(例如，50、60、 70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、35、375、400、 425、450、475或500mM)，优选地在100mM和约300mM之间，最优选地约200mM 以1:1、2:1或1:2的浓度比混合crRNA和tracrRNA，持续约5分钟，以形成crRNA:tracrRNA 复合物(即，向导RNA)。然后可以将crRNA:tracrRNA复合物与约20mM和约50mM 之间(例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mM)的Cas核酸内切酶 (诸如例如Cas9)的最终稀释物混合。

一旦与靶细胞中的靶序列结合，CRISPR基因座就可以通过向靶DNA中引入一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如，供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位或其组合来修饰基因组。因此，当与DNA结合用于同源重组时，所公开的方法可以用于产生敲除或敲入。在本文中显示，通过腺相关病毒(AAV)转导Cas9/RNP是一种容易且相对有效的方法，其克服了细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)中遗传修饰的先前限制。

CRISPR/Cas9系统最近已经被证明有助于在同源重组(HR)期间使用腺相关病毒 (AAV)载体作为供体模板DNA进行高水平的精确基因组编辑。然而，AAV以前的应用受到限制，因为由于其免疫功能，NK细胞对病毒和细菌载体具有抗性而通过该载体诱导NK细胞凋亡。因此，在本方法之前，对NK细胞进行CRISPR/Cas修饰是不成功的。此外，约4.5千碱基的最大AAV包装容量限制了包含同源性臂的供体大小。建议任何高于100bp的转录物和任何转基因都应具有每个臂至少800bp的同源性臂，其中许多系统采用800bp和1000bp的不对称臂，总计1800bp。因此，AAV载体不能递送大于约2.5kb 的转基因。在一个方面中，如表1所示，本文公开了AAV CRISPR/CAS9核苷酸递送系统，其包含具有在30bp与1000bp之间的同源性臂的供体构建体质粒，包括但不限于30、 50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、 250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、 410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、 570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、 730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000bp。例如，同源性臂可以是如在质粒1和2中的对称30bp同源性臂(图7A和7B)，如在质粒3和4中的对称300bp同源性臂(图7C和7D)，如在质粒5和6中的对称500bp同源性臂(图7E 和7F)，或者如在质粒7和8中的不对称的800bp同源性臂，其包含800bp的左同源性臂(LHA)和1000bp的右同源性臂(RHA)(图7G和7H)，用于同源重组(HR)，或者完全没有同源性臂(质粒9、10、11和12)，用于使用同源性无关的靶向整合(HITI) 质粒的非同源末端连接。质粒1、2、3、4、5和6相对于任何先前存在的质粒的优势在于不仅能够用于插入，而且还能够用于大的转录物。质粒1、2、3、4、5和6也可以用于任何细胞类型，并且具有临床批准的剪接受体(SA)(SEQ ID NO:10)和临床批准的聚腺苷酸化终止子(PA)(诸如例如BGH聚A终止子SEQ ID NOL 11)。质粒7和8 具有临床批准的剪接受体(SA)和临床批准的聚腺苷酸化终止子(PA)。应该理解并且在本文中预期同源性臂可以是对称的(在每侧上长度相同)或者不对称的(在每侧上长度不同)，以适应不同的转基因长度。也就是说，同源性臂的长度可以具有左同源性臂 (LHA)长度和右同源性臂(RHA)长度的任意组合，包括但不限于LHA 30bp(SEQ ID NO:2)和RHA 30bp(SEQ ID NO:1)、LHA 30bp和RHA 100bp、LHA 30bp和RHA 300bp (SEQ ID NO:3)、LHA 30bp和RHA 500bp(SEQ ID NO:5)、LHA 30bp和RHA 800bp (在质粒7和8中实际上为1000bps；SEQ ID NO:7)、LHA 30bp和RHA 1000bp、LHA 100bp和RHA 30bp、LHA 100bp和RHA 100bp、LHA 100bp和RHA 300bp、LHA 100bp 和RHA 500bp、LHA 100bp和RHA 800bp、LHA 100bp和RHA 1000bp、LHA 300bp(SEQ ID NO:4)和RHA 30bp、LHA 300bp和RHA 100bp、LHA 300bp和RHA 300bp、LHA 300bp 和RHA 500bp、LHA 300bp和RHA 800bp、LHA 300bp和RHA 1000bp、LHA 500bp(SEQ ID NO:6)和RHA 30bp、LHA 500bp和RHA 100bp、LHA 500bp和RHA 300bp、LHA 500bp 和RHA 500bp、LHA 500bp和RHA 800bp、LHA 500bp和RHA 1000bp、LHA 800bp(SEQ ID NO:8)和RHA 30bp、LHA 800bp和RHA 100bp、LHA 800bp和RHA 300bp、LHA 800bp 和RHA 500bp、LHA 800bp和RHA 800bp、LHA 800bp和RHA 1000bp、LHA 1000bp和 RHA 30bp、LHA 1000bp和RHA 100bp、LHA 1000bp和RHA 300bp、LHA 1000bp和RHA 500bp、LHA 1000bp和RHA 800bp和LHA 1000bp和RHA 1000bp。

质粒9、10、11和12与质粒1-8或本领域中描述的任何质粒显著不同。这些质粒具有相同的临床批准的SA和PA，并且可用于任何细胞类型，但不通过同源定向修复(HDR) 整合，而是经HITI、CRISPaint或其他非同源末端连接(NHEJ)整合。因此，它们的优势在于整合效率较高。为了帮助鉴定切割位点以去除用于整合的转基因，质粒包含前间区序列邻近基序(PAM)和crRNA(即gRNA(SEQ ID NO:9))以靶向供体转基因整合。质粒11和12包含两个PAM序列，以增加Cas9靶向供体转基因质粒上的至少一个位点的可能性。

如表1所示，同源性臂的变化都可以显著地影响整合供体转基因的能力，无论质粒是单链的还是自互补的。

表1：如由同源性臂长度、插入方案和转基因构建所定义的本文公开的12种新质粒的差异

SS＝单链的(4.5kb的总构建体长度)

SC＝自互补的(2.5kb的总构建体长度)

此外，尽管使用单链(SS)质粒插入较大的转基因是有益的，但SS质粒在整合前需要更长的时间折叠并在细胞内作为双链DNA，这增加了一些细胞(诸如例如T细胞、B 细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和 /或肌肉细胞)中的DNA传感机制和细胞毒性。由于使用了自互补(SC)(双链)构建体以便减少细胞中暴露于外源DNA的时间，通过质粒2、4、6、8、10和12克服了此问题。目前公开的质粒。

应当理解并且在本文中预期，为了将Cas9核酸酶活性靶向到靶位点并且还切割供体质粒以允许供体转基因重组到宿主DNA中，使用了crispr RNA(crRNA)。在一些情况下，crRNA与tracrRNA结合以形成向导RNA(gRNA)。所公开的质粒使用AAV整合，即蛋白磷酸酶1的内含子1，人19号染色体上的调节亚基12C(PPP1R12C)基因(其被称为AAVS1)作为用于整合转基因的靶位点。这一基因座是“安全港基因”，并且允许在许多细胞类型中稳定、长期的转基因表达。由于PPP1R12C的破坏与任何已知的疾病无关，因此通常认为AAVS1基因座是转基因靶向的安全港。因为AAVS1位点用作靶位置，所以CRSPR RNA(crRNA)必须靶向该DNA。在本文中，在所公开的质粒中使用的向导RNA包括GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO:1)或其任何10个核苷酸的有义或反义邻接片段。虽然在本文中将AAVS1用于示例性的目的，但应理解和在本文中预期，考虑到被转染的特定细胞类型或转基因，可以使用其他“安全港基因”并具有等同的结果，并且如果更合适的话，可以替代AAVS1。其他安全港基因的示例包括但不限于 5型C-C趋化因子受体(CCR5)、ROSA26基因座和TRAC。

如上所述，将使用AAV作为载体来递送所公开的CRISPR/Cas9质粒和任何供体转基因限制为最大约4.5kb。应当理解并且在本文中预期，增加转基因的允许大小的一种方法是通过交换通常用于合成的Cas9的化脓性链球菌的Cas9(SpCas9)或者来自不同细菌来源的Cas9来产生额外的空间。Cas9的替代也可以用于增加靶向特异性，因此需要使用较少的gRNA。因此，例如，Cas9可以来源于金黄色葡萄球菌(SaCas9)，氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)(AsCpf1)、毛螺旋菌(Lachnospiracase bacterium)(LbCpf1)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(NmCas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(StCas9)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、增强型SpCas9 (eSpCas9)、SpCas9-HF1、Fokl融合的dCas9、扩增的Cas9(xCas9)和/或催化死亡的 Cas9(dCas9)。

