局部递送到区室，特别是CNS的Fc修饰的生物制品的制作方法

局部递送到区室，特别是cns的fc修饰的生物制品
1.本发明涉及局部递送的生物药品，其特征在于对新生儿fc受体(fcrn)具有降低的亲和力的fc多肽，特别涉及用于神经系统疾病的这样的局部递送的生物药品。
2.免疫治疗是脑肿瘤治疗中最有前景的方向之一。白介素(il)
‑
12是一种促炎细胞因子，在临床前模型中对脑肿瘤具有强大的抗肿瘤作用。基于有希望的临床前结果，临床试验在90年代后期迅速启动，作为使用il
‑
12的静脉内(i.v.)施用的全身治疗。然而，一项ii期临床试验报告了严重的不良事件，17名患者中有12名住院，2名患者死亡。这些不利影响之后已经被归因于快速诱导高全身水平的干扰素(ifn)
‑
γ，一种il
‑
12下游效应细胞因子。
3.鉴于全身施用il
‑
12的毒性以及在肿瘤部位需要高浓度，严格控制组织中的il
‑
12水平是临床应用的必要前提。最近，通过使用新的神经外科技术，如对流增强递送(ced)，向大脑局部给药已经成为可能。然而，局部颅内递送并不排除随后的全身渗漏。
4.鼠il
‑
12fc是il
‑
12和免疫球蛋白g(igg)的可结晶片段(fc)的单链融合蛋白，与未修饰的重组il
‑
12相比，显示出提高的药物稳定性、生物利用度和减少的从大脑的被动渗漏。然而，在局部递送到大脑后，它通过新生儿fc受体(fcrn)跨过血脑屏障(bbb)主动输出，新生儿fc受体是介导所有包含fc区的蛋白质从脑脊液输出的受体。fcrn在内皮细胞和在红髓巨噬细胞中也有活性，在其中其防止包含fc的分子和血清白蛋白的降解并延长其血清半衰期。与未修饰的il
‑
12相比，il
‑
12fc因此显示出增加全身积累。
5.已知要参与到fcrn结合中的igg fc残基(异亮氨酸253
–
ile253、组氨酸310
–
his310和组氨酸435
–
his435)以及这些残基与fcrn之间相互作用的ph依赖性是现有技术已知的(pyzik等人.frontiers in immunology(2019)10:1540)。
6.例如，bitonti等人报道了将野生型igg的fc结构域中的残基ile253、his310和his435分别突变为ala253、ala310和ala435，导致在ph6下fcrn结合的消除(bitonti等人.proceedings of the national academy of sciences(2004)101(26):9763
‑
9768)。
7.然而，将氨基酸置换为丙氨酸是一种筛选目标蛋白质内给定位置的功能作用的常见生化方法。除了这一特定突变(aaa)之外，该文章没有披露从中可以得出关于所产生的fcrn结合特性的结论的任何其他突变。此外，该文章涉及fcrn介导的fc融合蛋白的转运，该fc融合蛋白包含促红细胞生成素(epo)，这是一种刺激非人类灵长类动物肺中的红细胞产生的糖蛋白激素药物。该文章仍然没有分别提及结果对包含il
‑
12的融合多肽和将fc融合多肽给予大脑的适用性。
8.有一些出版物实际上涉及包含il
‑
12的融合多肽以及增加其血清半衰期的方法。
9.例如，jung等人描述了包含il
‑
12和具有a107突变对的基于人igg4的异二聚体fc的融合多肽的生成和抗肿瘤活性，该突变对使对fcγ受体的亲和力降低(jung等人.,oncoimmunology,7(7):e1438800)。
10.然而，由于fcγ受体(fcγr)家族是一组功能性蛋白质，其特征在于结合于抗体的恒定区，即fc部分，但是在结构、fc部分的非重叠结合位点、在细胞的不同区室中的定位(细胞内相对于细胞外)、ph依赖性结合(酸性相对于中性)和整体功能方面有差异。很明显，fcrn不能等同于fcγr。
11.在现有技术的另一个实例中，在重组il
‑
12和il
‑
12fc之间就组织保留和渗漏进入体循环进行了比较(beffinger等人.,neuro
‑
oncology(2017),19(suppl
‑
.6),vi273)。其中，作者指出，与重组il
‑
12相比，il
‑
12fc在颅内施用后24小时显示出更高的脑浓度。
12.然而，该研究没有公开在igg的fc区中具有突变的融合多肽或对与fcrn结合的影响。
13.cooper等人研究了在局部递送重组人igg1 mab的两种变体后，fcrn在igg从大鼠大脑流出中的作用，该两种变体与igg1的野生型fc相比具有增加的fcrn结合(igg1天冬酰胺434到丙氨酸，n434a)或减少的fcrn结合(igg1组氨酸435到丙氨酸，h435a)(cooper等人.brain research(2013)1534:13
‑
21)。通过分别在434和435位氨基酸掺入突变获得突变体。这项研究已经使用人抗体在大鼠中进行。
14.关于fc突变体对fcrn的小鼠和人形式的结合特性，andersen等人公开了在ile253、his310和his435水平上具有突变的五种不同的fc突变体，即h435q、h435r、h310a、i253a和h310a/h435q(andersen等人.journal of biological chemistry(2012)287(27):22927
‑
22937)。特征为对人fcrn亲和力最低的变体是同时具有h310a和h435q突变(iaq)的突变体。
15.尽管本文提到的最后两项研究表明fcrn在igg从大鼠脑中流出中起重要作用，并分别公开了对fcrn的亲和力降低的不同突变体，但这些研究都不用作评估il
‑
12fc的存在将如何影响与fcrn的结合的基础。此外，没有公开产生最大脑比血浓度梯度的概念。
16.基于上述现有技术，本发明的目的是提供延长局部递送到特定区室，特别是脑的药物的治疗窗，并防止来自所述区室，特别是脑的输出，和全身累积二者，从而增加区室与血清比，尤其是脑与血清比的手段和方法。该目的通过本说明书的权利要求来实现。
17.在本说明书的上下文中，术语可结晶片段(fc)区是指包含通过二硫键共价连接的两个相同重链片段或共价连接到单个重链片段的两个相同重链片段的igg抗体的部分。重链片段由恒定结构域(igg抗体同种型中的c
h
2和c
h
3结构域)组成。
18.在本说明书的上下文中，fc区中氨基酸残基的编号采用eu编号系统(edelman等人.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america(1969)63(1):78
‑
85)。eu编号方案是一种广泛采用的标准，用于以一致的方式对抗体中的残基进行编号。
19.氨基酸序列从氨基到羧基末端给出。序列位置的大写字母是指以单字母代码表示的l
‑
氨基酸(stryer,biochemistry,第3版，第21页)。氨基酸序列位置的小写字母是指相应的d
‑
或(2r)
‑
氨基酸。
20.氨基酸残基i253、h310和h435位于c
h2‑
c
h
3结构域界面，并且除人igg3中的r435外，在物种内的igg亚类中以及啮齿动物和人类中发现的igg分子之间是保守的(miyakawa等人.rna(2008)14:1154
‑
1163)。根据本发明，修饰的fc区或其片段可以源自igg1、igg2或igg4免疫球蛋白，并且应至少包括根据eu编号系统的免疫球蛋白g(igg)的fc结构域的氨基酸残基253、310和435。
21.在本说明书的上下文中，il
‑
12是指白介素12。
22.在本说明书的上下文中，hil
‑
12涉及人il
‑
12。
23.在本说明书的上下文中，mil
‑
12涉及鼠il
‑
12。
24.在本说明书的上下文中，rmil
‑
12涉及重组鼠il
‑
12。
25.在本说明书的上下文中，rhil
‑
12涉及重组人il
‑
12。在本说明书的上下文中，il
‑
12fc wt涉及与野生型非修饰的fc区连接的il
‑
12，特别是借助gly
‑
ser
‑
接头或通过添加igg4标签通过p40与p35融合来连接。
26.在本说明书的上下文中，mil
‑
12hfc wt涉及与含有丝氨酸228到脯氨酸(s228p)突变和nhq突变的igg4的人野生型fc区连接的鼠il
‑
12。
27.在本说明书的上下文中，mil
‑
12hfc nhq涉及与包含丝氨酸228到脯氨酸以及nhq突变的igg4的人野生型fc区连接的鼠il
‑
12。
28.在本说明书的上下文中，mil
‑
12hfc:抗pd
‑
l1双功能分子涉及与人igg1fc连接并与完整人或人源化pd
‑
l1结合igg1抗体的半分子(一条重链和一条轻链)二聚化的鼠il
‑
12。所得分子的fc部分包含nhq突变。
29.在本说明书的上下文中，fcrn
tg
涉及缺乏功能性鼠fcrn并携带用于在等位基因符号tg(fcgrt)32dcr描述的天然人调节元件控制下表达人fcrnα
‑
链的转基因的小鼠品系。
30.在本发明的上下文中，il
‑
12多肽是具有包含p35序列(uniprot id29459)或其功能同源物并包含p40序列(uniprot id29460)或其功能同源物的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，il
‑
12多肽具有包含p35和p40序列或其同源物作为相同连续氨基酸链的部分的氨基酸序列。在所述连续氨基酸链中，仅n
‑
末端多肽(p40)功能同源物保留信号肽。在另一个实施方案中，il
‑
12多肽包含两条不同的氨基酸链，一条包含p35序列，另一条包含p40序列，两者都具有单独的信号肽。il
‑
12多肽具有il
‑
12的生物活性。在本发明的上下文中，il
‑
12的生物活性包括所述il
‑
12多肽对nk或t细胞的刺激，最显著的是通过穿孔素作用的t效应细胞的刺激。
31.在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指通过比较两个比对序列确定的值。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列比对可以通过smith和waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法，通过needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的全序列比对算法，通过用于pearson和lipman,proc.nat.acad.sci.85:2444(1988)的相似性方法的搜索，或通过以下这些算法的计算机化实施进行，包括但不限于clustal、gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。用于执行blast分析的软件是公众可获得的，例如，通过国家生物技术信息中心(the national center for biotechnology
‑
information)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
32.氨基酸序列的比较的一个实例是blastp算法，其使用默认设置：预期阈值：10；字号：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：blosum62；空位罚分：存在11，延长1；组成调整：条件组成得分矩阵调整。核酸序列的比较的一个这样的实例是blastn算法，其使用默认设置：预期阈值：10；字号：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/错配得分：1.
