技术特征：
1.一种用于成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的9(Cas9)整合系统的质粒，其中所述质粒依次包括左同源性臂、剪接受体、转基因和右同源性臂，其中所述左同源性臂和右同源性臂的长度各自为800bp或更短。
2.根据权利要求1所述的质粒，进一步包括在所述转基因与所述右同源性臂之间的聚腺苷酸化信号。
3.根据权利要求1或2所述的质粒，其中所述左同源性臂和所述右同源性臂的长度相同。
4.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为30bp。
5.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为300bp。
6.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为500bp。
7.根据权利要求3所述的质粒，其中所述同源性臂的长度为800bp。
8.根据权利要求1或2所述的质粒，其中所述左同源性臂和所述右同源性臂的长度不同。
9.一种用于CRISPR/Cas9整合方法的质粒，由1或2个前间区序列邻近基序(PAM)和CRISPR RNA(crRNA)以及转基因组成，其中编码的核酸的顺序包括PAM、crRNA和转基因，并且其中当使用2个PAM和crRNA时，所述编码的核酸的顺序包括第一PAM、第一crRNA、转基因、第二PAM和第二gRNA。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的质粒，其中根据权利要求1至8中任一项所述的质粒的所述同源性臂和根据权利要求9所述的质粒的PAM与人的染色体19的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性杂交。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的质粒，其中所述转基因包含编码用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体的多核苷酸。
12.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的质粒。
13.根据权利要求12所述的AAV载体，其中所述AAV的血清型包括AAV6。
14.根据权利要求12或13所述的AAV载体，其中所述载体进一步包含编码crRNA、示踪RNA(trcrRNA)和CAS核酸内切酶的质粒。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是自互补AAV(scAAV)。
17.一种修饰的细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的质粒或根据权利要求12至16中任一项所述的AAV载体。
18.根据权利要求17所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是CAR NK细胞。
19.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求17或18所述的修饰的细胞。
20.一种通过同源定向修复对细胞进行遗传修饰的方法，包括
a)获得核糖核蛋白(RNP)复合物和AAV载体，所述RNP复合物包含与相应的CRISPR/Cas向导RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)，所述AAV载体包含有包含转基因(诸如例如，用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体)的质粒，其中所述转基因侧接同源性臂，并且其中所述同源性臂的长度为800bp或更短；和
b)将所述转基因和所述RNP复合物引入到细胞中，其中所述转基因通过用腺相关病毒(AAV)感染到所述细胞中而被引入到所述细胞中，其中所述RNP复合物与所述细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且所述细胞的DNA修复酶将所述转基因插入到所述细胞的所述基因组DNA内的所述靶序列处的宿主基因组中，从而产生修饰的细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代细胞或扩增细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述原代细胞在感染前在IL-2的存在下孵育4天。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述原代细胞在感染前在经辐照的饲养细胞的存在下扩增4天。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，进一步包括在感染后用经辐照的表达mbIL-21的饲养细胞扩增所述修饰的细胞。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述细胞是NK细胞。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述转基因是用于肿瘤抗原的嵌合抗原受体。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中通过电穿孔将所述RNP复合物引入到所述细胞中。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物通过转染被引入到所述细胞中，并且其中所述RNP复合物编码在相同或不同的AAV上。
29.一种通过同源定向修复(HDR)对至少一种细胞进行遗传修饰的方法，包括：
(a)将(i)核糖核蛋白(RNP)复合物和(ii)包含质粒的AAV载体引入到细胞中，所述复合物包含与编码细胞基因组中的靶序列的CRISPR/Cas向导RNA复合的2类CRISPR/Cas核酸内切酶，所述质粒包含侧接第一同源性臂和第二同源性臂的转基因，每个同源性臂的长度不超过800bp，其中所述转基因编码嵌合抗原受体；和
(b)在足以使(i)所述RNP复合物与靶序列杂交并在所述靶序列中引入双链断裂(DSB)；和(ii)使细胞将所述转基因插入到所述靶序列处的细胞基因组中并通过HDR修复断裂的时间和条件下维持所述细胞，从而将所述转基因并入DSB的位点处的细胞基因组中。
30.根据权利要求28所述的方法，其中细胞是原代细胞或扩增细胞。
31.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
32.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述2类CRISPR/Cas核酸内切酶是Cas9。
33.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述细胞是原代细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(a)之前在IL-2的存在下孵育所述细胞至少约4天。
34.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述细胞是原代细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(b)之后在mbIL-21的存在下扩增所述细胞至少约4天。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述mbIL-21包括经辐照的表达mbIL-21的饲养细胞、PM21颗粒、EX21外泌体或其任何组合。
技术总结
公开了使用CRISPR/CAS9系统的腺相关病毒(AAV)递送和用于整合的核糖核蛋白对细胞进行遗传工程改造的方法。在一些方面中，本文公开了用于进行该方法的AAV质粒。
技术研发人员：D·A·李;K·C·梅耶;M·N·卡拉鲁迪;S·利基特;
受保护的技术使用者：全国儿童医院研究所;
技术研发日：2020.03.27
技术公布日：2022.01.04
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