可以理解并且在本文中预期，特定Cas9的使用可以改变Cas9核酸内切酶(或替代酶)用来筛选靶的PAM序列。如本文所使用的，合适的PAM序列包括NGG(SpCas9 PAM) NNGRRT(SaCas9 PAM)NNNNGATT(NmCAs9 PAM)、NNNNRYAC(CjCas9 PAM)、 NNAGAAW(St)、TTTV(LbCpf1 PAM和AsCpf1 PAM)；TYCV(LbCpf1 PAM变体和AsCpf1 PAM变体)，其中N可以是任何核苷酸；V＝A、C或G；Y＝C或T；W＝A或 T；并且R＝A或G。

在一个方面中，本文公开了对细胞进行遗传修饰的方法，包括获得核糖核蛋白(RNP) 复合物和质粒，该核糖核蛋白(RNP)复合物包含与细胞中靶DNA序列特异性的相应 CRISPR/Cas向导RNA(gRNA)复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因侧接同源性臂；和b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中，其中该转基因通过用腺相关病毒(AAV) 感染到靶细胞中而被引入到该细胞中，其中该RNP复合物与该细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。在一个方面中，该方法可以进一步包括通过电穿孔将RNP复合物引入到细胞中(诸如当修饰NK细胞时)。在一个方面中，该方法可以进一步包括用包含RNP复合物的第二AAV病毒对靶细胞进行重叠感染。在一个方面中，当转基因足够小时，相同的AAV可以包含转基因和RNP复合物。在另一个方面中，转基因和RNP复合物可以编码在相同的质粒上。

应当理解并且在本文中预期，所公开的方法可以用于任何细胞类型，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞以及任何其他细胞类型。人NK细胞是用于所公开的质粒及其使用方法的特别优秀的靶。NK细胞是外周血淋巴细胞的子集，其由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失来定义。NK细胞感测并杀死缺乏主要组织相容性复合物(MHC)-I 类分子的靶细胞。NK细胞激活受体包括天然细胞毒性受体(NKp30、NKp44和NKp46)，以及凝集素样受体NKG2D和DNAM-1以及其他。它们的配体在应激的、转化的或感染的细胞上表达，但在正常细胞上不表达，使正常细胞对NK细胞杀伤产生抗性。NK细胞激活经抑制性受体(诸如杀伤免疫球蛋白(Ig)样受体(KIR)、NKG2A/CD94、TGF 和白细胞Ig样受体-1(LIR-1))被负调控。在一个方面中，靶细胞可以是来自供体来源 (诸如例如，用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即修饰的细胞的最终受体))的原代NK细胞，NK细胞系(包括但不限于NK RPMI8866；HFWT、K562 和EBV-LCL)，或来自从来源于原代NK细胞源或NK细胞系的扩增的NK细胞源。

在转导细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)之前，可以在适合于细胞增殖的培养基中孵育细胞。应当理解并且在本文中预期，培养条件可以包括添加细胞因子、抗体和/或饲养细胞。因此，在一个方面中，本文公开了遗传修饰细胞(诸如例如，T细胞、 B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)的方法，进一步包括在支持细胞增殖的培养基中转导细胞之前将细胞孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，其中该培养基进一步包含细胞因子、抗体和/或饲养细胞。例如，培养基可以包含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。在一个方面中，培养基还可以包含抗CD3抗体。在一个方面中，饲养细胞可以从刺激细胞的饲养细胞中纯化。例如，本文公开的用于所要求保护的发明的NK细胞刺激饲养细胞可以是经辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(PBMC)或未辐照的自体或PBMC； RPMI8866；HFWT、K562；用膜结合的IL-15和41BBL或IL-21或其任意组合转染的 K562细胞；或EBV-LCL。在一些方面中，饲养细胞与IL-21、IL-15和/或41BBL的溶液组合提供。饲养细胞可以1:2、1:1或2:1的比率接种到细胞的培养物中。应当理解并且在本文中预期，培养期可以是AAV感染后1至14天(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13或14天)，优选地3至7天，最优选地4至6天。

应当理解并且在本文中预期，原代细胞和扩增细胞(包括但不限于原代和扩增T细胞、NK细胞或B细胞)的孵育条件可以不同。在一个方面中，在AAV感染之前的原代 NK细胞的培养包括少于5天(例如1、2、3或4天)的培养基和细胞因子(诸如例如， IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21)和/或抗CD3抗体。对于扩增NK细胞，除了或代替细胞因子(诸如例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21)和/或抗CD3抗体，培养可以在NK饲养细胞的存在下进行(例如，以1:1的比率)。扩增NK细胞的培养可以在转导前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天进行。因此，在一个方面中，本文公开了遗传修饰细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、神经元细胞、成骨细胞、肝细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)的方法，包括在用AAV载体感染和/或电穿孔(当通过电穿孔引入RNP复合物时)之前在IL-2的存在下孵育原代细胞4 天，或在用AAV感染和/或电穿孔(当通过电穿孔引入RNP复合物时)之前在经辐照的饲养细胞的存在下孵育扩增细胞4、5、6或7天。

在转导(例如，通过AAV感染或电穿孔)细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)后，现在修饰的细胞可以在包含刺激修饰的细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)的饲养细胞的培养基中增殖。因此，修饰的细胞保持生存力和增殖潜力，因为它们能够在AAV感染后和/或电穿孔后(当经电穿孔引入RNP复合物时)使用经辐照的饲养细胞扩增。例如，本文公开的用于所要求保护的发明的NK细胞刺激饲养细胞可以是经辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(PBMC)或未经辐照的自体或PBMC；RPMI8866；HFWT、K562；用膜结合的IL-15和41BBL或IL-21或其任意组合转染的 K562细胞；或EBV-LCL。在一些方面中，NK细胞饲养细胞与IL-21、IL-15和/或41BBL 的溶液组合提供。饲养细胞可以1:2、1:1或2:1的比率接种到NK细胞的培养物中。应当理解并且在本文中预期，培养期可以是感染和/或电穿孔后的1至14天(即，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)，优选地3至7天，最优选地4至6天。在一些方面中，用于培养修饰的NK细胞的培养基可以进一步包含细胞因子，诸如例如 IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。

在一个方面中，应当理解并且在本文中预期，所公开的质粒可以用于修饰可用于治疗癌症的细胞。近年来，肿瘤免疫疗法取得了进展；遗传修饰的嵌合抗原受体(CAR)T 细胞是在癌症免疫疗法中成功地部署的工程改造的免疫细胞的极好示例。这些细胞最近经FDA批准用于治疗CD19 B细胞恶性肿瘤，但迄今为止成功仅限于携带少数可靶向抗原的疾病，并且靶向此类有限的抗原库容易因免疫逃逸而失败。此外，由于同种异体T 细胞导致的移植物抗宿主病的风险，CAR T细胞一直专注于使用自体T细胞。相比之下， NK细胞能够以不依赖抗原的方式杀伤肿瘤靶，并且不会导致GvHD，这使它们成为癌症免疫疗法的良好候选者。应当理解并且在本文中预期，所公开的质粒和方法可以用于产生CAR T细胞和CAR NK细胞，以将T细胞和/或NK细胞靶向癌症。

如本文所使用的，“嵌合抗原受体”是指靶向癌抗原并使表达该受体的细胞与表达该靶抗原的癌细胞结合的嵌合受体。通常，CAR包含肿瘤抗原的天然配体、识别源自由 MHC分子呈递的肿瘤抗原的肽的分子、或在CAR细胞的表面上表达的靶向癌症抗原的抗体或其片段(诸如例如，Fab’、scFv、Fv)。受体经接头与信号传导结构域(诸如例如，用于T细胞的CD3ζ结构域和用于NK细胞的NKG2C、NKp44或CD3ζ结构域) 融合。肿瘤抗原靶是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答的蛋白质，尤其是B细胞、NK细胞和T细胞介导的免疫应答。抗原结合结构域的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原在本领域中是熟知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、 EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS-1、MUC1、BCMA、 bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、细胞周期蛋白Bl、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、 RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、聚唾液酸、PLAC1、RUl、RU2(AS)、肠羧基酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、前列腺酶、前列腺特异性抗原、(PSA)、 PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、 gplOO、前列腺素、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、 HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、存活蛋白和端粒酶、豆荚蛋白、HPV E6、E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌肿瘤抗原-1、(PCTA-1)、ML-IAP、 MAGE、MAGE-A1,MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、 ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受体、GD2、O-乙酰基-GD2、 GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、 Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。肿瘤抗原的非限制性示例包括以下：分化抗原诸如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过表达的胚胎抗原，诸如CEA；过表达的癌基因和突变的抑癌基因，诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位引起的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、 MYL-RAR；和病毒抗原，诸如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、 RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、IL13Ra2、CA 19-9、 CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、 5T4、791Tgp72、α-胎甲球蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\\CA 27.29\\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\\P1、CO-029、FGF-5、G250、 Ga733\\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、 RCASl、SDCCAG1 6、TA-90\\Mac-2结合蛋白\\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、 TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、 L1CAM、IL6和MET。