‑
2；空位罚分：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用blast程序套件(altschul等人.,j.mol.biol.215:403
‑
410(1990))，使用以上确定的分别用于蛋白质和核酸比较的默认参数获得的值。
33.在本说明书的上下文中，il
‑
10是指白介素10。在某些实施方案中，il
‑
10用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆或中风。在某些实施方案中，中和il
‑
10用于治疗肺副球孢子菌病。
34.在本说明书的上下文中，il
‑
2是指白介素2。在某些实施方案中，il
‑
2用于治疗癌症和感染性疾病。
35.在本说明书的上下文中，il
‑
7是指白介素7。在某些实施方案中，il
‑
7用于治疗癌症和感染性疾病。
36.在本说明书的上下文中，ifnγ是指干扰素γ。在某些实施方案中，ifnγ用于治疗癌症和感染性疾病。
37.在本说明书的上下文中，il
‑
15是指白介素15。在某些实施方案中，il
‑
15用于治疗癌症和感染性疾病。
38.在本说明书的上下文中，il
‑
23是指白介素23。在某些实施方案中，il
‑
23用于治疗癌症和感染性疾病。
39.在本说明书的上下文中，tnfα是指肿瘤坏死因子α，也称为恶病质素(cachexin)或恶液质素(cachectin)。在某些实施方案中，tnfα用于治疗癌症和感染性疾病。在某些实施方案中，阻断tnfα用于治疗炎症、自身免疫炎症和关节炎。在某些实施方案中，阻断tnfα用于治疗葡萄膜炎。在某些实施方案中，阻断tnfα用于治疗类风湿性关节炎。在某些实施方案中，阻断tnfα用于治疗结节病。在某些实施方案中，阻断tnfα用于治疗囊性纤维化。
40.在本说明书的上下文中，ctla
‑
4是指细胞毒性t
‑
淋巴细胞相关蛋白4，也称为cd152。在某些实施方案中，阻断ctla
‑
4用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断ctla
‑
4用于治疗肺癌。
41.在本说明书的上下文中，tgfβ是指转化生长因子β。在某些实施方案中，阻断tgfβ用于治疗癌症和感染性疾病。在某些实施方案中，tgfβ用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。在某些实施方案中，tgfβ拮抗剂用于治疗囊性纤维化。
42.在本说明书的上下文中，tgfα是指转化生长因子α。在某些实施方案中，tgfα拮抗剂用于治疗囊性纤维化。
43.在本说明书的上下文中，tgfβrii是指转化生长因子β受体ii。在某些实施方案中，阻断tgfβrii或使用tgfβrii
‑
fc用于治疗癌症和感染性疾病。
44.在本说明书的上下文中，gdnf是指胶质细胞系源性神经营养因子。在某些实施方案中，gdnf用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
45.在本说明书的上下文中，il
‑
35是指白介素35。在某些实施方案中，il
‑
35用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。
46.在本说明书的上下文中，cd95是指fas，也称为fasr、细胞凋亡抗原1、apo
‑
1、apt或tnfr超家族成员6。在某些实施方案中，阻断cd95用于治疗癌症。
47.在本说明书的上下文中，il
‑
1ra是指白介素1受体拮抗剂。在某些实施方案中，il
‑
1ra用于治疗炎症、自身免疫炎症、类风湿性关节炎、痛风、假性痛风、痴呆和中风。在某些实施方案中，阻断il
‑
1ra用于治疗类风湿性关节炎。
48.在本说明书的上下文中，il
‑
4是指白介素4。在某些实施方案中，il
‑
4用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。
49.在本说明书的上下文中，il
‑
13是指白介素13。在某些实施方案中，il
‑
13用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。在某些实施方案中，中和抗il
‑
13用于治疗严重的不受控制的哮喘。在某些实施方案中，阻断和/或中和il
‑
13用于治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉。在某些
实施方案中，il
‑
13拮抗剂用于治疗特发性肺纤维化。
50.在本说明书的上下文中，tslp是指胸腺基质淋巴细胞生成素，一种属于细胞因子家族的蛋白质。在某些实施方案中，中和tslp用于治疗过敏性哮喘。在某些实施方案中，阻断和/或中和tslp用于治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉。
51.在本说明书的上下文中，sirpα是指信号调节蛋白α。在某些实施方案中，sirpα用于治疗癌症。
52.在本说明书的上下文中，g
‑
csf是指粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf或gcsf)，也称为集落刺激因子3(csf 3)。在某些实施方案中，g
‑
csf用于治疗癌症。
53.在本说明书的上下文中，gm
‑
csf是指粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)，也称为集落刺激因子2(csf2)。在某些实施方案中，gm
‑
csf用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断gm
‑
csf用于治疗多发性硬化症。
54.在本说明书的上下文中，gm
‑
csfr是指粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子受体(gm
‑
csfr)，也称为cd116(分化簇116)，是粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激的受体，其刺激白细胞的产生。在某些实施方案中，阻断gm
‑
csfr用于治疗类风湿性关节炎。
55.在本说明书的上下文中，ox40l是指ox40的配体，也称为cd134的配体。在某些实施方案中，ox40l用于治疗癌症。
56.在本说明书的上下文中，cd80是指b7
‑
1，也称为b7.1。在某些实施方案中，cd80用于治疗癌症。
57.在本说明书的上下文中，cd86是指b7
‑
2，也称为b7.2。在某些实施方案中，cd86用于治疗癌症。
58.在本说明书的上下文中，gitrl是指tnfsf18、aitrl、tl6、tnlg2a、tnf超家族成员18。在某些实施方案中，gitrl用于治疗癌症。
59.在本说明书的上下文中，4
‑
1bbl是指4
‑
1bb的配体，也称为ila的配体或cd137的配体或tnfr超家族成员9的配体。在某些实施方案中，4
‑
1bb用于治疗癌症。
60.在本说明书的上下文中，肝配蛋白a1是指efna1。在某些实施方案中，肝配蛋白a1用于治疗癌症。
61.在本说明书的上下文中，肝配蛋白b2是指efnb2。在某些实施方案中，肝配蛋白b2用于治疗癌症。
62.在本说明书的上下文中，肝配蛋白b5是指efnb5。在某些实施方案中，肝配蛋白b5用于治疗癌症。
63.在本说明书的上下文中，pd
‑
l1是指程序性死亡配体1，也称为cd274或b7同源物1或b7
‑
h1。在某些实施方案中，pd
‑
l1阻断用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断pd
‑
l1用于治疗葡萄膜黑色素瘤。在某些实施方案中，阻断pd
‑
1用于治疗肺癌。
64.在本说明书的上下文中，组蛋白是指属于组蛋白家族h1/h5、h2a、h2b、h3和h4的蛋白质。在某些实施方案中，结合组蛋白用于治疗癌症。
65.在本说明书的上下文中，cxcl10是指c
‑
x
‑
c基序趋化因子10，也称为干扰素γ诱导的蛋白10(ip
‑
10)或小可诱导细胞因子b10。在某些实施方案中，cxcl10用于治疗癌症。
66.在本说明书的上下文中，pd
‑
1是指程序性细胞死亡蛋白1，也称为cd279。在某些实施方案中，结合pd
‑
1用于治疗癌症。在某些其他实施方案中，结合pd
‑
1用于治疗痴呆。在某
些实施方案中，阻断pd
‑
1用于治疗葡萄膜黑色素瘤。在某些实施方案中，阻断pd
‑
1用于治疗肺癌。
67.在本说明书的上下文中，trem2是指在骨髓细胞2上表达的触发受体。在某些实施方案中，阻断trem2用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。
68.在本说明书的上下文中，il
‑
6是指白介素6。在某些实施方案中，阻断il
‑
6用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。
69.在本说明书的上下文中，il
‑
6r是指白介素6受体。在某些实施方案中，阻断il
‑
6r用于治疗炎症、自身免疫炎症、类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎和成年发作型斯提耳氏病。在某些实施方案中，阻断和/或中和il
‑
6r用于治疗冠状病毒疾病2019(covid
‑
19)和/或由严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars
‑
cov)引起的疾病。
70.在本说明书的上下文中，cx3cr1是指cx3c趋化因子受体1，也称为分形趋化因子受体或g
‑
蛋白偶联受体13(gpr13)。在某些实施方案中，结合cx3cr1用于治疗癌症、痴呆、炎症、自身免疫炎症和中风。
71.在某些实施方案中，阻断cd27用于治疗炎症或自身免疫炎症。
72.在某些实施方案中，激活cd27用于治疗癌症。
73.在某些实施方案中，阻断cd25用于治疗炎症、自身免疫炎症和多发性硬化症。
74.在某些实施方案中，结合cd25用于治疗癌症。
75.在某些实施方案中，激活cd28用于治疗癌症。
76.在本说明书的上下文中，nogo
‑
a是指神经突生长抑制剂，也称为nogo或nsp或nsp
‑
cl浆膜蛋白4。在某些实施方案中，阻断nogo
‑
a用于治疗自身免疫炎症、创伤性cns损伤和中风。
77.在本说明书的上下文中，il
‑
12rb1是指白介素
‑
12受体β1亚基。在某些实施方案中，阻断il
‑
12rb1用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆和中风。
78.在本说明书的上下文中，cd47是指整合素相关蛋白(iap)。在某些实施方案中，阻断cd47用于治疗癌症。
79.在本说明书的上下文中，cd147是指基础免疫球蛋白(bsg)，也称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(emmprin)。在某些实施方案中，阻断cd147用于治疗冠状病毒疾病2019(covid
‑
19)。在某些实施方案中，阻断cd147用于治疗由严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars
‑
cov)引起的疾病。在本说明书的上下文中，egfr是指表皮生长因子受体，也称为erbb
‑
1。在某些实施方案中，阻断egfr用于治疗癌症。
80.在本说明书的上下文中，egfrviii是指表皮生长因子受体的viii突变体，也称为erbb
‑
1的viii突变体。在某些实施方案中，阻断egfrviii用于治疗癌症。
81.在本说明书的上下文中，her2是指受体酪氨酸蛋白激酶erbb
‑
2，也称为cd340或原癌基因neu。在某些实施方案中，阻断her2用于治疗癌症。
82.在本说明书的上下文中，pdgfr是指血小板源性生长因子受体(pdgf
‑
r)。在某些实施方案中，阻断pdgf
‑
r用于治疗癌症。
83.在本说明书的上下文中，fgfr是指成纤维细胞生长因子受体。在某些实施方案中，阻断fgfr用于治疗癌症。
84.在本说明书的上下文中，il
‑
4ra是指白介素4受体，也称为il
‑
4r或cd124。在某些
实施方案中，阻断il
‑
4ra用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断il
‑
4r用于治疗哮喘。
85.在本说明书的上下文中，tfr是指转铁蛋白受体。在某些实施方案中，结合tfr用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆、创伤性cns损伤、癌症和中风。
86.在本说明书的上下文中，lfr是指乳铁蛋白受体，也称为网膜素或肠道乳铁蛋白受体。在某些实施方案中，结合lfr用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆、创伤性cns损伤、癌症和中风。
87.在本说明书的上下文中，ir是指胰岛素受体。在某些实施方案中，结合ir用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆、创伤性cns损伤、癌症和中风。
88.在本说明书的上下文中，ldl
‑
r是指低密度脂蛋白受体。在某些实施方案中，结合ldl
‑
r用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆、创伤性cns损伤、癌症和中风。
89.在本说明书的上下文中，lrp
‑
1是指低密度脂蛋白受体相关蛋白1(lrp1)，也称为α
‑2‑
巨球蛋白受体(a2mr)或载脂蛋白e受体(apoer)或cd91。在某些实施方案中，结合lrp
‑
1用于治疗炎症、自身免疫炎症、痴呆、创伤性cns损伤、癌症和中风。
90.在本说明书的上下文中，cd133是指prominin
‑
1。在某些实施方案中，结合cd133用于治疗癌症。
91.在本说明书的上下文中，cd111是指脊髓灰质炎病毒受体相关1(pvrl1)，也称为粘连蛋白
‑
1。在某些实施方案中，结合cd111用于治疗癌症。
92.在本说明书的上下文中，vegfr是指血管内皮生长因子受体。在某些实施方案中，阻断vegfr用于治疗癌症或湿性amd、糖尿病黄斑水肿或色素性视网膜炎。
93.在本说明书的上下文中，vegf
‑
a是指血管内皮生长因子a。在某些实施方案中，阻断vegf
‑
a用于治疗癌症或湿性amd、糖尿病黄斑水肿、色素性视网膜炎或慢性血友病滑膜炎。
94.在本说明书的上下文中，ang
‑
2是指血管生成素2。在某些实施方案中，阻断vegf
‑
a用于治疗癌症或湿性amd、糖尿病黄斑水肿或色素性视网膜炎。
95.在本说明书的上下文中，il
‑
10r是指白介素10受体，也称为细胞因子合成抑制因子受体。在某些实施方案中，阻断il
‑
10r用于治疗癌症。
96.在本说明书的上下文中，il
‑
13rα2是指白介素
‑
13受体亚基α
‑
2，也称为cd213a2。在某些实施方案中，结合il
‑
13rα2用于治疗癌症。在某些实施方案中，il
‑
13rα2用于治疗癌症。
97.在某些实施方案中，结合α
‑
突触核蛋白用于治疗帕金森氏病。
98.在本说明书的上下文中，csf1r是指集落刺激因子1受体(csf1r)，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体(m
‑
csfr)和cd115。在某些实施方案中，阻断csf1r用于治疗癌症。
99.在本说明书的上下文中，gitr是指糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白，也称为tnfr超家族成员18(tnfrsf18)或活化诱导型tnfr家族受体或aitr。在某些实施方案中，结合gitr用于治疗癌症。
100.在本说明书的上下文中，cd22是指分化簇
‑
22。在某些实施方案中，阻断cd22用于治疗神经退行性疾病、自身免疫炎症、痴呆和中风。
101.在本说明书的上下文中，tim
‑
3是指t细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域
‑
3，也称为甲肝病毒细胞受体2(havcr2)。在某些实施方案中，阻断tim
‑
3用于治疗癌症。
102.在本说明书的上下文中，lag
‑
3是指淋巴细胞活化基因3。在某些实施方案中，阻断lag
‑
3用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断lag
‑
3用于治疗肺癌。
103.在本说明书的上下文中，tigit是指具有ig和免疫受体基于酪氨酸的抑制基序结构域的t细胞免疫受体。在某些实施方案中，阻断tigit用于治疗癌症。
104.在本说明书的上下文中，btla是指b
‑
和t
‑
淋巴细胞衰减子，也称为cd272。在某些实施方案中，阻断btla用于治疗癌症。
105.在本说明书的上下文中，vista是指t细胞活化的v
‑
结构域ig抑制因子。在某些实施方案中，阻断vista用于治疗癌症。
106.在本说明书的上下文中，cd96是指t细胞活化升高的晚期表达，也称为tactile。在某些实施方案中，阻断cd96用于治疗癌症。
107.在本说明书的上下文中，4
‑
1bb是指cd137，也称为tnfr超家族成员9或由淋巴细胞活化或ila诱导。在某些实施方案中，结合4
‑
1bb用于治疗癌症。
108.在本说明书的上下文中，ccl
‑
2是指趋化因子(c
‑
c基序)配体2(ccl2)，也称为单核细胞趋化蛋白1(mcp1)或小可诱导细胞因子a2。在某些实施方案中，ccl
‑
2用于治疗癌症、中风和痴呆。在某些实施方案中，阻断ccl
‑
2用于治疗自身免疫炎症和癌症。
109.在本说明书的上下文中，il
‑
1是指il
‑
1细胞因子家族的成员。在某些实施方案中，阻断il
‑
1用于治疗多发性硬化症。
110.在本说明书的上下文中，il
‑
1r是指il
‑
1细胞因子家族的细胞因子的受体。在某些实施方案中，阻断il
‑
1r用于治疗多发性硬化症。
111.在本说明书的上下文中，epha2是指肝配蛋白a型受体2。在某些实施方案中，阻断epha2用于治疗癌症。
112.在本说明书的上下文中，epha3是指肝配蛋白a型受体3。在某些实施方案中，阻断epha3用于治疗癌症。
113.在本说明书的上下文中，ephb2是指肝配蛋白b型受体2，也称为erk。在某些实施方案中，阻断ephb2用于治疗癌症。
114.在本说明书的上下文中，ephb3是指肝配蛋白b型受体3。在某些实施方案中，阻断ephb3用于治疗癌症。
115.在本说明书的上下文中，ephb4是指肝配蛋白b型受体4。在某些实施方案中，阻断ephb4用于治疗癌症。
116.在本说明书的上下文中，ox40是指tnfr超家族成员4，也称为cd134或ox40受体。在某些实施方案中，结合ox40用于治疗癌症。
117.在本说明书的上下文中，lingo
‑
1是指含富亮氨酸重复序列和含免疫球蛋白样结构域的蛋白1。在某些实施方案中，阻断lingo
‑
1用于治疗多发性硬化症、创伤性脑cns损伤或中风。
118.在本说明书的上下文中，l1cam是指l1细胞粘附分子，也称为l1。在某些实施方案中，阻断l1用于治疗多发性硬化症、创伤性脑cns损伤或中风。
119.在本说明书的上下文中，ncam是指神经细胞粘附分子。在某些实施方案中，阻断ncam用于治疗多发性硬化症、创伤性脑cns损伤或中风。
120.在本说明书的上下文中，sod
‑
1是指超氧化物歧化酶1。在某些实施方案中，阻断
sod
‑
1用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)。
121.在本说明书的上下文中，sigmar
‑
1是指σ
‑
1受体。在某些实施方案中，阻断sigmar
‑
1用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)。
122.在本说明书的上下文中，sigmar
‑
2是指σ
‑
2受体。在某些实施方案中，阻断sigmar
‑
2用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)。
123.在本说明书的上下文中，tdp
‑
43是指tar dna
‑
结合蛋白43。在某些实施方案中，结合tdp
‑
43用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)。
124.在本说明书的上下文中，aβ是指淀粉样蛋白β。在某些实施方案中，结合aβ用于治疗阿尔茨海默氏病(ad)。
125.在本说明书的上下文中，tau是指τ蛋白。在某些实施方案中，结合tau用于治疗阿尔茨海默氏病(ad)。
126.在本说明书的上下文中，ifnα是指干扰素α。在某些实施方案中，ifnα用于治疗癌症和感染性疾病。
127.在本说明书的上下文中，ifnβ是指干扰素β。在某些实施方案中，ifnβ用于治疗癌症和感染性疾病。
128.在本说明书的上下文中，trpm4是指瞬时受体电位阳离子通道亚家族m成员4。在某些实施方案中，阻断trpm4用于治疗多发性硬化症。
129.在本说明书的上下文中，asic1是指酸敏感离子通道1，也称为阿米洛利敏感阳离子通道2、神经元(accn2)或脑钠通道2(bnac2)。在某些实施方案中，阻断asic1用于治疗多发性硬化症。
130.在本说明书的上下文中，vgcc是指电压门控钙通道，也称为电压依赖性钙通道(vdcc)。在某些实施方案中，阻断vgcc用于治疗多发性硬化症。
131.在本说明书的上下文中，cb1是指1型大麻素受体，也称为大麻素受体1。在某些实施方案中，阻断cb1用于治疗多发性硬化症。
132.在本说明书的上下文中，ttr是指转甲状腺素蛋白。在某些实施方案中，阻断ttr用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性。
133.在本说明书的上下文中，htt是指亨廷顿蛋白。在某些实施方案中，阻断htt用于治疗亨廷顿舞蹈病。
134.在本说明书的上下文中，jcv是指jc病毒或约翰坎宁安病毒(john cunningham virus)。在某些实施方案中，阻断jcv的主要衣壳蛋白vp1(病毒蛋白1)用于治疗进行性多灶性白质脑病(pml)。
135.在本说明书的上下文中，c9orf72是指由9号染色体开放阅读框72基因编码的蛋白质。在某些实施方案中，c9orf72用于治疗痴呆。在某些实施方案中，阻断c9orf72用于治疗痴呆。
136.在本说明书的上下文中，bdnf是指脑源性神经营养因子。在某些实施方案中，bdnf用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
137.在本说明书的上下文中，nrtn是指神经秩蛋白。在某些实施方案中，nrtn用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
138.在本说明书的上下文中，artn是指神经鞘胚素(artemin)。在某些实施方案中，
artn用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
139.在本说明书的上下文中，pspn是指persephin。在某些实施方案中，pspn用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
140.在本说明书的上下文中，cntf是指睫状神经营养因子。在某些实施方案中，cntf用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病、痴呆、中风和遗传障碍。
141.在本说明书的上下文中，trail是指tnf相关的凋亡诱导配体，也称为cd253或肿瘤坏死因子超家族成员10。在某些实施方案中，trail用于治疗癌症。
142.在本说明书的上下文中，ha是指血细胞凝集素(或血凝素)，一种流感病毒的表面上存在的同源三聚体糖蛋白。在某些实施方案中，中和ha用于治疗流感。
143.在本说明书的上下文中，il
‑
3是指白介素3。在某些实施方案中，il
‑
3用于治疗癌症。
144.在本说明书的上下文中，il
‑
5是指白介素5。在某些实施方案中，il
‑
5用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断il
‑
5用于治疗哮喘。在某些实施方案中，阻断il
‑
5用于治疗慢性阻塞性肺病(copd)。
145.在本说明书的上下文中，il
‑
8是指白介素8，也称为趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体8或cxcl8。在某些实施方案中，il
‑
8用于治疗癌症。在某些实施方案中，阻断il
‑
8用于治疗肺水肿。在某些实施方案中，il
‑
8拮抗剂用于治疗囊性纤维化。
146.在本说明书的上下文中，il
‑
17是指白介素17。在某些实施方案中，il
‑
17的中和用于治疗葡萄膜炎。在本说明书的上下文中，il
‑
17a是指白介素17a。在某些实施方案中，il
‑
17a的中和用于治疗类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎和/或强直性脊柱炎。
147.在本说明书的上下文中，il
‑
18是指白介素18，也称为干扰素γ诱导因子。在某些实施方案中，il
‑
18用于治疗癌症。
148.在本说明书的上下文中，il
‑
21是指白介素21。在某些实施方案中，il
‑
21用于治疗癌症。
149.在本说明书的上下文中，il
‑
21r是指白介素21受体。在某些实施方案中，il
‑
21r的阻断用于治疗过敏性哮喘。
150.在本说明书的上下文中，il
‑
22是指白介素22。在某些实施方案中，中和il
‑
22用于治疗类风湿性关节炎。
151.在本说明书的上下文中，il
‑
25是指白介素25(也称为白介素17e或il
‑
17e)。在某些实施方案中，中和il
‑
25用于治疗过敏性哮喘。
152.在本说明书的上下文中，cd20是指b
‑
淋巴细胞抗原cd20。在某些实施方案中，cd20结合抗体用于治疗间质性肺病。在某些实施方案中，cd20结合抗体用于治疗癌症。
153.在本说明书的上下文中，ccl5是指趋化因子(c
‑
c基序)配体5。在某些实施方案中，ccl5用于治疗癌症。
154.在本说明书的上下文中，ccl21是指趋化因子(c
‑
c基序)配体21。在某些实施方案中，ccl21用于治疗癌症。
155.在本说明书的上下文中，ccl10是指趋化因子(c
‑
c基序)配体10，也称为ccl9或趋化因子(c
‑
c基序)配体9。在某些实施方案中，ccl10用于治疗癌症。
156.在本说明书的上下文中，ccl16是指趋化因子(c
‑
c基序)配体16。
157.在某些实施方案中，ccl16用于治疗癌症。
158.在本说明书的上下文中，cx3cl1是指趋化因子(c
‑
x3
‑
c基序)配体1，也称为分形趋化因子。在某些实施方案中，cx3cl1用于治疗癌症。
159.在本说明书的上下文中，cxcl16是指趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体16。在某些实施方案中，cxcl16用于治疗癌症。
160.在本说明书的上下文中，nf
‑
kb是指活化b细胞的核因子κ轻链增强子。在某些实施方案中，nf
‑
kb拮抗剂用于治疗囊性纤维化。
161.在本说明书的上下文中，nra是指非类风湿性关节炎。在某些实施方案中，抗神经生长因子(ngf)抗体或抗体样分子可以用于治疗炎症、自身免疫炎症、关节炎和骨关节炎。在某些实施方案中，ngf的阻断可以用于治疗骨关节炎。在本说明书的上下文中，术语抗体是指g型抗体(igg)，其任何抗原结合片段或单链和相关的或衍生的构建体。完整抗体是包含通过二硫键互相连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(v
h
)和重链恒定区(c
h
)组成。重链恒定区由三个结构域c
h
1、c
h
2和c
h
3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为v
l
)和轻链恒定区(c
l
)组成。轻链恒定区由一个结构域c
l