在一个方面中，应当理解并且在本文中预期，所公开的遗传修饰细胞的方法的一个目标是产生修饰的细胞。因此，本文公开了通过所公开的方法制备的修饰的T细胞、B 细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和 /或肌肉细胞。

如在整个本公开中所指出的，所公开的修饰的NK细胞理想地适用于免疫疗法，诸如将修饰的(即工程改造的NK细胞过继转移至需要其的受试者。因此，在一个方面中，本文公开了将工程改造的细胞过继转移至需要其的受试者的方法，该方法包括a)获得待修饰的靶细胞(诸如例如,T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)；b)获得核糖核蛋白(RNP)复合物和 AAV载体，该复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，该包含质粒，该质粒包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)，其中该转基因侧接同源性臂，并且其中同源性臂小于800bp；c)将转基因和 RNP复合物引入到细胞中，其中该转基因通过用腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到该细胞中，其中该RNP复合物与该细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且该细胞的DNA修复酶在该靶细胞的基因组DNA内的该靶序列处将该转基因插入到该宿主基因组中(例如，通过同源修复)，从而产生工程改造的细胞(诸如例如，T细胞、B 细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和 /或肌肉细胞)；以及d)将工程改造的细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、 NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)转移至受试者中。在一个方面中，转基因可以被包含在与Cas9核酸内切酶相同的质粒上，或者被编码在相同或不同AAV载体中的第二质粒上。在一个方面中，在用包含AAV的转基因感染细胞之前或同时，可以经电穿孔用RNP复合物转导靶细胞。

在一个方面中，在所公开的免疫疗法方法中使用的修饰的细胞(诸如例如，修饰的T 细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)可以是来自供体来源(诸如例如，用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即，修饰的细胞的最终受体))、细胞系(包括但不限于NK 细胞系NK RPMI8866；HFWT、K562和EBV-LCL)的原代细胞，或来自来源于原代细胞来源或细胞系的扩增细胞来源。因为可以使用原代细胞，所以应当理解并且在本文中预期所公开的，细胞的修饰可以离体或体外发生。

在细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)转导之后，可以在将修饰的(即工程改造的)细胞施用于受试者之前对修饰的细胞进行扩增和刺激。例如，本文公开了将免疫细胞过继转移至需要其的受试者的方法，其中免疫细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIM)、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)、肿瘤浸润NK细胞(TINK)、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)在施用于受试者之前用经辐照的饲养细胞、质膜(PM) 颗粒或表达膜结合的IL-21(mbIL-21)的外泌体(EX)(PM颗粒和表达mbIL-21的EX 外泌体在本文中分别被称为PM21颗粒和EX21外泌体)扩增。在一些方面中，扩增可以进一步包括经辐照的饲养细胞、质膜(PM)颗粒或表达膜结合的IL-15(mbIL-15)和 /或膜结合的4-1BBL(mb4-1BBL)的外泌体。在一些方面中，应当理解并且在本文中预期，修饰的(即工程改造的)细胞的刺激和扩增可以在向受试者施用修饰的细胞之后或同时在体内发生。因此，本文公开了免疫疗法方法，其中在经施用具有mbIL-21的IL-21 或PM颗粒、具有mbIL-21的外泌体和/或经辐照的表达mbIL-21的饲养细胞将细胞转移至受试者之后，在受试者中使细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、 NK T细胞、TIL、MIL、TINK、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)扩增。在一些方面中，扩增进一步包括施用IL-15和/或4-1BBL或PM 颗粒、外泌体和/或表达膜结合的IL-15和/或4-1BBL的经辐照的饲养细胞。

应当理解并且在本文中预期，所公开的修饰的细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞，包括但不限于本文公开的CAR NK细胞和CAR T细胞)和修饰的细胞的过继转移方法可以是针对癌症的有效免疫疗法。所公开的方法和组合物可以用于治疗其中发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。不同类型的癌症的非限制性列表如下：淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高级别神经胶质瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、低氧性肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关淋巴瘤或肉瘤、转移性癌症或一般癌症。

所公开的组合物可以用于治疗的癌症的代表性但非限制性的列表如下：淋巴瘤、B 细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金病、髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、成神经细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口、喉、喉和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、上皮癌、肾癌、泌尿生殖系统癌、肺癌、食道癌、头颈癌、大肠癌、造血系统癌；睾丸癌；结肠癌、直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

如本文所使用的“治疗(treat\reating\reatment)”及其语法变体包括施用组合物，其意图或目的是部分地或完全预防、延迟、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高、稳定、缓和和/或降低一种或多种疾病或病症、疾病或病症的症状或疾病或病症的潜在原因的强度或频率。根据本发明的治疗可以预防地、预防性地、缓解性地或补救性地应用。在癌症的发作之前(例如，在癌症的明显体征之前)、在癌症的早期发作期间 (例如，在癌症的初始体征和症状时)或在癌症的既定发展之后向受试者施用预防性治疗。预防性施用可以在感染的症状出现前数天至数年进行。

1.杂交/选择性杂交

术语杂交通常是指至少两个核酸分子(诸如引物或探针)与基因之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间以核苷酸特异性方式发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen 面。两个核酸的杂交受本领域技术人员已知的许多条件和参数的影响。例如，反应的盐浓度、pH和温度都影响两个核酸分子是否将杂交。

两个核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员熟知的。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件可以被定义为严格的杂交条件。例如，杂交的严格性由杂交和洗涤步骤中的任一个或两者的温度和盐浓度控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可涉及在高离子强度溶液(6X SSC或6X SSPE)中在低于Tm(一半分子与其杂交配偶体解离的熔化温度)约12-25℃的温度下杂交，然后在所选择的温度和盐浓度的组合下洗涤，使得洗涤温度低于Tm约5℃至20℃。在初步实验中很容易根据经验确定温度和盐条件，其中将固定在过滤器上的参考DNA的样品与感兴趣的标记的核酸杂交，然后在不同严格性的条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交，杂交温度通常较高。这些条件可以如上所述用于实现严格性，或者如本领域中所已知的。DNA的优选的严格杂交条件：DNA杂交可以在约68℃下(在水溶液中)在6X SSC或6X SSPE中进行，然后在68℃下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格性可以随着所需的互补程度的降低而相应降低，并且进一步地，取决于寻找可变性的任何区域的G-C或A-T丰度。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格性可以随着所需的同源性的增加而相应地增加，并且进一步地，取决于其中需要高同源性的任何区域的G-C或A-T丰度，所有这些都是本领域已知的。

定义选择性杂交的另一种方法是通过观察一个核酸与另一个核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限制性核酸与非限制性核酸结合时。典型地，非限制性引物过量例如10或100或1000 倍。这种类型的测定可以在这样的条件下进行，其中限制性和非限制性引物都比它们的 kd低例如10倍或100倍或1000倍，或者其中只有一个核酸分子比它们的kd高10倍或 100倍或1000倍，或者其中一个或两个核酸分子都比它们的kd高。

定义选择性杂交的另一种方法是通过观察引物在需要杂交以促进所需的酶促操作的条件下被酶促操作的百分比。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件将是当至少约60％、 65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、100％的引物在促进酶促操作的条件下被酶促操作时，例如，如果酶促操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸。优选的条件还包括由制造商建议的或本领域指出的适合于进行操作的酶的条件。

正如同源性一样，应当理解，本文公开了多种方法用于测定两个核酸分子之间的杂交水平。应当理解，这些方法和条件可以提供两个核酸分子之间不同百分比的杂交，但是除非另有说明，否则满足任何方法的参数就足够了。例如，如果需要80％的杂交，并且只要杂交发生在这些方法中的任一种所需的参数内，则认为在本文中公开了该方法。

应当理解，本领域技术人员应理解，如果组合物或方法满足用于共同或单独地确定杂交的这些标准中的任何一个，则它是本文公开的组合物或方法。

2.核酸

存在多种本文公开的基于核酸的分子，包括例如编码例如TGFβR2的核酸，或本文公开的用于制备TGFβR2敲除的任何核酸，或其片段，以及多种功能性核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。本文讨论了这些和其他分子的非限制性示例。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常由A、C、 G和U构成。同样，应当理解，如果例如通过例如外源递送将反义分子引入到细胞或细胞环境中，则反义分子由减少反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物构成是有利的。

a)核苷酸和相关分子

核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通过其磷酸部分和糖部分连接在一起，形成核苷间连接。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性示例是3'-AMP(3'-腺苷一磷酸)或5'-GMP(5'-鸟苷一磷酸)。存在在本领域中可获得并且在本文中可获得的这些类型的分子的许多变体。

核苷酸类似物是对碱基、糖或磷酸部分进行某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域熟知的，并且包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及糖或磷酸部分的修饰。存在在本领域中可获得并且在本文中可获得的这些类型的分子的许多变体。

核苷酸替代物是具有与核苷酸相似的功能特性但不含磷酸部分的分子，诸如肽核酸 (PNA)。核苷酸替代物是将以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸但通过除了磷酸部分以外的部分连接在一起的分子。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。存在在本领域中可获得并且在本文中可获得的这些类型的分子的许多变体。

也可以将其他类型的分子(缀合物)与核苷酸或核苷酸类似物连接，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分。(Letsinger等人,《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》, 1989,86,6553-6556)。存在在本领域中可获得并且在本文中可获得的这些类型的分子的许多变体。

Watson-Crick相互作用是指与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick 面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置，以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。

Hoogsteen相互作用是指在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上发生的相互作用，该面被暴露在双链DNA大沟中。Hoogsteen面包括N7位和嘌呤核苷酸的C6位处的反应性基团(NH2或O)。

b)序列

存在与本文公开的信号传导通路中涉及的蛋白质分子相关的多种序列，例如 TGFβR2，其全部由核酸编码或者是核酸。可从各种蛋白质和基因数据库(包括Genbank) 中获得这些基因的人类类似物的序列，以及这些基因的其他同源物和等位基因，以及剪接变体和其他类型的变体。本领域技术人员理解如何解决序列差异和差别，以及如何将与特定序列相关的组成和方法调整为其他相关序列。给定本文公开的信息和本领域已知的信息，可以将引物和/或探针设计成用于任何给定的序列。

c)引物和探针

公开了包括引物和探针的组合物，其能够与所公开的核酸(诸如如本文公开的 TGFβR2和/或HPRT1)相互作用。在某些实施例中，引物用于支持DNA扩增反应。通常，引物将能够以序列特异性方式延伸。引物以序列特异性方式的延伸包括其中与引物杂交或以其他方式缔合的核酸分子的序列和/或组成指导或影响通过引物的延伸产生的产物的组成或序列的任何方法。因此，引物以序列特异性方式的延伸包括但不限于PCR、 DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。以序列特异性方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施例中，引物用于DNA扩增反应，诸如PCR或直接测序。应当理解，在某些实施例中，也可以使用非酶促技术延伸引物，其中例如，用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰，使得它们将以序列特异性的方式进行化学反应以延伸引物。通常，所公开的引物与所公开的核酸或核酸的区域杂交，或者它们与核酸的互补序列或核酸的区域的互补序列杂交。

在某些实施例中，用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持引物所需的酶促操作的任何大小，诸如DNA扩增或探针或引物的简单杂交。典型的引物或探针将为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、 550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、 2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。

在其他实施例中，引物或探针可以小于或等于6、7、8、9、10、11、12 13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、 325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。

用于TGFβR2和HPRT1基因的引物通常将用于产生扩增的DNA产物，该DNA产物包含TGFβR2和HPRT1基因或完整基因的区域。通常，典型地，产物的大小将使得可以精确地确定大小在3、或2或1个核苷酸之内。

在某些实施例中，这一产物为至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71,72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、 275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、 850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或 4000个核苷酸长。

在其他实施例中，产物小于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500 或4000个核苷酸长。

3.将组合物递送至细胞

存在许多可以用于在体外或体内将核酸递送至细胞的组合物和方法。这些方法和组合物可主要分为两类：基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如，可以通过许多直接递送系统(诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒)或者通过在细胞或载体(诸如阳离子脂质体)中转移遗传物质来递送核酸。合适的用于转染的手段，包括病毒载体、化学转染剂或物理机械方法诸如电穿孔和DNA的直接扩散，由例如Wolff,J.A等人,《科学(Science)》,247,1465-1468, (1990)；和Wolff,J.A.《自然(Nature)》,352,815-818,(1991)描述。此类方法在本领域中是熟知的，并且容易适用于本文所述的组合物和方法。在某些情况下，将对方法进行修改，以使其对大DNA分子具有特异性作用。此外，这些方法可以用于通过使用载体的靶向特性来靶向某些疾病和细胞群体。

a)基于核酸的递送系统

转移载体可以是用于将基因递送到细胞中的任何核苷酸构建体(例如，质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ram 等人,《癌症研究(Cancer Res.)》53:83-88,(1993))。

如本文所使用的，质粒或病毒载体是将所公开的核酸转运到细胞中而不降解的药剂，并且包括启动子，该启动子在其被递送进入的细胞中产生基因的表达。病毒载体是，例如，腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养性病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括这些具有HIV主链的病毒。还优选的是共享这些病毒的特性的任何病毒家族，这使得它们适合用作载体。逆转录病毒包括鼠马洛尼白血病病毒(Murine Maloney Leukemia virus)、MMLV和表达MMLV 作为载体的所需特性的逆转录病毒。逆转录病毒载体能够携带比其他病毒载体更大的遗传有效载荷，即转基因或标记基因，并且由于这一原因而成为常用的载体。然而，它们在非增殖细胞中没有那么有用。腺病毒载体相对稳定，易使用，具有高滴度，并且可以以气溶胶制剂递送且可以转染非分裂细胞。痘病毒载体很大，并且具有若干个用于插入基因的位点，它们是热稳定的，并且可以在室温下储存。优选的实施例是这样的病毒载体，其已被工程改造以便抑制由病毒抗原引发的宿主生物体的免疫应答。这种类型的优选的载体将携带白介素8或10的编码区。

与将基因引入到细胞中的化学或物理方法相比，病毒载体可以具有更高的转导能力(引入基因的能力)。通常，病毒载体含非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和封装所需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当作为载体进行工程改造时，病毒通常具有一个或多个被去除的早期基因，并且基因或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中以代替被去除的病毒DNA。这种类型的构建体可以携带高达约8kb的外源遗传物质。被去除的早期基因的必要功能通常由已经被工程改造从而反式表达早期基因的基因产物的细胞系提供。

(1)腺相关病毒载体

另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种有缺陷的细小病毒是一种优选的载体，因为它可以感染许多细胞类型并且对人是非致病的。AAV型载体可以转运约 4至5kb，并且已知野生型AAV稳定地插入染色体19(诸如例如，在AAV整合位点1 (AAVS1))。含这种位点特异性整合特性的载体是优选的。所使用的AAV可以来源于任何AAV血清型，包括但不限于AAC1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9和重组病毒(rAAV)，诸如例如AAV-Rh74和/或合成的AAV(诸如例如， AAV-DJ、Anc80)。可以根据细胞或组织的嗜性来选择AAV血清型。用于所公开的组合物和方法的AAV载体可以是单链的(SS)或自互补的(SC)。

在另一种类型的AAV病毒中，AAV包含一对反向末端重复序列(ITR)，其侧接至少一个含有启动子的盒，该启动子指导与异源基因可操作连接的细胞特异性表达。在此上下文中，异源的是指非AAV或B19细小病毒天然的任何核苷酸序列或基因。。

通常，已将AAV和B19编码区删除，从而产生安全的无细胞毒性的载体。AAV ITR 或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不赋予细胞毒性，并且启动子指导细胞特异性表达。

因此，所公开的载体提供了能够整合到哺乳动物染色体中而没有实质毒性的DNA分子。

病毒和逆转录病毒中的插入的基因通常包含启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子通常是一个或多个DNA序列，其当在相对于转录起始位点的相对固定位置时发挥作用。启动子包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和应答元件。

应当理解并且在本文中预期，AAV的包装能力是有限的。克服AAV载体的负载能力的一种方法是通过使用2个载体，其中转基因在两个质粒之间分裂，并且使用3’剪接供体和5’剪接受体将转基因的两个区段连接成单个全长转基因。可替代地，这两个转基因可以基本上重叠地制备，并且同源重组将这两个区段连接成全长转录物。

4.表达系统

递送至细胞的核酸通常包含表达控制系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中的插入的基因通常包含启动子和/或增强子，以帮助控制所需的基因产物的表达。启动子通常是一个或多个DNA序列，其当在相对于转录起始位点的相对固定位置时发挥作用。启动子包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和应答元件。

a)病毒启动子和增强子

优选的控制来自哺乳动物宿主细胞中的载体的转录的启动子可以从各种来源获得，例如病毒(诸如：多瘤、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选地巨细胞病毒)的基因组；或从异源哺乳动物启动子(例如，β肌动蛋白启动子)获得。SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段(其也包含SV40病毒复制起点)方便地获得(Fiers等人,《自然》,273:113(1978))。人巨细胞病毒的直接早期启动子可方便地作为HindIII E限制性片段方便地获得(Greenway,P.J等人,《基因(Gene)》18:355-360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子在本文中也是有用的。