组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分的结合。在本说明书的上下文中，术语抗体意在不仅包括包含两条h链和两条l链的完整抗体，还包括仅包含一条h链和一条l链的不常见抗体，或甚至仅由一条h链组成的抗体。
162.在本说明书上下文中，术语特异性结合是指具有高亲和力/kd≤10e
‑8mol/l的结合。
163.在本说明书的上下文中，术语抗体样分子是指含有igg抗体的fc片段的至少一部分和至少一个与fc片段直接或间接融合的靶结合元件，尤其是重链和轻链可变区、单链可变片段、双亲和重靶向蛋白或双特异性t细胞衔接蛋白(engager)的分子。抗体样分子能够以高亲和力/kd≤10e
‑8mol/l特异性结合于另一个分子或靶标。抗体样分子与其靶标的结合类似于抗体的特异性结合。
164.技术人员知道本发明要求抗体或抗体样分子包含fc区或与fc区融合。
165.在本说明书的上下文中，术语解离常数(kd)是指平衡常数，其衡量由[主要是两种]不同组分组成的复合物可逆地解离成其组成组分的倾向。复合物可以是例如由抗体ab和抗原ag组成的抗体
‑
抗原复合物abag。k
d
以摩尔浓度[mol/l]表示，并且对应于[ag]的一半结合位点被占据时的[ab]的浓度，换言之，未结合的[ab]的浓度等于[abag]复合物的浓度。解离常数可以根据以下公式计算：
[0166][0167]
[ab]：抗体的浓度；[ag]：抗原的浓度；[abag]：抗体抗原复合物的浓度
[0168]
在本说明书的上下文中，术语解离速率(k解离；[1/sec])和结合速率(k结合；[1/sec*m])以其化学和物理领域已知的含义使用；它们指的是衡量抗体与其靶抗原的解离(k解离)或结合(k结合)的速率常数。k
解离
和k
结合
可以使用本领域中充分建立的方法通过实验确定。确定抗体的k解离和k结合的方法使用表面等离子共振。这就是诸如或
系统的生物传感器系统背后的原理。它们还可用于通过使用以下公式确定解离常数k
d
：
[0169][0170]
在本说明书的上下文中，k
d
还可以通过对使用本领域中充分建立的方法确定的实验数据的平衡分析来确定。这可以使用生物传感器系统，例如或系统来进行。
[0171]
在本说明书的上下文中，高分级胶质瘤(hgg)是指who iv级胶质瘤或多形性成胶质细胞瘤。
[0172]
在本说明书的上下文中，名称为“nhq”的fc区是指其中(如eu编号系统所指定的)第253、310和435位包含指定氨基酸残基的fc区，换言之：n在253位，h在310位，q在435位。这对应于携带两个突变的fc区：i253n和h435q。因此，具有名称“iaq”的fc区是指在253位具有i、在310位具有a并且在435位具有q的fc区(即携带突变h310a和h435q的fc区)。表1列出了几个修饰的fc区的实例。
[0173]
本发明提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽，用于预防或治疗影响中枢神经系统的疾病。fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰。fc区包含突变i253n和h435q和310位的h。将该多肽给予大脑。
[0174]
在某些实施方案中，根据本发明的多肽还包含il
‑
12。
[0175]
可以通过颅内递送实现对大脑的给药。颅内递送可以是连续的或间歇的或一次性的。表述“给予大脑”还意味着包括在手术后冲洗切除腔。给药可以是鞘内的或实质内的。
[0176]
fc区的修饰导致多肽的血清与脑浓度比降低。血清比脑浓度降低的优点是可以在脑内实现高局部浓度，同时防止由于高全身浓度引起的不良副作用。
[0177]
在某些实施方案中，多肽的血清或血浆与脑浓度比低于预定阈值。预定阈值选自在颅内注射，特别是颅内推注或ced到fcrn
tg
小鼠的纹状体中后24小时可测量的：
[0178]
a.包含非修饰的fc区，特别是il
‑
12fc wt的相同多肽的血清或血浆与脑浓度比的至多2/3，或
[0179]
b.既不包含fc区也不包含肽接头，特别是rhil
‑
12的相同多肽的血清或血浆与脑浓度比的至多1/8。
[0180]
测量是使用钝端26s g hamilton注射器或ced(使用由熔融二氧化硅制成的27g钝端针头，尖端有1mm梯级，内径为0.1mm，壁厚为0.0325mm，递增注射方案为0.2μl/min持续5min，0.5μl/min持续4min和0.8μl/min持续2.5min；总体积5μl，总量1μg)在以1μl/min将1μg颅内注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中后24小时进行的。
[0181]
根据本发明第一方面的融合多肽具有比连接到非修饰的fc区的il
‑
12(il
‑
12fc wt)更低的血清与脑浓度比。由于循环中fcrn介导的再循环，il
‑
12fc wt具有长的血清半衰期。
[0182]
根据本发明第一方面的融合多肽具有比rhil
‑
12更低的血清与脑浓度比，rhil
‑
12显示从脑被动渗漏高。
[0183]
在某些实施方案中，所述多肽对fcrn的亲和力降低通过选自以下的解离常数(k
d
)表征：
[0184]
a.与表征fcrn与包含非修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，增加至少2倍的k
d
，和
[0185]
b.与表征fcrn与包含不同修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，增加至少1.5倍的k
d
，所述不同修饰的fc区即选自iaq(具有突变h310a和h435q)和aaa(具有突变i253a、h310a和h435a)的一个突变体。
[0186]
在某些实施方案中，与表征fcrn与包含非修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，k
d
增加至少3倍。在某些实施方案中，与表征fcrn与包含非修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，k
d
增加至少4倍。在某些实施方案中，与表征fcrn与包含非修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，k
d
增加至少5倍。
[0187]
在某些实施方案中，与表征fcrn与包含所述不同修饰的fc区的相同多肽的结合的k
d
相比，k
d
增加至少2倍。
[0188]
在某些实施方案中，不同修饰的fc区是在253位具有i、在310位具有a并且在435位具有q的fc区(iaq)。
[0189]
在某些实施方案中，不同修饰的fc区是在253位具有a、在310位具有a并且在435位具有a的fc区(aaa)。
[0190]
在某些实施方案中，颅内递送是通过对流增强递送(ced)或其变型实现的。ced是指一种允许药物被直接递送到大脑(
‑
肿瘤)实质的技术。ced过程涉及对大脑的微创手术暴露，然后将小直径导管直接放入大脑，从而绕过血脑屏障。与常规推注和扩散驱动输注方案的主要区别是通过逐渐增加注射直到实现组织内的整体流动而产生的压力梯度。目前，持续时间而不是输注速率决定了到达的组织范围。这种方法实现通常不会进入大脑的大分子药物的递送，以有效地实现大脑(肿瘤)组织内的高浓度。
[0191]
在某些实施方案中，颅内递送通过鞘内递送实现。鞘内给药是指将药物直接给予到脑脊液(csf)中。鞘内给药被定义为在蛛网膜下膜下方将物质施用到大脑中(例如，通过奥马耶贮器)或脊髓中的蛛网膜下腔。非限制性实例是分别使用曲妥珠单抗或利妥昔单抗治疗软脑膜癌病和原发性her2/neu阳性脑肿瘤以及cd20阳性cns淋巴瘤和眼内淋巴瘤的鞘内递送。另一个实例是鞘内施用抗nogoa抗体用于治疗急性脊髓损伤、多发性硬化症或中风。该方法实现通常不会进入大脑的大分子药物的递送，以有效地在软脑膜或脑实质处实现高浓度。
[0192]
在某些实施方案中，颅内递送通过脑室内递送所述多肽来实现。脑室内给药是指借助进入心室腔的导管将药物直接给予到脑脊液(csf)中。
[0193]
在某些实施方案中，颅内递送通过所述多肽的原位产生来实现。原位产生涉及仅在脑或脑肿瘤内或几乎仅在脑或脑肿瘤内局部产生多肽。作为非限制性实例，局部产生可以源自dna制剂、mrna、修饰的mrna、自我复制的mrna、病毒载体、封装的修饰的生产细胞或修饰的t细胞。对局部产生的空间控制可以通过编码多肽的分子或载体的局部递送或通过局部激活多肽的产生来实现。通过局部递送编码多肽的分子或载体的局部产生和随后局部激活多肽的产生可以通过局部或全身给予充当条件表达盒的转录去阻遏物或转录激活物的试剂来实现。实例包括但不限于基于蜕皮激素受体/无脊椎动物类视黄醇x受体的诱导型
基因表达系统或四环素调节的转录调节剂。
[0194]
在某些实施方案中，颅内递送通过将具有归巢能力的经修饰以产生所述多肽的细胞全身递送到肿瘤或cns来实现。多肽可以以组成型或诱导型方式产生。实例包括但不限于修饰的t细胞或间充质干细胞。
[0195]
在某些实施方案中，颅内递送通过从植入的缓释/延长释放/持续释放/控释制剂释放来实现。在本说明书的上下文中，这样的制剂涉及被设计成以预定速率释放药物以在特定时间段内保持恒定药物浓度且副作用最小的剂型。技术人员已知多种适合的制剂。非限制性实例是脂质体、药物
‑
聚合物缀合物、水凝胶、waver或涂覆的纳米颗粒。
[0196]
在某些实施方案中，颅内递送通过所述多肽的鼻内递送来实现。
[0197]
在某些实施方案中，颅内递送通过所述多肽的受体介导的胞吞转运来实现。一个非限制性实例是与tfr以及在患病脑实质中发现的靶标，特别是阿尔茨海默氏病(ad)中的aβ斑块结合的双特异性构建体。
[0198]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是恶性疾病。
[0199]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是胶质瘤。
[0200]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是高分级胶质瘤(hgg)。
[0201]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是继发性脑肿瘤，也称为脑转移瘤。
[0202]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是缺血性脑损伤或脑梗塞、中风、脑缺氧缺血、颅内栓塞或颅内血栓形成。
[0203]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是癫痫、创伤性脑损伤。
[0204]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是脊髓损伤、痴呆、帕金森氏病(pd)、路易体痴呆(lewy bodies)、阿尔茨海默氏病(ad)、额颞叶痴呆(ftd)、家族性额颞叶痴呆(ftd)或肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)。
[0205]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是传染性海绵状脑病，特别是克雅氏病(cjd)、库鲁病、羊痒病、牛海绵状脑病(bse)。
[0206]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是遗传障碍，特别是伴有皮质下梗塞和脑白质病的常染色体显性脑动脉病(cadasil)。
[0207]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是遗传障碍，特别是亨廷顿舞蹈病。
[0208]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是遗传障碍，特别是自闭症、自闭症谱系障碍(asd)，例如，阿斯伯格综合征。
[0209]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是遗传性脑白质营养不良，特别是异染性脑白质营养不良、克拉伯病、卡纳万病、x
‑
连锁肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病。
[0210]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是遗传性代谢障碍，特别是泰
‑
萨二氏病或威尔逊病。
[0211]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是精神障碍，特别是健忘症、注意力缺陷多动障碍、精神病、焦虑性障碍、双相障碍、抑郁症、躁狂症、智力发育障碍、全面发育迟缓、创伤后应激障碍、急性应激障碍、解离性障碍。
[0212]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是癫痫。
[0213]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是自身免疫性脑炎。
[0214]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是多发性硬化症。
[0215]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是视神经脊髓炎(nmo)。
[0216]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是自身免疫性脑炎，特别是抗nmdar脑炎、边缘叶脑炎、lgi1/caspr2
‑
抗体脑炎、桥本脑病、急性播散性脑脊髓炎(adem)、宾斯万格病(皮层下脑白质病)、拉斯马森脑炎。
[0217]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是由病毒，特别是狂犬病病毒、人类疱疹病毒、引起皮疹的病毒、昆虫传播的病毒、蜱传播的病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)引起的感染性脑脊髓炎。
[0218]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是由细菌引起的感染性脑脊髓炎或由寄生虫引起的感染性脑脊髓炎。
[0219]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是由jc多瘤病毒(通常缩写为jcpyv或jcv)引起的进行性多灶性白质脑病(pml)。
[0220]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是感染后脑脊髓炎。
[0221]
在某些实施方案中，影响中枢神经系统的疾病是新生血管性年龄相关性黄斑变性(湿性amd)和糖尿病黄斑水肿或色素性视网膜炎。
[0222]
在本发明的另外的方面，根据本发明的多肽用于预防或治疗影响肺的疾病，所述疾病选自冠状病毒疾病2019、严重急性呼吸综合征、哮喘、过敏性哮喘、严重的不受控制的哮喘、纤维化、囊性纤维化、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、流感、肺水肿、结节病、肺癌、结核病、人正肺病毒、腺鼠疫、肺鼠疫、炭疽、肺部的侵袭性真菌病、肺副球孢子菌病、间质性肺病、特发性肺纤维化和慢性鼻窦炎伴鼻息肉。
[0223]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars
‑
cov
‑
2)引起的冠状病毒疾病2019(covid
‑
19)。
[0224]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是严重急性呼吸综合征(sars)。
[0225]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由病毒，特别是冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征(sars)。
[0226]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是哮喘、过敏性哮喘、严重的不受控制的哮喘或其组合。
[0227]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是慢性阻塞性肺病(copd)。
[0228]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是纤维化、囊性纤维化、肺纤维化或其组合。
[0229]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由流感病毒引起的流感。
[0230]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是结节病(也称为besnier
‑
boeck
‑
schaumann病)。
[0231]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是肺癌。
[0232]
在某些实施方案中，一般而言，影响肺的疾病是由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的。
[0233]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由结核分枝杆菌(通常缩写为结核分枝杆菌(m.tuberculosis)或m.tb)引起的结核病。
[0234]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由合胞病毒人正肺病毒(也称为人呼吸道合胞病毒，或hrsv，或仅rsv)引起的呼吸道感染。
[0235]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由细菌鼠疫耶尔森菌引起的腺鼠疫。
[0236]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由细菌鼠疫耶尔森菌引起的肺鼠疫。
[0237]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是炭疽，一种由细菌炭疽芽孢杆菌引起的感染。
[0238]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由肺真菌病原体，如曲霉菌属、隐球菌属、肺囊虫属和特有真菌引起的侵袭性真菌病(也称为真菌性肺病)。
[0239]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是由真菌巴西副球孢子菌引起的肺副球孢子菌病(通常缩写为pcm)。
[0240]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是慢性鼻窦炎伴鼻息肉(通常缩写为crswnp)，慢性鼻窦炎(crs)的一个亚组。
[0241]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是肺水肿。
[0242]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是间质性肺病。
[0243]
在某些实施方案中，影响肺的疾病是特发性肺纤维化。
[0244]
在本发明的另外的方面，根据本发明的多肽用于预防或治疗影响至少一个关节的疾病，所述疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、假性痛风、骨关节炎、慢性血友病滑膜炎、银屑病性关节炎和强直性脊柱炎。
[0245]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是类风湿性关节炎(ra)。在某些实施方案中，影响关节的疾病是青少年类风湿性关节炎。
[0246]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是痛风，一种由血液中尿酸水平持续升高引起的炎性关节炎的形式。在某些实施方案中，影响关节的疾病是假性痛风。
[0247]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是由关节软骨和下层骨破坏导致的骨关节炎(oa)。
[0248]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是慢性血友病滑膜炎。
[0249]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是银屑病性关节炎，一种发生在受自身免疫性疾病银屑病影响的人中的长期炎性关节炎。
[0250]
在某些实施方案中，影响关节的疾病是强直性脊柱炎(也称为贝克特莱夫病(bekhterev's disease)、贝希德莱氏病(bechterew's disease)或白赫铁列夫症(morbus bechterew))。
[0251]
在本发明的另外的方面，根据本发明的多肽用于预防或治疗影响眼睛的疾病，所述疾病选自葡萄膜黑色素瘤和葡萄膜炎。
[0252]
在某些实施方案中，影响眼睛的疾病是葡萄膜黑色素瘤，一种涉及虹膜、睫状体或脉络膜(统称为葡萄膜)的眼部癌症(黑色素瘤)。
[0253]
在某些实施方案中，影响眼睛的疾病是葡萄膜炎，即葡萄膜的炎症。
[0254]
应理解，根据本发明的多肽可以用于同时和/或相继地预防或治疗本文公开的多种疾病或疾病的组合。在某些实施方案中，fc区是包含人或人源化氨基酸序列的嵌合fc区。
[0255]
在某些实施方案中，fc区是人或人源化fc区。
[0256]
fc区包含突变i253n和h435q和310位的h。
[0257]
在某些实施方案中，fc区是或包含由seq id no 004(nhq)表征的序列。
[0258]
本发明更广泛的方面提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽，其用于预防或治疗疾病。fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰，并且所述多肽通过局部给药递送到受疾病影响的组织。
[0259]
在某些实施方案中，多肽通过眼内给药递送到眼睛。
[0260]
在某些实施方案中，多肽通过关节内给药递送到关节。
[0261]
在某些实施方案中，多肽通过吸入递送到肺。
[0262]
本发明还提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽，其优选地还包含：
[0263]
‑
il
‑
12；或
[0264]
‑
结合于vegfr、ang2、tnfα、il
‑
17、pd
‑
1、pd
‑
l1中任一种的多肽，更优选地结合于vegfr、ang2、tnfα、il
‑
17中任一种的多肽；
[0265]
其用于预防或治疗影响眼睛的疾病，特别是影响眼睛的肿瘤疾病，其中所述fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰，所述fc包含突变i253n和h435q和310位的h(nhq)，并且所述多肽通过眼内给药递送到眼睛。
[0266]
本发明还提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽，其优选地还包含：
[0267]
‑
il
‑
12；或
[0268]
‑
结合于tnfα、il
‑
1ra、il
‑
6r、il
‑
6、cd27、il
‑
22、il
‑
17、cd27中任一种的多肽，更优选地结合于tnfα、il
‑
1ra、il
‑
6r、il
‑
6、cd27中任一种的多肽；
[0269]
其用于预防或治疗影响关节的疾病，其中所述fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰，所述fc包含突变i253n和h435q和310位的h，并且所述多肽通过关节内给药递送到所述关节。
[0270]
本发明还提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽，其优选地还包含：
[0271]
‑
il
‑
12；或
[0272]
‑
il
‑
10；或
[0273]
‑
结合于il
‑
4ra、tnfα、il
‑
5、il
‑
6r、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla
‑
4、il
‑
8、il
‑
21r、cd25、cd20、nf
‑
kb中任一种的多肽，更优选地结合于il
‑
4ra、tnfα、il
‑
5、il
‑
6r、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla
‑
4中任一种的多肽；
[0274]
其用于预防或治疗影响肺的疾病，其中所述fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰，所述fc包含突变i253n和h435q和310位的h，并且所述多肽通过吸入递送到肺。
[0275]
本发明还提供了包含igg的可结晶片段(fc)区，特别是还包含il
‑
12的融合多肽，其中所述fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰，所述fc包含突变i253n和h435q以及310位的h，其用作药物。
[0276]
在某些实施方案中，用于预防或治疗疾病的多肽的可结晶片段(fc)区是或包含序列seq id no 004(nhq)。在某些实施方案中，用作药物的融合多肽的可结晶片段(fc)区是或包含序列seq id no 004(nhq)。
[0277]
局部给药后，对fcrn的降低的亲和力确保进入循环和全身富集的运输减少，从而减少了多肽的任何全身毒副作用。
[0278]
本发明还提供了特异性结合于程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)或程序性死亡配体1(pd
‑
l1)的抗体或抗体样分子，其用于预防或治疗影响中枢神经系统的疾病。抗体或抗体样分子包含具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰i253n和h435q和310位的h的fc区。将抗体或抗体样分子给予中枢神经系统，特别是大脑。
[0279]
用于治疗的抗ox40
[0280]
本发明的另一方面提供了特异性结合于肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)，也称为cd134、ox40或ox40受体的抗体或抗体样分子，其用于预防或治疗影响中枢神经系统的疾病。抗体或抗体样分子包含具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰的fc区。将抗体或抗体样分子给予大脑。
[0281]
本发明还提供了包含igg的可结晶片段(fc)区的多肽。与包含非修饰的fc区的相同多肽的亲和力相比，所述fc区具有导致对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力降低的修饰。所述fc区包含突变i253n和h435q和310位的h。在某些实施方案中，该根据本发明的多肽还包含il
‑
12。
[0282]
在某些实施方案中，所述多肽选自包含效应多肽和所述fc区的融合蛋白；或包含所述fc区或连接到所述fc区的抗体或抗体样分子。
[0283]
在某些实施方案中，所述抗体或抗体样分子是能够同时结合两种抗原的双特异性构建体。
[0284]
在某些实施方案中，所述多肽是包含所述fc区或连接到所述fc区的抗体或抗体样分子，优选地所述抗体或抗体样分子是能够同时结合两种抗原的双特异性构建体，特别地，所述双特异性抗体或抗体样分子以激动性方式结合于pd
‑
l1和il
‑
12受体。
[0285]
技术人员已知在抗体的情况下，抗体本身已经包含fc区。在抗体样分子的情况下，抗体样分子连接到fc区。
[0286]