增强子通常是指在距转录起始位点非固定距离处起作用的DNA序列，并且可以是在转录单位的5’(Laimins,L等人,《美国科学院院刊》78:993(1981))或3'(Lusky,M.L 等人,《分子细胞生物学(Mol.Cell Bio.)》3:1108(1983))。此外，增强子可以在内含子内(Banerji,J.L等人,《细胞(Cell)》33:729(1983))以及在编码序列本身内(Osborne, T.F等人,《分子细胞生物学》4:1293(1984))。它们的度长通常在10bp和300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子用于增加来自附近启动子的转录。增强子通常还包含介导转录的调节的应答元件。启动子还可以包含介导转录的调节的应答元件。增强子通常决定基因的表达的调节。虽然现在已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列，但通常将使用来自真核细胞病毒的增强子用于一般表达。优选的示例是在复制起点的晚期侧(late side)上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

启动子和/或增强子可以被光或触发其功能的特定化学事件特异性地激活。系统可以由诸如四环素和地塞米松等试剂调节。也存在通过暴露于辐照(诸如γ辐照)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达的方法。

在某些实施例中，启动子和/或增强子区域可以充当组成型启动子和/或增强子，以使待转录的转录单元的区域的表达最大化。在某些构建体中，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中是活性的，即使其在特定时间仅在特定类型的细胞中表达。这种类型的优选的启动子是CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTR。

已经表明，所有的特异性调节元件可以被克隆并用于构建在特定细胞类型(诸如黑色素瘤细胞)中选择性地表达的表达载体。胶质原纤维乙酸蛋白(GFAP)启动子已用于在胶质来源的细胞中选择性地表达基因。

在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可以包含终止转录所必需的序列，这可能会影响mRNA的表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中被转录为多聚腺苷酸化区段。3’非翻译区域也包括转录终止位点。优选的是，转录单元还包含聚腺苷酸化区域。这一区域的一个益处是它增加了转录的单元像mRNA一样将被加工和转运的可能性。表达构建体中多聚腺苷酸化信号的识别和使用已被很好地确立。优选的是，在转基因构建体中使用同源多聚腺苷酸化信号。在某些转录的单元中，多聚腺苷酸化区域来源于SV40早期多聚腺苷酸化信号，并且由约400个碱基组成。还优选的是，转录的单元包含单独的或与上述序列组合的其他标准序列，以改善来自构建体的表达或构建体的稳定性。

b)标记物

病毒载体可以包括编码标记物产物的核酸序列。这一标记物产物用于确定基因是否已经递送至细胞，并且一旦递送就表达基因。优选的标记物基因是编码β半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的大肠杆菌lacZ基因。

在一些实施例中，标记物可以是选择性标记物。用于哺乳动物细胞的合适的选择性标记物的示例是二脱氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当此类选择性标记物成功地转移至哺乳动物宿主细胞中时，如果被置于选择性压力下，则转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类基于细胞的代谢和缺乏独立于补充培养基生长能力的突变细胞系的使用。两个示例是：CHO DHFR细胞和小鼠LTK细胞。在不添加诸如胸腺嘧啶核苷或次黄嘌呤等营养物质的情况下，这些细胞将无法生长。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径所需的某些基因，因此除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的替代方案是将完整的DHFR或TK基因引入到缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长要求。未用DHFR或TK基因转化的单个细胞将不能在无补充培养基中存活。

第二类是显性选择，它是指在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞会表达一种具有耐药性的蛋白质，并且将在选择中存活下来。这种显性选择的示例使用药物新霉素(Southern P.和Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C. 和Berg,P.《科学》209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B等人,《分子细胞生物学》 5:410-413(1985))。这三个示例分别采用在真核控制下的细菌基因来表达对适当药物 G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的耐药性。其他包括新霉素类似物G418和普霉素。

5.肽

a)蛋白质变体

蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员众所周知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于三类中的一类或多类：取代型变体、插入型变体或缺失型变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合的插入小例如约一个至四个残基的插入。通过在体外交联或通过用编码融合物的DNA转化的重组细胞培养物融合大小足以赋予靶序列免疫原性的多肽来制备免疫原性融合蛋白衍生物，如在示例中描述的那些。缺失的特征在于从蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白质分子内的任一位点缺失不超过约2至6个残基。这些变体通常如下制备：对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变，从而产生编码该变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。在具有已知序列的DNA中的预定位点进行替换突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸替换通常是单个残基的替换，但可以一次出现在多个不同位置；插入通常约为约1至10个氨基酸残基；并且缺失范围约为1至30个残基。缺失或插入优选地在相邻对中进行，即缺失2个残基或插入2个残基。替换、缺失、插入或其任何组合可以组合以获得最终的构建体。突变不得将序列置于阅读框之外，并且优选不会产生可能产生二级mRNA结构的互补区域。替换变体是其中至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些。此类替换通常根据下表2和3进行，并且被称为保守替换。

表2：氨基酸缩写

表3：氨基酸取代

原始残基示例性保守取代，其他是本领域已知的

通过选择相较于表3中的那些不太保守性的取代，即选择在维持(a)取代的区域中多肽主链的结构(例如如薄片或螺旋构象)、(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c) 侧链的体积方面效果差异更显著的残基，来实现功能或免疫特性的实质性改变。通常预期在蛋白质性质中产生最大变化的取代将是这样的取代，即其中(a)亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)由疏水性残基(例如，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)取代(或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸由任何其他残基取代 (或被任何其他残基取代)；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)由负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)取代(或被其取代)；或(d) 在这种情况下，具有大的侧链的残基(例如苯丙氨酰基)由不具有侧链的残基(例如甘氨酸)取代(或被其取代)，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化的位点的数目。

例如，一个氨基酸残基由在生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸残基替代被本领域技术人员称为保守替换。例如，保守替换是将一个疏水残基替换为另一个，或将一个极性残基替换为另一个。该替换包括组合，诸如例如，Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、 Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。每个明确公开的序列的此类保守替换的变体包括在本文提供的嵌合多肽内。

可以采用替换或缺失诱变插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或 Thr)的位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可能是期望的。潜在蛋白水解位点(例如Arg)的缺失或取代例如通过缺失碱性残基之一或用谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基取代一个来实现。

某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对表达的多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常在翻译后脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬酰基残基。可替代地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的邻氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,《蛋白质：结构和分子性质(Proteins:Structure and Molecular Properties)》,W.H.Freeman&Co.,San Francisco第79-86页[1983])，N末端胺的乙酰化，以及在一些情况下C末端羧基的酰胺化。

应当理解，定义本文公开的蛋白质的变体和衍生物的一种方法是根据与具体已知序列的同源性/同一性来定义变体和衍生物。具体公开了与该序列具有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％同源性的本文公开的这些和其他蛋白质的变体。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，可以在比对两个序列使得同源性处于其最高水平后来计算同源性。

计算同源性的另一种方法可以通过已发表的算法来进行。可以通过Smith和 Waterman《应用数学的进展(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(J.MoL Biol.)》48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,《美国科学院院报》85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA，遗传学计算机组(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group),575,《科学》,Madison博士,WI)，或通过检查，对用于比较的序列进行优化比对。

可以通过例如在Zuker,M.《科学》,244:48-52,1989,Jaeger等人.《美国科学院院报》86:7706-7710,1989,Jaeger等人.《酶学方法(Methods Enzymol.)》183:281-306,1989 中公开的算法来获得核酸的相同类型的同源性。

应当理解，保守突变和同源性的描述可以以任何组合结合在一起，例如与特定序列具有至少70％同源性的实施例，其中变体是保守突变。

当本说明书讨论各种蛋白质和蛋白质序列时，应当理解也公开了可以编码这些蛋白质序列的核酸。这将包括与具体蛋白质序列有关的所有简并序列，即具有编码一个特定蛋白序列的序列的所有核酸以及编码该蛋白序列的所公开的变体和衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，尽管在本文中可能未写出每个特定的核酸序列，但应理解，实际上每个序列都是通过所公开的蛋白序列在本文中公开和描述的。还应当理解，虽然没有氨基酸序列表明在生物体中哪个特定的DNA序列编码该蛋白质，但在本文中公开了所公开的蛋白质的特定变体的情况下，编码该蛋白质的已知核酸序列也是已知的，并且在本文中公开和描述。

应当理解，存在许多可以并入所公开的组合物中的氨基酸和肽类似物。例如，存在许多D氨基酸或具有与表2和表3所示的氨基酸不同的功能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反的立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过向tRNA分子加载所选的氨基酸并且利用例如琥珀密码子(amber codon)的工程改造遗传构建体，可以容易地将这些氨基酸并入多肽链中，从而以位点特异性的方式将类似物氨基酸插入到肽链中。