在某些实施方案中，效应多肽具有以下功能：
[0287]
a.细胞因子或激素或生长因子，
[0288]
b.细胞因子受体或激素受体或生长因子受体，或
[0289]
c.代谢物，
[0290]
并且已知效应多肽对疾病，特别是对影响中枢神经系统的疾病具有治疗或预防作用。
[0291]
在某些实施方案中，效应多肽能够特异性结合于细胞外基质(ecm)并且已知对疾病，特别是对影响中枢神经系统的疾病具有治疗或预防作用。在某些实施方案中，效应多肽能够特异性结合于rna并且已知对疾病，特别是对影响中枢神经系统的疾病具有治疗或预防作用。
[0292]
在某些实施方案中，效应多肽选自包含il
‑
12、il
‑
10、il
‑
2、il
‑
7、ifnα、ifnβ、ifnγ、il
‑
15、tnfα、ctla
‑
4、tgfβ、tgfβrii、gdnf、il
‑
35、cd95、il
‑
1ra、il
‑
4、il
‑
13、il
‑
33、il
‑
23、sirpα、g
‑
csf、gm
‑
csf、ox40l、cd80、cd86、gitrl、4
‑
1bbl、肝配蛋白a1、肝配蛋白b2、肝配蛋白b5、bdnf、c9orf72、nrtn、artn、pspn、cntf、trail、il
‑
4、il
‑
3、il
‑
1、il
‑
5、il
‑
8、il
‑
18、il
‑
21、ccl5、ccl21、ccl10、ccl16、cx3cl1、cxcl16的组，特别地，所述效应多肽是il
‑
12。
[0293]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子选自以激动性或拮抗性方式特异性结合于pd
‑
l1、tnfα、组蛋白、ifnγ、cxcl10、ctla4、pd
‑
1、cd3、ox40、cd20、cd22、cd25、cd28、trem2、il
‑
6、cx3cr1、nogo
‑
a、cd27、il
‑
12、il
‑
12rb1、il
‑
23、il
‑
17、cd47、tgfβ、egfr、egfrviii、her2、pdgfr、tgfr、fgfr、il
‑
4ra、tfr、lfr、ir、ldl
‑
r、lrp
‑
1、cd133、cd111、vegfr、vegf
‑
a、ang
‑
2、il
‑
10、il
‑
10r、il
‑
13rα2、α
‑
突触核蛋白、csf1r、g
‑
csf、gm
‑
csf、gitr、tim
‑
3、lag
‑
3、tigit、btla、vista、cd96、cd147、4
‑
1bb、ccl2、il
‑
1或il
‑
1r、epha2、epha3、ephb2、ephb3、ephb4、lingo
‑
1、l1cam、ncam、sod
‑
1、sigmar
‑
1、sigmar
‑
2、tdp
‑
43、aβ、tau、ifnα、ifnβ、
trpm4、asic1、vgccs、cb1、ttr、htt、jcv、c9orf72的抗体或抗体样分子。
[0294]
根据本发明上述方面的抗体或抗体样分子可以是源自pd
‑
1或pd
‑
l1或pd
‑
l2的生理配体的识别位点的抗体样分子或完整抗体。这样的抗体或抗体样分子分别与生理配体竞争与pd
‑
1或pd
‑
l1或pd
‑
l2的结合。特别地，非激动剂pd
‑
1抗体或抗体样分子或非激动剂pd
‑
l1抗体或抗体样分子或非激动剂pd
‑
l2抗体或抗体样分子当在t细胞表面上结合于pd
‑
1时不导致t细胞活性减弱。
[0295]
在一些实施方案中，本发明中使用的非激动剂pd
‑
1抗体或抗体样分子在结合于pd
‑
1时能够在空间上阻断pd
‑
1与其结合伴侣pd
‑
l1和/或pd
‑
l2的相互作用。
[0296]
在一些实施方案中，所述非激动剂pd
‑
1抗体或抗体样分子是结合于pd
‑
1，而不触发pd
‑
1与其结合伴侣pd
‑
l1和/或pd
‑
l2相互作用的生理反应的γ免疫球蛋白。
[0297]
在一些实施方案中，所述非激动剂pd
‑
l1(pd
‑
l2)抗体或抗体样分子是结合于pd
‑
l1(pd
‑
l2)，而不触发pd
‑
1与其结合伴侣pd
‑
l1和/或pd
‑
l2相互作用的生理反应的γ免疫球蛋白。
[0298]
pd
‑
1抗体的非限制性实例是临床批准的抗体派姆单抗(cas号1374853
‑
91
‑
4)和纳武单抗(cas号946414
‑
94
‑
4)。
[0299]
pd
‑
l1抗体的非限制性实例是临床批准的抗体阿特珠单抗(cas号1380723
‑
44
‑
3)、德瓦鲁单抗(cas号1428935
‑
60
‑
7)和阿维单抗(cas编号1537032
‑
82
‑
8)。
[0300]
目前正在进行临床开发的pd
‑
1/pd
‑
l1或pd
‑
l2抗体的非限制性实例是抗体mdx
‑
1105/bms
‑
936559或amp
‑
224。特异性结合于il
‑
12/23的抗体的非限制性实例是优特克单抗(cas号815610
‑
63
‑
0)。
[0301]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子是特异性结合于pd
‑
l1的抗体。
[0302]
在一些实施方案中，本发明中使用的激动性ox40抗体或抗体样分子能够在结合于ox40并且在不存在ox40配体的情况下在ox40表达细胞中触发信号传导级联反应。
[0303]
ox40抗体的非限制性实例是目前正在进行临床开发的抗体pf
‑
04518600/pf
‑
8600m bms
‑
986178、gsk3174998、moxr0916、incagn01949、他利昔珠单抗/medi0562。
[0304]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子是特异性结合于ox40的抗体。
[0305]
在一些实施方案中，本发明中使用的抗体或抗体样分子能够阻断cd47和sirpα信号之间的相互作用，其防止癌细胞的吞噬作用。
[0306]
cd47阻断抗体或sirpα融合蛋白的非限制性实例是hu5f9
‑
g4、cc
‑
90002/inbrx
‑
103、ibi188、ose
‑
172、ni
‑
1801、dsp107、tti
‑
622、tti
‑
621、alx148和srf231。
[0307]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子是特异性结合于nogo
‑
a的抗体。
[0308]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子是能够同时结合两种抗原的双特异性构建体。
[0309]
在某些实施方案中，抗体或抗体样分子是针对存在于肿瘤坏死核心中的组蛋白的抗体，其武装有il
‑
12。在某些情况下，武装抗体是免疫细胞因子。作为免疫细胞因子的武装抗体的非限制性实例是nhs
‑
il
‑
12、nhs
‑
il2lt、hubc1
‑
il
‑
12。
[0310]
在某些实施方案中，fc区是或包含由seq id no 004(nhq)表征的序列。
[0311]
在本发明任何方面的某些实施方案中，根据本发明的包含修饰的fc区的多肽与fcrn阻断抗体组合使用。fcrn阻断抗体能够抑制包含fc的多肽与fcrn的结合，从而模拟本
发明的技术效果。与fcrn阻断抗体的组合可以增强根据本发明的包含修饰的fc区的多肽的所述优势。
[0312]
在本发明任何方面的某些实施方案中，fc区是免疫球蛋白g(igg)的fc区。igg是人体中人体液免疫应答的主要效应分子。人igg有四个不同的亚组，称为igg1、igg2、igg3和igg4。这四个亚类在重链恒定域的氨基酸序列中显示超过95％的同源性，但在铰链区的结构和灵活性方面存在差异，特别是在该结构域中的重链间二硫键数量上存在差异。igg亚类之间的结构差异也反映在它们对蛋白水解酶，特别是木瓜蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的敏感性上。
[0313]
在本发明任何方面的某些实施方案中，fc区是igg4的fc区。仅已知一种人igg4同种型。与人igg1、igg2和igg3相比，人igg4不激活补体。此外，与igg2和igg3相比，igg4对蛋白水解酶不太敏感。与这些预期相反，已经令人惊讶地发现，在实践中，如由与相应的igg4全长抗体构建体相比所确定的更低的血浆与大脑比所例证的，具有突变i253n和h435q的igg1全长抗体构建体的特征是对fcrn的亲和力较低。
[0314]
类似地，在有需要的患者中治疗或预防恶性肿瘤疾病，特别是实体组织肿瘤，更特别是胶质瘤的用途在本发明的范围内，其包括给予患者根据上述本发明的方面之一的包含修饰的fc区的多肽，或编码所述多肽的核酸或包含编码所述多肽的核酸的病毒载体。
[0315]
类似地，提供了用于预防或治疗恶性肿瘤疾病，特别是实体组织肿瘤，更特别是胶质瘤的剂型，其包含根据上述本发明的方面之一的包含修饰的fc区的多肽或编码所述多肽的核酸或包含编码所述多肽的核酸的病毒载体。
[0316]
在单个可分离特征的供选择方案在本文中被安排为“实施方案”的情况下，应理解这样的供选择方案可以自由组合以形成本文公开的本发明的离散的实施方案。
[0317]
本发明通过以下实施例和附图进一步说明，从中可以得出另外的实施方案和优点。这些实施例旨在说明本发明而不是限制其范围。
[0318]
图1：人il
‑
12fc比il
‑
12具有更好的组织保留。a.鼠il
‑
12fc的结构示意图。rhil
‑
12
–
重组人il
‑
12，hil
‑
12fc
–
人il
‑
12fc，igg4fc
–
人igg4的可结晶片段区。b.实验示意图。将il
‑
12fc的il
‑
12注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。24小时后，评估大脑中注射的蛋白质的剩余量，并与血清中存在的量进行比较。c.通过elisa评估的血清与脑il
‑
12量之比。elisa测量的hil
‑
12作为il
‑
12fc的通用量度。未配对学生t检验。**p<0.005。平均值
±
sd。
[0319]
图2：il
‑
12fc以fcrn介导的方式从大脑输出。a.携带脑肿瘤的wt和fcrn
tg
小鼠被植入渗透泵，所述渗透泵将12.5μg/kg/天的鼠il
‑
12fc直接递送到肿瘤病变中。使用基于珠的阵列测量血清中的鼠il
‑
12水平。组wt mil
‑
12fc与fcrn
tg mil
‑
12fc的未配对学生t检验对比。平均值
±
sd。使用tukey多重比较检验的单向anova。b.如图2a所示处理的小鼠。如使用基于珠的阵列在血清中测量的，处理开始后24小时在循环中存在的il
‑
12的量。平均值
±
sd。c.如图2a所示处理的小鼠。如使用基于珠的阵列在血清中测量的，处理开始后24小时在循环中的ifnγ水平。平均值
±
sd。d.第7天的ifn
‑
γ水平，a中的实验，平均值
±
sd。
[0320]
图3：使用热转变分析法测量的蛋白质稳定性。蛋白质在pbs(a)或人工脑脊液(acsf，b)中孵育。每个il
‑
12fc变体进行五次测量。触须线(whisker)代表最小和最大扩散。
[0321]
图4：il
‑
12fc的fc片段中的突变不影响il
‑
12的生物活性。a.使用hek
‑
blue
tm
il
‑
12分析法测量的il
‑
12的生物活性。ec50
–
导致hek
‑
blue
tm il
‑
12报告细胞产生50％最大信号
的有效浓度，所述hek
‑
blue
tm
il
‑
12报告细胞用0至50ng/ml范围内的il
‑
12fc刺激，每个浓度重复两次。使用比色法用分泌的碱性磷酸酶的活性测量。每个点显示来自独立实验的结果。平均值
±
sd。b.用100ng/ml抗cd3和10ng/ml重组il
‑
12、il
‑
12fc wt或设计用于降低fcrn亲和力的三种变体刺激1小时的外周血单核细胞(pbmc)中的stat
‑
4磷酸化。平均值
±
sd。c.用100ng/ml抗cd3和指定浓度的重组il
‑
12、il
‑
12fc wt或设计用于降低fcrn亲和力的三种变体刺激24小时的pbmc的ifnγ产生。
[0322]
图5：人il
‑
12fc变体的fcrn亲和力降低。a.与固定在表面上的人重组fcrn和液相中的il
‑
12fc变体的fcrn亲和力的表面等离子体共振(spr)测量。在ph＝6.0下测量亲和力。数据归一化到il
‑
12fc wt。b.结合于人fcrn的il
‑
12fc变体。通过elisa在ph＝6.0下测量。平均值
±
sd。
[0323]
图6.血液中和注射的脑半球中il
‑
12fc的浓度比。a.将1μg的il
‑
12fc wt或nhq变体注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。24小时后，通过elisa评估注射的脑半球中和血清中il
‑
12的量，计算它们的比率并将其归一化到il
‑
12fc wt组的比率。每组4只小鼠。未配对学生t检验。*p<0.05。平均值
±
sd。b.使用对流增强递送(ced)将1μg的il
‑
12fc wt、iaq、aaa或nhq注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。24小时后，通过elisa评估注射的脑半球中和血浆中il
‑
12的量，计算它们的比率并将其归一化到il
‑
12fc wt组的比率。每组7
‑
8只小鼠。使用tukey多重比较检验的单向anova。平均值
±
sd。
[0324]
图7：用il
‑
12fc变体局部治疗后的大脑保留。使用对流增强递送(ced)将1μg的il
‑
12fc wt、iaq、aaa或nhq注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。注射后6小时通过elisa测量脑组织中剩余的il
‑
12fc的量，并归一化到il
‑
12fc wt。使用tukey多重比较检验的单向anova。异常值去除。平均值
±
sd。
[0325]
图8：a.天然和rmil
‑
12、mil
‑
12higg4 wt、mil
‑
12higg4 nhq和mil
‑
12higg1:抗hpd