可以产生类似肽的分子，但是这些分子不是通过天然肽链连接的。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的连接可以包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CHH2SO—(这些和其他可以在Spatola, A.F.《氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides,and Proteins)》,B.Weinstein编辑,Marcel Dekker，纽约,第267页(1983)；Spatola, A.F.,Vega Data(1983年3月),第1卷,第3期,《肽主链修饰(综述)(Peptide Backbone Modifications(general review))》；Morley,《药物科学趋势(Trends Pharm Sci)》(1980) 第463-468页；Hudson,D等人,《国际肽和蛋白质研究杂志(Int J Pept Prot Res)》 14:177-185(1979)(--CH2NH--、CH2CH2--)；Spatola等人,《生命科学(Life Sci)》 38:1243-1249(1986)(--CH H2--S)；Hann《化学学会珀金会刊(J.Chem.Soc Perkin Trans.)》 I 307-314(1982)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist等人,《药物化学杂志(J.Med. Chem.)》23:1392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White等人.《四面体通讯 (Tetrahedron Lett)》23:2533(1982)(--COCH2--)；Szelke等人.欧洲申请EP 45665 CA(1982):97:39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay等人.《四面体通讯》 24:4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；和Hruby《生命科学》,31:189-199(1982)(--CH2--S--) 中找到；其每一个通过引用并入本文。特别优选的非肽连接是--CH2NH--。应当理解，肽类似物可以在键原子之间具有多于一个的原子，诸如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。

氨基酸类似物和类似物以及肽类似物通常具有增强的或期望的性质，诸如生产更经济、化学稳定性更高、药理学性质(半衰期、吸收、效力、功效等)增强、特异性(例如，广谱的生物活性)改变、抗原性降低等。

D-氨基酸可以用于生成更稳定的肽，因为肽酶等不识别D-氨基酸。共有序列的一个或多个氨基酸由相同类型的D-氨基酸系统取代(例如，用D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化两种或更多种肽或者将两种或更多种肽连接在一起，从而可以有利地将肽限制在特定的构象中。

6.药物载体/药物产品的递送

如上所述，组合物也可以在药学上可接受的载体中体内施用。“药学上可接受的”意指不是生物学上或其他方面不期望的物质，即，该物质可以与核酸或载体一起施用于受试者，而不引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何其他组分相互作用。自然选择载体以最小化活性成分的任何降解并最小化受试者中的任何不良副作用，这是本领域技术人员众所周知的。

组合物可以口服、肠胃外(例如静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮、体外、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指将组合物通过一个或两个鼻孔递送到鼻和鼻部通道中，并且可以包括通过喷雾机构或液滴机构递送，或通过核酸或载体的雾化递送。通过吸入剂施用组合物可以经由喷雾或液滴机构递送而通过鼻或口。也可通过插管直接递送至呼吸系统的任何区域(例如，肺)。对于受试者来说，所需组合物的确切量将根据受试者的物种、年龄、体重和一般状况、正在治疗的变应性病症的严重性、所使用的特定核酸或载体、其施用模式等而不同。因此，不可能为每种组合物规定确切的量。然而，本领域普通技术人员根据本文的教导仅使用常规实验就可以确定合适的量。

如果使用的话，组合物的肠胃外施用通常以注射为特征。注射剂可以常规形式制备，或者作为液体溶液或悬浮液，适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者作为乳液。最近修订的胃肠外施用的方法包括使用缓慢释放系统或缓释系统，使得保持恒定的剂量。参见例如美国专利第3,610,795号，其通过引用并入本文。

材料可以处于溶液、悬浮液(例如，并入微粒中、脂质体或细胞中)。它们可以通过抗体、受体或受体配体靶向至特定的细胞类型。以下参考文献是使用这种技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人,《生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)》, 2:447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,60:275-281,(1989)； Bagshawe等人,《英国癌症杂志》,58:700-703,(1988)；Senter等人,《生物共轭化学》, 4:3-9,(1993)；Battelli等人,《癌症免疫现状(Cancer Immunol.Immunother.)》, 35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie,《免疫学评论(Immunolog.Reviews)》, 129:57-80,(1992)；和Roffler等人,《生化药理学(Biochem.Pharmacol)》, 42:2062-2065,(1991))。载体诸如“隐形的”和其他抗体缀合脂质体(包括脂质介导的靶向结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的DNA的受体介导的靶向、淋巴细胞导向的肿瘤靶向和体内鼠胶质瘤细胞的高度特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用这种技术使具体蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，《癌症研究(Cancer Research)》， 49:6214-6220,(1989)；和Litzinger和Huang，《生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)》,1104:179-187,(1992))。通常，受体参与组成型或配体诱导的胞吞途径。这些受体聚集在网格蛋白包被的小窝中，通过网格蛋白包被的小泡进入细胞，穿过酸化的内体，受体在内体中被分选，然后再循环到细胞表面，贮存在细胞内，或在溶酶体中降解。内化途径提供多种功能，诸如营养物摄取、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素机会性进入、配体解离和降解以及受体水平的调节。许多受体遵循多于一种的胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价和配体浓度。受体介导的胞吞作用的分子和细胞机制已有综述(Brown和Greene，《DNA和细胞生物学(DNA and Cell Biology)》10:6,399-409(1991))。

本文还提供了质粒，其依次包含左同源性臂、剪接受体、转基因和右同源性臂，其中该左同源性臂和右同源性臂的长度均为800bp或更小。

在一个方面中，本文提供了包含1或2个前间区序列邻近基序(PAM)和CRISPR RNA (crRNA)以及转基因或由其组成的质粒，其中编码的核酸的顺序包括PAM、crRNA和转基因；并且其中当使用2个PAM和crRNA时，编码的核酸包含第一PAM、第一crRNA、转基因、第二PAM和第二gRNA。

本文还提供了本发明的质粒、本发明的AAV载体或本发明的修饰的细胞用作药物。本发明进一步提供了本发明的质粒、本发明的AAV载体或本发明的修饰的细胞用于制备药物的用途。本发明还提供了本发明的质粒、本发明的AAV载体或本发明的修饰的细胞用于治疗癌症。本发明进一步提供了本发明的质粒、本发明的AAV载体或本发明的修饰的细胞用于制备用于治疗癌症的药物中的用途。

C.实例

提出以下实例为本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在单纯例示而非限制本公开。已经尽力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指明，否则份数为重量份数，温度是℃或处于环境温度，并且压力处于或接近大气压。

1.实例1

遗传修饰的嵌合抗原受体(CAR)T细胞是成功应用于癌症免疫疗法的工程改造的免疫细胞的优异的示例。最近FDA批准这些细胞用于治疗CD19 B细胞恶性肿瘤，但迄今为止成功的案例仅限于带有少数可靶向抗原的疾病。它也具有若干副作用，这就使NK 细胞成为更好的替代品。

本文公开了利用Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9/RNP)对原代和扩增的人细胞(包括 NK细胞)进行基因组编辑的无DNA技术(参见图1)。

已经表明，使用非致病性病毒的天然重组腺相关病毒(rAAV)供体载体的转基因递送能够通过同源性定向或不依赖同源性的靶向整合(HITI，CRISPaint)实现位点特异性基因插入(图3)。

来自不同血清型AAV质粒的基本序列被用于开发12种新型质粒，这些质粒与 Cas9/RNP结合使用(图2)，用于将目的基因定向整合到人类原代细胞(包括NK细胞和HEK293细胞)中。

在新方法中，在由我们的12个AAV质粒(单链或自互补)之一提供的所选DNA片段(表达CAR的DNA或报告基因)存在的情况下，Cas9 RNP复合物切割DNA(在AAVS1 基因座)，将外源基因插入到人NK细胞和HEK293细胞的基因组中作为证明，其中该质粒在靶DNA与位于Cas9切割位点两侧的供体DNA之间具有30-1000bp同源性臂，用于HDR导向的基因插入或同源性独立导向的插入(通过在DNA模板中提供crRNA PAM 序列)。

为了测试该系统，用AAV递送的CRISPR/Cas9质粒和包含转基因的质粒转染NK细胞。为了确定用于在NK细胞中感染的合适的AAV血清型，使用包含编码绿色荧光蛋白 (GFP)编码的质粒的各种AAV血清型在各种转染条件下感染NK细胞(图4A)。可以确定在任何培养条件下，AAV6始终提供最大的表达。此外，已经表明，AAV6的感染是短暂的，在3x10⁶的MOI后6小时具有约2.5x10⁷个拷贝的病毒，但在感染后48小时降至接近检测不到的水平(4B)。这一点尤其重要，因为它表明非靶感染的降低的风险。