‑
l1 nhq的结构示意图。b.使用hek
‑
blue
tm
il
‑
12分析法测量的鼠il
‑
12构建体的生物活性。使用5到8个稀释步骤，用0到50ng/ml范围内的il
‑
12或il
‑
12fc变体刺激hek
‑
blue
tm
报告细胞，每个浓度重复两次。使用比色法用分泌的碱性磷酸酶的活性测量。x轴值：浓度绘制为il
‑
12分子的相应量，以pmol/ml为单位。代表两个单独实验。c.与完整抗pd
‑
l1(阿特珠单抗)抗体相比，与细胞上的pd
‑
l1的结合。用鼠干扰素γ(ifnγ)刺激gl
‑
261:luc或pd
‑
l1缺乏的gl
‑
261:luc(pd
‑
l1 ko)细胞，以刺激pd
‑
l1表达，用抗pd
‑
l1抗体或h/mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq变体染色。使用抗人igg
‑
pe二抗检测细胞结合的抗体。d.如通过表面等离子体共振(spr)测量的nhq突变变体与wt相比对fcrn的亲和力。固定在表面的人重组fcrn和液相中的pd
‑
l1结合物。在ph＝6下测量亲和力。亲和力常数k
d
以nm为单位。
[0326]
图9：用于脑癌局部治疗的优化的il
‑
12fc融合导致全身暴露减少，而不影响治疗效果。
[0327]
a.肿瘤注射后以天数计的实验时间轴。携带gl
‑
261:luc脑肿瘤的动物在第20天通过生物发光成像(bli)系统地分配到具有相当的肿瘤负荷的治疗组，并且在肿瘤植入后第21天和第28天通过对流增强递送(ced)仅使用缓冲液(对照)或1μg的rmil
‑
12、mil
‑
12hfc:抗pd
‑
l1双功能分子、mil
‑
12hfc wt或mil
‑
12hfc nhq处理。在以下时间点采集血液以获得血浆：ced注射后0小时、6小时、24小时、72小时、7天以及第二次ced注射后14天。
[0328]
b.通过生物发光成像监测治疗后的肿瘤进展。由单个动物的目标区域(roi)绘制
平均辐射亮度(p/s/cm2/sr)，按治疗群组分组。通过垂直虚线表示通过ced的处理。
[0329]
c.响应治疗的il
‑
12(黑线，左侧y轴)和ifnγ(灰线，右侧y轴)的血浆水平。通过基于珠的细胞因子阵列在给定时间点测量。通过垂直虚线表示通过ced的处理。
[0330]
d.第21天ced后6小时血浆il
‑
12水平的fcrn亲和力依赖性差异。向小鼠注射了mil
‑
12hfc wt和mil
‑
12hfc nhq。实验数据如a
‑
c所示。
[0331]
e.来自a
‑
d的处理的小鼠存活率的kaplan
‑
meyer分析。每组5
‑
7只小鼠。通过ced的治疗由垂直虚线表示。
[0332]
图10：抗体
[0333]
a.与固定在表面的人重组fcrn和液相中的igg1变体的fcrn亲和力的表面等离子体共振(spr)测量。在ph＝6.0下测量亲和力。数据归一化到具有非修饰的fc(wt)的igg1抗体。三个另外的具有非修饰的fc部分的igg1临床级抗体用作另外的参考(igg1_01伊匹单抗，igg1_02阿特珠单抗，igg1_03利妥昔单抗)。平均值
±
sd。
[0334]
b.使用对流增强递送(ced)将1μg的igg1 wt、iaq、aaa或nhq变体注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。24小时后，通过elisa评估注射的脑半球中和血浆中人igg的量，计算它们的比率并将其归一化到il
‑
12fc wt组的比率。每组5只小鼠。平均值
±
sd。
[0335]
c.与固定在表面的人重组fcrn和液相中的igg4变体的fcrn亲和力的表面等离子体共振(spr)测量。在ph＝6.0下测量亲和力。数据归一化到具有非修饰的fc(wt)的igg4抗体。具有非修饰的fc部分的第二igg4抗体(纳武单抗)用作另外的参考(igg4)。平均值
±
sd。
[0336]
d.使用对流增强递送(ced)将1μg的igg4 wt、iaq、aaa或nhq变体注射到fcrn
tg
小鼠的纹状体中。24小时后，通过elisa评估注射的脑半球中和血浆中人igg的量，计算它们的比率并将其归一化到il
‑
12fc wt组的比率。每组5只小鼠。平均值
±
sd。
[0337]
实施例1：材料和方法
[0338]
动物
[0339]
c57bl/6j小鼠获自charles river。mfcrn
‑
/
‑
hfcrn
tg(32)
(fcrn
tg
)小鼠获自the jackson laboratory(库存号014565)。所有动物都根据机构指南在无特定病原体(sph)条件下以12小时亮/暗循环内部饲养，随意提供食物和水。
[0340]
肿瘤细胞系
[0341]
gl
‑
261细胞由瑞士苏黎世的苏黎世大学实验免疫学的a.fontana提供，并在补充有10％热灭活胎牛血清和l
‑
谷氨酰胺(均来自thermo fisher scientific)的dmem中培养。鼠gl
‑
261脑肿瘤细胞系(与c57bl/6同系)用pgl3
‑
ctrl和pgk
‑
puro(promega)稳定转染，并用嘌呤霉素(sigma
‑
aldrich)选择以产生荧光素酶稳定的gl
‑
261细胞。为了产生gl
‑
261:luc pd
‑
l1 ko肿瘤细胞，细胞用经修饰以表达以下sgrna的化脓性链球菌cas9 p2a gfp
‑
单向导rna(sgrna)表达载体(px458；addgene)瞬时转染：5'
‑
gtatggcagcaacgtcacga
‑
3'。转染后3天，通过在ifn
‑
γ刺激(10ng/ml)48小时后对pd
‑
l1阴性细胞进行门控，通过流式细胞术纯化gfp阳性的pd
‑
l1 ko细胞。在用于实验之前，进一步扩增了单个克隆，并通过流式细胞术重新确认了pd
‑
l1表达的丧失。
[0342]
外科手术
[0343]
对于胶质瘤接种，使用芬太尼(helvepharm ag)、咪达唑仑(roche pharma ag)和美托咪定(orion pharma ag)的混合物麻醉6
‑
10周龄小鼠。使用立体定向机器人
(neurostar)将gl261细胞颅内(i.c.)注射到右脑半球中。简言之，将钝端注射器(hamilton；75n，26s/2”/2，5μl)放置在前囟的侧向1.5mm和正面1mm处。将针头向下放入钻孔至硬脑膜表面下方4mm的深度并缩回1mm以形成小贮器。以1μl/min、2μl的量进行注射。将针头留在原位2min后，以1mm/min的速度缩回。钻孔用骨蜡(aesculap，braun)封闭，头皮伤口用组织胶(indermil，henkel)密封。使用氟马西尼(labatec pharma ag)和丁丙诺啡(indivior schweiz ag)的混合物中断麻醉，20min后注射阿替美唑(janssen)。卡洛芬(pfizer ag)用于围手术期镇痛。
[0344]
7到14天后，将渗透泵(型号2004，0.25μl/h；alzet)充满鼠il
‑
12fc(12.5μg/kg/24h)或单独的pbs，并在37℃下在pbs中备用。如上麻醉小鼠，定位先前胶质瘤注射的钻孔，去除骨蜡和骨膜骨，将输液套管向下通过钻孔3mm进入推测的肿瘤中心。从泵植入的第
‑
1天开始，使用真空采血管并遵循制造商的说明(becton,dickinson and company)，每两天通过从尾静脉采血收集血清样品。
[0345]
为了比较推注后il
‑
12和il
‑
12fc wt血清与脑浓度比，将小鼠麻醉并使用如上所述用于肿瘤细胞注射的立体定向机器人(neurostar)在右脑半球中颅内注射。小鼠接受100ng重组人il
‑
12(prospec)或等量的il
‑
12fc(69ng/小鼠)。基于hek
‑
blue il
‑
12生物活性分析法计算剂量。24小时后通过受控的co2窒息处死动物。通过心脏穿刺收集血液样品，并用20ml冰冷的pbs灌注小鼠。如上所述分离血清并将脑组织在液氮中速冻。
[0346]
为了比较推注后il
‑
12 wt和il
‑
12fc nhq血清与脑浓度比，将小鼠麻醉并使用如上所述用于肿瘤细胞注射的立体定向机器人(neurostar)在右脑半球中颅内注射。小鼠接受1μg的人il
‑
12fc wt或il
‑
12fc nhq。24小时后通过受控的co2窒息处死动物。通过心脏穿刺收集血液样品，并用20ml冰冷的pbs灌注小鼠。如上所述分离血清并将脑组织在液氮中速冻。
[0347]
为了将蛋白质对流增强递送(ced)到大脑中，将小鼠麻醉并使用立体定向机器人(neurostar)和使用27g钝端针头制成的导管在右脑半球中颅内注射，所述27g钝端针头由熔融石英制成，尖端有1mm梯级，内径为0.1mm，壁厚为0.0325mm。简言之，在前囟的前后1mm和中间外侧2mm的位置处进行钻孔。将导管向下放入钻孔至硬脑膜表面下方3.5mm的深度。以0.2μl/min、5μl的量进行注射，然后以0.5μl/min、2μl的量进行注射，以及以0.8μl/min、2μl的量进行注射。将针头留在原位2min后，以1mm/min缩回。小鼠接受1μg重组人il
‑
12fc wt、il
‑
12fc iaq、il
‑
12fc aaa、il
‑
12fc nhq或rmil
‑
12、mil
‑
12hfc wt、mil
‑
12hfc hnq、mil
‑
12hfc:pd
‑
l1 nhq、flu ha3.1 wt、flu ha3.1 iaq、flu ha3.1 aaa、flu ha3.1 nhq或阿特珠单抗wt、阿特珠单抗iaq、阿特珠单抗aaa或阿特珠单抗nhq。6小时后通过受控的co2窒息处死动物。将同侧脑半球在液氮中速冻。
[0348]
体内生物发光成像
[0349]
向荷瘤小鼠注射d
‑
荧光素(150mg/kg体重；xenolight d
‑
荧光素钾盐；biovision7903
‑
1g；15mg/ml的pbs溶液)。将动物转移到xenogen ivis lumina iii(perkinelmer)成像系统的暗室，并记录发光1到2分钟，中等像素组合(4)。随后使用living image 4.7.1软件(perkinelmer)分析数据。在肿瘤部位周围定义一个圆形目标区域(roi；1.5cm直径)，读出并绘制该区域的光子通量。
[0350]
bli和系统组分配
[0351]
在植入gl
‑
261luc胶质瘤细胞后第20天，将荷瘤动物分配到等均bli的实验组。
[0352]
采血
[0353]
在ced前10分钟或ced注射后6小时、24小时、72小时、7天采集血液样品。从尾静脉将20至50ul血液采集到含有干燥k2
‑
edta(becton,dickinson and company)的微量容器中。以10’000g离心5分钟后，将血浆转移到新管并冷冻。
[0354]
fcrn elisa
[0355]
将用作对照的il
‑
12fc变体或重组人igg4抗gfp抗体(克隆515，abd serotec)包被在微孔板(greinerbio
‑
one)上。组氨酸偶联的fcrn(r&d systems)在elisa稀释剂(mabtech)中以升高的浓度在ph＝6.0下孵育。通过生物素化抗his抗体(克隆13/45/31
‑
2，dianova)、链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(mabtech)和比色底物(chromogen
‑
tmb，thermo fisher scientific)检测fcrn。使用分光光度计(molecular devices)测量450nm波长处的光密度。
[0356]
基于珠的细胞因子阵列
[0357]
使用legendplex mouse inflammation panel(biolegend)按照制造商的说明测量mil
‑
12和mifnγ的血清水平。使用lsrii fortessa(becton,dickinson and company)获得样品。使用flowjo 10.6版(tree star)进行数据分析。
[0358]
hek
‑
blue il
‑
12生物活性分析
[0359]
将hek
‑
blue il
‑
12细胞(invivogen)以50000个细胞/孔的密度铺在平底96孔板(corning)上含有诺莫辛(normocin)(invivogen)的培养基中。将细胞与增加量的il
‑
12、il
‑
12fc wt或设计用于降低fcrn亲和力的变体一起孵育17小时。收集培养基并在quanti
‑
blue检测试剂(invivogen)的存在下孵育2小时。使用台式分光光度计(molecular devices)在640nm处测量吸光度。
[0360]
注射到大脑中后，脑、血浆和血清中的人il
‑
12的检测和血清或血浆与脑浓度比的计算
[0361]
在含有0.05％吐温20和0.1％bsa的pbs中稀释样品，并且通过用于hil
‑
12p70的elisa(mabtech)评估il
‑
12水平。为了计算血清或血浆与脑浓度比，血清或血浆中il
‑
12的浓度以pg/ml为单位表示，而脑中的浓度通过将针对蛋白质提取功效校正的从脑中提取的il
‑
12的总量除以脑半球重量进行计算(pg/mg脑组织)。
[0362]
注射到大脑中后，脑和血浆中的人igg的检测和血浆与脑浓度比的计算
[0363]
在含有0.05％吐温20和0.1％bsa的pbs中稀释样品，通过elisa评估igg水平。简言之，用多克隆驴抗人igg(jackson immunoresearch)包被板，用含有0.05％吐温20和0.1％bsa的pbs封闭。用多克隆山羊抗人igg(sigma
‑
aldrich)检测分析物，并用多克隆驴抗山羊hrp偶联抗体(promega)进行扩增。为了计算血浆与大脑比，血浆和大脑中的人igg的浓度均以pg/ml描述。
[0364]
人igg1变体、igg4变体hil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq和mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq的产生
[0365]