然后用核糖核蛋白(RNP)复合物(包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2 类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9))电穿孔HEK293细胞，并用AAV编码和靶向AAVS1 基因座的mCherry转基因进行感染(图5)。使用带有用于mCherry1或mCherry2的引物的PCR，测试了mCherry在HEK293细胞中的整合(5A)。通过流式细胞术(5B)和显微镜检查(5C)证实了这些结果。

接下来使用人原代NK细胞重复实验(图6)，显示出相同的结果，其中使用具有 30bp同源性臂、500bp同源性臂或800bp同源性臂的质粒(6A)并通过流式细胞术(6B) 证实的在AAVS1基因座处具有稳定的表达。在表1中总结了所有质粒在整合各种大小构建体方面的成功案例。

2.实例2

由于稳健的外源DNA传感机制和RNA传感机制，使用病毒或非病毒载体对NK细胞进行基因修饰具有挑战性，因此限制了基因递送方法进入NK细胞的效率。为了克服这一限制，开发了一种用于将Cas9/核糖核蛋白复合物(Cas9/RNP)直接电穿孔到人原代 NK细胞中的新方法。这种方法在NK细胞的基因组中引入双链断裂(DSB)，从而实现成功的基因敲除和增强的抗肿瘤活性。得益于快速作用和清除，Cas9蛋白优于mRNA递送。在基因沉默的这种最初成功之后，进一步开发了用于基因插入的方法。在Cas9引入 DSB的作用后，可以利用两种独立的途径来修复损伤，被称为同源重组(HR)和不依赖同源性的修复。在存在编码目的基因的DNA模板的情况下，外源基因可以使用任一种修复机制被整合到Cas9靶向位点中。存在若干种提供此类DNA模板的方法，包括病毒和非病毒方法。在非病毒方法中，单链或双链DNA模板通常与Cas9/RNP一起被电穿孔。对于病毒基因递送，腺相关病毒(AAV)在临床试验中安全使用，并且可有效地用作敏感原代免疫细胞(包括T细胞)的载体。可以将通过AAV载体递送的转录物包装为长度为约4.7kb的线性单链(ss)DNA(ssAAV)或线性自互补(sc)DNA(scAAV)。scAAV包含突变的ITR，其有助于绕过第二链生成的限速步骤，用于将ssDNA转化为双链(ds)DNA。然而，因此，与ssAAV相比，scAAV仅具有一半的包装容量，因此不适合较大的转基因。 ssAAV和scAAV都是针对DNA模板递送到NK细胞中而设计和测试的。

通过HR机制的稳定基因整合取决于为DSB的侧接区域提供具有最佳同源性臂的转基因。为了找到最合适的同源性臂的长度并优化转基因对ssAAV和scAAV的包装能力，针对Cas9靶向位点的右侧和左侧设计了30bp、300bp、500bp和800-1000bp的HA。由于设计同源性臂是一个耗时的程序并且需要多次优化，因此还研究了CRISPaint方法——一种用于基因插入或标记的不依赖于同源性的方法。在该方法中，在编码目的基因的 DNA模板中提供相同的Cas9靶向位点，包括crRNA和PAM序列。在引入Cas9复合物后，同时切割模板和基因组DNA。因此，CRISPaint模板表现为可以通过非同源性修复机制整合的线性化双链DNA。使用这两种方法，使用mCherry作为概念证明，产生了高效且稳定的转基因修饰的NK细胞。

3.实例3

a)人NK细胞的纯化和扩增。

纯化NK细胞。简而言之，使用RosetteSep^TM人NK细胞富集混合物从PBMC中分离NK细胞(图8)。使用流式细胞术将纯化的NK细胞表型化为＞90％的CD3阴性/CD56 阳性群体(图9)。这些细胞在纯化当天以2:1(饲养细胞:NK细胞)的比率用经辐照的表达mbIL21的K562饲养细胞刺激(图9)。将经刺激的细胞在含有100IU/mL的IL-2 的无血清AIM-V/ICSR扩增培养基中培养7天。

b)靶向用于基因插入的基因组安全港。

基因组安全港(GSH)是基因组中可以在不改变宿主细胞的正常功能的情况下被修饰的位点，并且允许转基因的充分表达。选择了腺相关病毒位点1(AAVS1)，它是GSH 之一和磷酸酶1调节亚基12C(PPP1R12C)基因中的典型基因座。已成功将这一基因座用于将基因定向插入几种细胞类型。首先，通过ATAC-seq测定在原始和扩增的NK细胞中评估AAVS1的染色质可及性，并且显示在原始和IL-21扩增细胞之间没有差异(图10)。如前所述，通过将Cas9/RNP电穿孔到扩增的NK细胞中，使用一个gRNA(crRNA: 5’GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO:17))靶向AAVS1。

简而言之，收获3x10⁶个扩增NK细胞，并用13ml的PBS洗涤两次，然后以300g 离心7分钟，并吸取PBS。将细胞沉淀重悬在20ul的P3原代细胞4D-Nucleofector溶液中。向细胞悬浮液中加入5ul的靶向AAVS1的预复合的Cas9/RNP(CRISPR-Cas9 crRNA、CRISPR-Cas9tracrRNA和S.p.HiFi Cas9核酸酶V3)(Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,Iowa)，和1μl的100μm电穿孔增强剂(Cas9 Electroporation Enhancer)。将总体积为26ul的CRISPR反应转移至4D-Nucleofector^TM的16孔条带中，并使用程序EN-138进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞转移至12孔板(图 11)中含有100IU的IL-2的2ml无血清培养基中，并在37度5％CO2压力下孵育。

在48小时后，分离NK细胞DNA，用于检测CRISPR编辑的NK细胞中的插入缺失 (Indel)。对侧接Cas9靶向位点的区域进行PCR扩增，并且对扩增子进行Sanger测序。 CRISPR编辑推断(ICE)用于分析Indel的频率(图12)。ICE结果显示，超过85％的 CRISPR修饰的NK细胞在AAVS1 Cas9靶向位点处具有至少一个indel。为了确保在该基因座处的基因组修饰不会干扰靶向癌细胞的能力，使用Kasumi(一种AML癌细胞系) 来评估AAVS1-KO NK细胞的细胞毒性。使用钙黄绿素AM测定，没有观察到野生型和 CRISPR修饰的NK细胞在其杀伤能力上的差异(图13)。

c)用于DNA模板递送的各种腺相关病毒载体血清型的测试。

为了确定用于原代NK细胞的转导的AAV的最佳血清型并且向NK细胞提供最高数量的编码目的基因的DNA模板，我们以300K的多重感染(MOI)用AAV的几种血清型(包括编码GFP的AAV4、AAV6、AAV8和AAV9)转导细胞。用AAV6转导的NK 细胞具有通过流式细胞术检测到的最高的GFP表达水平。重要的是，AAV6病毒基因组可以在转导后长达48小时内通过qPCR分析进行检测，这是Cas9蛋白的核酸内切酶功能的关键时间(图14)。

d)设计HR和CRISPaint基因递送构建体。

在成功证明AAVS1基因座可以在NK细胞中修饰而不改变其靶向癌细胞的能力后，评估了AAV介导的mCherry转基因的递送，以用于在AAVS1处进行基因插入。对于HR 定向基因插入，将编码mCherry的DNA(其同源性臂(HA)位于Cas9靶向位点的侧接区域)克隆到单链或自互补AAV载体的主链中。设计30bp、300bp、500bp和1000bp的 HA用于右侧，设计30bp、300bp、500bp和800bp用于左侧HA(图15)。对于CRISPaint DNA模板，单(PAMg)或双(PAMgPAMg)Cas9靶向序列被合并到mCherry转基因周围，但在ITR内。因此，Cas9可以同时切割gDNA和CRISPaint DNA模板，从而实现在基因组DSB处的整合(图16A-16B)。为了确保设计的HR和CRISPaint DNA模板的准确性，在将转基因包装到AAV6中之前，将编码mCherry的圆形DNA与靶向AAVS1的 Cas9/RNP共同电穿孔到HEK293细胞中。结果表明，HR和CRISPaint DNA均在基因组 DSB处成功地整合，并且mCherry高效表达(图17)。

e)研究原代NK细胞中的NHEJ和HR途径，以确定用于基因组编辑的最佳途径。

CRISPaint和HR受酶促反应调节。CRISPaint是一种LIG4依赖性过程，而诸如BRCA1 和BRCA2的其他蛋白调节HR。因此，分析了这些基因在NK细胞中的表达水平，以评估哪种修复途径在这种细胞类型中可以是更有效的。RNA-seq分析显示，与原始NK细胞相比，扩增NK细胞具有更高的BRCA1和BRCA2表达，并且在这些细胞中的LIG4 水平没有降低(图18)，这为通过CRISPaint进行HR或NHEJ定向基因插入提供了最佳条件。

f)将Cas9/RNP和AAV6结合以产生mCherry NK细胞。

在实验操作前一天进行NK细胞扩增的第6天，以5x10⁵个细胞/ml进行培养基更换和再悬浮。然后如上所述，在第7天用靶向AAVS1的Cas9/RNP电穿孔NK细胞。电穿孔后三十分钟，收集活细胞，并以1x10⁶个细胞/ml重新悬浮在24孔板中的含100IU的 IL2的培养基中。对于使用ssAAV6或scAAV6递送HR或编码mCherry的CRISPaint DNA 的每个转导条件，用300K的MOI或150K的MOI转导300K电穿孔细胞。可替代地，为了测试AAV6的较高MOI的转导效率，用递送HR 800bp的500K MOI的ssAAV6和递送CRISPaint PAMgPAMg的scAAV6转导150,000个细胞(图19)。阴性对照包括未电穿孔的NK细胞、用Cas9/RNP电穿孔但未AAV转导的NK细胞，或用300K MOI的 AAV6转导但未电穿孔Cas9/RNP的NK细胞。电穿孔和转导后第二天，在不更换旧培养基的情况下，向每个孔中加入150ul的含有100IU的IL2的新鲜培养基。在电穿孔后将细胞在培养物中保持48小时，然后以2:1的比率用K562饲养细胞再刺激，并在24孔板中以1ml的总体积保存。

g)经CRISPR修饰的人NK细胞的流式细胞术显示mCherry基因的成功整合。

电穿孔和转导后两天及扩增前，进行流式细胞术以评估mCherry表达和活力 (GhostRed 780染料)。总体而言，用递送HR载体的AAV6转导的NK细胞具有比 CRISPaint更高的敲入效率。此外，scAAV6表现出明显更好的基因插入。在对照NK细胞中未观察到mCherry表达。几乎20％的NK细胞在实验条件下是mCherry阳性的，在该实验条件下，使用HR载体用递送编码具有800bp的HA的mCherry的DNA的ssAAV6 转导细胞。对于用300K MOI的递送CRISPaint PAMg的scAAV6或300K MOI和500K MOI的PAMgPAMg转导的NK细胞，可以发现高达8％的mCherry阳性细胞。重要的是，在用含有较短同源性臂的scAAV6 HR载体转导的细胞中，mCherry阳性细胞的百分比显著较高。这些条件包括在300K MOI或150K MOI的具有30bp(19-20％)、300bp(80-85％)、 500bp(75-85％)和800bp(80-89％)的HR scAAV6载体的转导。对于具有较低转导效率的细胞(ssAAV6-HR-800bp，scAAV6-CRISPaint PAMgPAMg)，通过FACS分选将 mCherry阳性群体富集至85％，并使用经辐照的表达mbIL21的K562饲养细胞扩增长达 20天，而mCherry阳性NK细胞的百分比未发生变化(图20-22)。对扩增的mCherry 阳性NK细胞重复进行了流式细胞分析(flow analysis)，直至转导后20天，并且在由 Cas9/RNP和ssAAV6或scAAV6的组合产生的细胞中未观察到mCherry的百分比有显著变化。尽管与HR定向的基因插入相比，使用CRISPaint观察到基因整合的较低效率，但这种方法仍然非常有吸引力，因为它允许研究人员将目的基因整合到用户定义的基因座中，而不需要设计同源性臂。此外，观察到在用CRISPaint载体转导的NK细胞中扩增更好。

h)将Cas9/RNP与非病毒基因传递相结合会导致原代人NK细胞的细胞死亡。

为了最小化病毒产生的时间和成本，已将非病毒基因整合用于T细胞。通过用编码 mCherry的裸化学合成的DNA电穿孔靶向AAVS1的Cas9/RNP，也在NK细胞中测试了这种方法。转基因以2种形式产生，一种为来自IDT的单链DNA片段(侧接 Cas9靶向位点的区域具有80bp同源性臂)，另一种具有相同的HR和CRISPaint DNA(其被克隆到AAV主链中，但未被包装在任何AAV衣壳中)。用靶向AAVS1的Cas9/RNP 和1或2ug的编码mCherry的DNA对扩增的NK细胞进行电穿孔，总体积为26ul。在2 天后，含有的细胞100％死亡，并且用HR和CRISPaint DNA电穿孔的细胞仅有10％存活。这些细胞可以扩增，但所得细胞中不到1％为mCherry阳性，尽管DNA被整合到DSB的位点。这表明与裸DNA递送相比，AAV介导的NK细胞修饰耐受性更好且更加高效。

序列

SEQ ID NO:1 30bp右同源性臂

gattggtgacagaaaagccccatccttagg

SEQ ID NO:2 30bp左同源性臂

ttatctgtcccctccaccccacagtggggc

SEQ ID NO:3 300bp右同源性臂

SEQ ID NO:4 300bp左同源性臂

SEQ ID NO:5 500bp右同源性臂

SEQ ID NO:6 500bp左同源性臂

SEQ ID NO:7 800bp右同源性臂

gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagat tccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcc tgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctc tcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagc agtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtc agttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactcccttt gtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgc tatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccag gagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctct gctcttcagactgagccccgttcccctgcatccccgttcccctgcatcccccttcccctgcatcccccagaggccccaggccacctacttg gcctggaccccacgagaggccaccccagccctgtctaccaggctgccttttgggtggattctcctccaactgtggggtgactgcttgg

SEQ ID NO:8 800bp左同源性臂

SEQ ID NO:9PAM gRNA

ccaatcctgtccctagtggcccc

SEQ ID NO:10剪接受体

atcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccag

SEQ ID NO:11BGH polyA终止子

cctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtc ctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattc

SEQ ID NO:12mCherry

gtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacgg ccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtgg ccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgacta cttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcct ccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccat gggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggac ggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaa gttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatgg acgagctgtacaagtaa

SEQ ID NO:13 30bp带有并入mCherry转基因的质粒。

ttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttctttttt ccaggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacgg ccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtgg ccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgacta cttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcct ccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccat gggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggac ggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaa gttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatgg acgagctgtacaagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacaga aaagccccatccttagg

SEQ ID NO:14 300bp带有并入mCherry转基因的质粒。

gttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttcca gccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatg tttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatct gtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccaggtgag caagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttc gagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgccc ttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgt ccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcagg acggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctggg aggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggcca ctacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatc acctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgta caagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgc cactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacagaaaagccccat ccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcct ggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtg ggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcg gctgtc

SEQ ID NO:15 500bp带有并入mCherry转基因的质粒。

tcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttctt gtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctg gacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctct tccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacag catgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtactttt atctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccaggt gagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacga gttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctg cccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaag ctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgc aggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggct gggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcg gccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttgg acatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgag ctgtacaagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaa ggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacagaaaagc cccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacaccccca tttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagg gggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctga cgcggctgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaa taagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggcca gtagccagccccgtcctggcag

SEQ ID NO:16 800bp带有并入mCherry转基因的质粒。

tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatcct tccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcactt ccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaacccc atgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcc cttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctct ccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctacccccctta cctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcc cctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatg tggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgca atcttcgcatttcttttttccaggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatgga gggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaa ggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccg ccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgac cgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgta atgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcaga ggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgc ctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgcca ctccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctccc ccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattc tattcgattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagatt ccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcct gggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctct cccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagca gtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtca gttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgt gagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgcta tctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccagga gaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgct cttcagactgagccccgttcccctgcatccccgttcccctgcatcccccttcccctgcatcccccagaggccccaggccacctacttggcc tggaccccacgagaggccaccccagccctgtctaccaggctgccttttgggtggattctcctccaactgtggggtgactgcttgg

SEQ ID NO:17(crRNA)

GGGGCCACTAGGGACAGGAT

序列表

<110> 全国儿童医院研究所

<120> 使用CAS9/RNP和AAV病毒的组合产生用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体(CAR)-原代NK细胞

<130> 10935-004WO1

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

gattggtgac agaaaagccc catccttagg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc 30

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60

tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120

agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180

ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240

tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc ccctaccccc 60

cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt catggcatct tccaggggtc 120

cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt caggacagca 180

tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata ttcccagggc 240

cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc 300

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60

tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120

agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180

ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240

tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300

tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360

tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420

ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480

agccagcccc gtcctggcag 500

<210> 6

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

tcccttttcc ttctccttct ggggcctgtg ccatctctcg tttcttagga tggccttctc 60

cgacggatgt ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt 120

ttctggacaa ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc 180

tttctttgcc tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt 240

tgggcagctc ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt 300

catggcatct tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct 360

atgtccactt caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga 420

ccaccttata ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc 480

cctccacccc acagtggggc 500

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7