igg4变体在瞬时转染的人胚肾(hek)细胞培养物中表达。igg1变体、hil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq和mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq由瞬时转染的中国仓鼠卵巢(cho)或细胞培养物产生。简言之，收集培养物上清液并通过亲和色谱(蛋白g)纯化蛋白质。通过离子交换(iec)和尺寸排阻色谱(sec)进一步纯化蛋白质。使用离心柱(sartorius，30kda截止值)浓缩蛋白
质。蛋白质储存在20mm组氨酸、150mm nacl、ph＝6.0的缓冲液中。根据标准方案，通过凝胶电泳(sds
‑
page)接着是考马斯染色评估质量。纳武单抗、阿特珠单抗、伊匹单抗和利妥昔单抗可商购获得。
[0366]
il
‑
12fc刺激的淋巴细胞的ifn
‑
γ产生
[0367]
在100ng/ml抗cd3抗体的存在下，用浓度增加的il
‑
12、il
‑
12fc或具有降低的fcrn亲和力的il
‑
12fc变体刺激人外周血单核细胞(pbmc)24小时。按照制造商的说明(mabtech)通过elisa测量上清液中的ifn
‑
γ水平。
[0368]
脑蛋白分离
[0369]
安乐死并小心去除头盖骨后，分离出大脑。去除小脑和嗅球，沿中线分离脑半球，并将注射的(同侧)半球在液氮中速冻。通过在含有halt蛋白酶抑制剂混合物(thermo fisher scientific)的冰冷裂解缓冲液(cell signaling)中匀浆制备脑裂解物。每10mg脑组织加入0.1ml裂解缓冲液。用剪刀剪碎脑组织，然后通过20g针头，最后超声20秒。样品在4℃下以15000g离心10分钟，然后将上清液转移到新的管中。使用pierce bca分析试剂盒(thermo fisher scientific)测量蛋白浓度，并使用该数据校正每个实验中的蛋白质提取效率。
[0370]
蛋白质表达和纯化
[0371]
所有人和鼠il
‑
12fc变体都在hek239t中表达。通过使用蛋白g琼脂糖凝胶(biovision)的亲和色谱和用pbs透析过夜，从培养物上清液中纯化保留蛋白g亲和力的变体。失去蛋白g亲和力的变体通过用50％饱和度的硫酸铵(vi)沉淀，然后用pbs溶解沉淀物并在陶瓷羟基磷灰石(cht)柱(ii型，40μm bio
‑
rad)上纯化来纯化。在蛋白g或cht色谱后，在pure色谱系统(ge healthcare)上使用二乙氨基乙醇连接的琼脂糖凝胶作为阴离子交换剂(hitrap deae琼脂糖凝胶ff柱，ge healthcare)，通过离子交换色谱进一步纯化样品。最后，所有il
‑
12fc变体都通过尺寸排阻色谱在色谱系统(ge healthcare)上使用预装填的superose 6柱(ge healthcare)进行纯化。使用具有30kda截止值的vivaspin 2ml离心柱(ge healthcare)浓缩二聚体部分。蛋白质纯度通过sds
‑
page电泳，然后用考马斯亮蓝(vwr life science)染色验证。使用pierce bca分析试剂盒(thermo fisher scientific)并通过用于il
‑
12p70的elisa(becton,dickinson and company)测量蛋白浓度。
[0372]
il
‑
12fc刺激的淋巴细胞对stat
‑
4的磷酸化
[0373]
在100ng/ml抗cd3的存在下，用10ng/ml的il
‑
12、il
‑
12fc或具有降低的fcrn亲和力的il
‑
12fc变体刺激人外周血单核细胞(pbmc)1小时。然后使用pierce ripa缓冲液(thermo fisher scientific)裂解细胞。通过sds
‑
page电泳，然后使用trans
‑
blot turbo印迹系统(bio
‑
rad laboratories,inc.)转移并用抗stat4 py693(克隆38/p
‑
stat4，becton，dickinson and company)染色分析样品。使用ecl清晰底物(clarity substrate)(bio
‑
rad laboratories,inc.)进行条带可视化并在biorad mpcd成像仪(bio
‑
rad laboratories,inc.)上检测。
[0374]
表面等离子体共振
[0375]
使用proteon xpr36系统(bio
‑
rad laboratories,inc.)进行spr，将人重组生物
素化fcrn(immunitrack)包被在proteon nlc传感器芯片上至约80个响应单位(ru)。il
‑
12fc变体在10mm柠檬酸钠缓冲液ph＝6.0中运行，浓度以三倍梯级从729nm降低到9nm。解离时间为600秒。使用对注射时间的数据归一化、点间(interspot)背景去除和内置伪像去除功能，使用proteon manager软件(bio
‑
rad laboratories,inc.)进行分析。使用平衡分析模型计算kd。
[0376]
热转变分析
[0377]
简言之，将0.2mg/ml的蛋白质样品与稀释至1:1000(sigma
‑
aldrich)的sypro orange蛋白染色剂混合，并在cfx384热循环仪(biorad)上运行，每30秒温度升高0.2℃，从20℃到至95℃，以荧光作为读数。变性温度被确定为荧光相对温度的一阶导数。实验在作为溶剂的pbs和人工脑脊液(acsf；125mm nacl，26mm nahco3，1.25mm nah2po3和2.5mm kcl)中进行。
[0378]
统计分析
[0379]
使用graphpad prism 5软件进行统计分析。根据grubb检验(49)，从最终分析中去除异常值。使用非配对学生t检验比较两组。使用单向anova和tukey多重比较检验比较了两个以上的组。
[0380]
流式细胞术pd
‑
l1结合分析
[0381]
gl261:luce9或gl261:luce9:pd
‑
l1ko细胞在以终浓度为20ng/ml添加鼠干扰素
‑
γ的情况下培养过夜。第二天，用dpbs冲洗细胞。将胰蛋白酶
‑
edta(invitrogen 25300
‑
054)添加到烧瓶并立即再次去除。使细胞静置以与烧瓶脱离2
‑
5min。将其用培养基冲洗并在350g下在4℃下离心5min。随后，将细胞以每孔100,000个细胞铺到圆底96孔板中，并用dpbs冲洗两次。
[0382]
染色在pbs中进行，每孔25μl，所述孔包含以1:200稀释的zombie aqua可固定活力试剂盒(biolegend)和最终浓度为0.1mg/ml的人抗pd
‑
l1(阿特珠单抗)或m/hil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq。细胞在4℃下避光染色20min。在用pbs进行的洗涤步骤后，将细胞与0.2mg/ml的二抗抗人igg
‑
fc
‑
pe(biolegend，目录编号409304，批次b260868)或抗小鼠
‑
pd
‑
l1
‑
bv421(biolegend，目录编号124315，批次b228149)对照抗体(数据未显示)在pbs中在4℃下避光孵育30min。细胞用pbs冲洗两次，通过40μm网过滤并使用lsrii fortessa流式细胞仪(becton,dickinson and company)采集。使用flowjo 10.6版(tree star)进行数据分析。
[0383]
生存分析
[0384]
检查荷瘤动物的神经系统症状并每周称重直到肿瘤细胞植入后第21天。从第21天起，监测频率增加到每日检查和每周生物发光成像(bli)。根据州立兽医局(zh 194/19)，在达到预定的停止标准(体重减轻超过峰值体重的20％和/或垂死)后，通过受控的co2窒息对动物实施安乐死。
[0385]
实施例2：颅内注射人il
‑
12比hil
‑
12fc具有更高的全身渗漏
[0386]
il
‑
12fc用于脑肿瘤的局部治疗很有前景。然而，为了用于临床试验，需要il
‑
12fc的人形式，其需要显示类似的特性。为了获得鼠il
‑
12igg3的人类似物，发明人将单链人il
‑
12与人免疫球蛋白g4(higg4)的可结晶片段(fc)融合(图1a)。与migg3类似，higg4不支持抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，也不激活补体系统。为了测试比较人il
‑
12fc(hil
‑
12fc)与重组人il
‑
12(rhil
‑
12)的渗漏和稳定性，发明人将单次推注剂量注射到在鼠fcrn
缺陷背景(fcrntg)上表达人fcrn的转基因小鼠的纹状体中(postow等人.,2015,n engl j med 372:2006
–
2017；kamran等人.,2016,expert opin biol ther 16:1245
–
1264)。24小时后，发明人分析了同侧半球裂解物和血清中的人il
‑
12的浓度，以了解更多关于注射部位的稳定性和保留(残留浓度)以及渗漏到血流的速度(图1b)。对于每只小鼠，发明人计算了血清中的浓度与注射部位的浓度比，作为对组织保留的估计值。将血清水平与注射部位的局部浓度进行比较，hil
‑
12fc显示出优于rhil
‑
12的优异的组织保留，因为发明人观察到相当低的比率(图1c)。对于局部gb治疗，人il
‑
12fc融合细胞因子与其天然对应物相比似乎是一种优异的化合物，因为它具有更高的组织保留、稳定性和溶解性。
[0387]
实施例3：fcrn结合导致il
‑
12fc的全身累积
[0388]
内皮细胞和红髓巨噬细胞中基于新生儿fc受体(fcrn)的内体再循环系统防止igg的快速降解和清除。在胞饮作用之后，在内体的酸性ph的促进下，fcrn结合igg并将其再循环到细胞表面，在细胞表面中性ph诱导其释放。当局部注射时，由于其fc标签，il
‑
12fc可以以fcrn介导的方式从大脑渗漏。从大脑渗漏导致il
‑
12fc血清累积，最终可能达到毒性水平。为了测试基于fcrn的再循环是否确实促进了hil
‑
12fc在血清中的积累，发明人利用在鼠fcrn缺陷背景(fcrntg)上表达人fcrn的转基因小鼠。由于人fcrn对鼠igg的亲和力弱，但促进正常的白蛋白再循环，因此在该小鼠模型中只有鼠igg再循环受损。因此，在这些fcrn人源化小鼠中，鼠il
‑
12fc与fcrn的结合应明显更少。因此，发明人比较了通过渗透微泵用局部鼠il
‑
12fc治疗的携带胶质瘤的野生型(wt)和fcrntg小鼠的血清mil
‑
12水平。事实上，一周后，发明人观察到wt小鼠中il
‑
12水平升高，这在fcrntg小鼠中不太明显(图2a)，随后ifn
‑
γ水平升高(图2d)。发明人甚至早在泵植入后第1天就观察到一些小鼠血清中il
‑
12的水平升高(图2b)。因此，这导致wt小鼠中ifn
‑
γ血清水平显著升高，而fcrntg群组中的情况并非如此(图2c)。与鼠il
‑
12fc类似，人il
‑
12fc也很可能会渗漏和累积，构成全身性副作用的威胁。此外，ifn
‑
γ是il
‑
12相关副作用的主要介质之一(leonard等人,1997,blood 90:2541
–
2548)，并且其持续的全身存在会是有毒的(weiss等人,2007,expert opin biol ther 7:1705
–
1721)。综上所述，发明人得出结论，是从治疗部位渗漏甚至微量的il
‑
12fc也足以触发可检测的血清ifn
‑
γ水平。
[0389]
实施例4:设计用于改善组织保留的人il
‑
12fc变体的生成
[0390]
减少的fcrn结合可能会消除从大脑的输出并导致从大脑渗漏出来时显著减少的再循环的观察结果可用于增加hil
‑
12fc的安全界限。因此，发明人着手降低hil
‑
12fc的fc部分与人fcrn的结合。通过增加fc部分的fcrn结合界面的正电荷，这种在酸性ph下的相互作用
‑
因此再循环
‑
可以被消除，这显示降低了免疫球蛋白的血清半衰期。发明人在hil
‑
12fc的fcrn结合位点处将许多突变引入hil
‑
12fc中(表1)，目的是在渗漏的情况下降低其血清半衰期。
[0391]
发明人已经生成了三种il
‑
12fc变体，其突变类似于先前公开的具有降低的fcrn亲和力的抗体，称为iaq、ahh和aaa。此外，发明人未将253位的异亮氨酸替换为代表侧链的简单缩短的丙氨酸，而是将其改变为天冬酰胺(i253n)。天冬酰胺是一种极性氨基酸，其侧链的长度与异亮氨酸相似。发明人还将310位的组氨酸修饰为丙氨酸，并将435位的组氨酸修饰为谷氨酰胺、丙氨酸或谷氨酸。
[0392]
所有变体均在人胚肾293t细胞(hek293t)培养物中表达。所有变体的表达水平相
似。
[0393]
实施例5：人il
‑
12fc变体具有相似的蛋白稳定性
[0394]
首先，发明人已经验证了引入到fc的变化是否影响整体蛋白稳定性。为此，发明人在pbs以及在人工脑脊液(acsf)中进行的热转变分析中测量了每种变体的变性温度。所有变体的变性温度都在60℃左右波动(图3a)。在acsf中进行的测量证实，所有变体都具有相似的稳定性，但整体变性温度较低
‑
大约57℃(图3b)。
[0395]
实施例6：人il
‑
12fc变体维持其生物活性
[0396]
尽管发明人的目的是降低hil
‑
12fc与fcrn的结合，但发明人不能排除这些变化对il
‑
12生物活性有影响。这首先使用稳定转染了il
‑
12信号传导组分的hek细胞系和催化比色反应的下游酶进行了测试。与il
‑
12fc相比，只有naq变体显示活性降低了大约2倍，而所有其他变体的ec50都在il
‑
12fc wt的范围内(图4a)。重要的是，il
‑
12fc在体外具有与ril
‑
12相当的活性。
[0397]
为了进一步验证il
‑
12fc变体的活性，发明人用三种不同的hil
‑
12fc变体，即iaq、ahq和nhq进行了外周血单核细胞(pbmc)的活化，然后分析了stat
‑
4磷酸化(图4b)。更重要的是，这种stat
‑
4磷酸化在24小时后转化为稳健的ifn
‑
γ产生(图4c)，表明所有变体都保留了rhil
‑
12的活性。
[0398]
实施例7：人il
‑
12fc变体在与蛋白g的结合方面不同
[0399]
蛋白a和g亲和色谱属于用于纯化重组抗体和fc融合蛋白的标准方法。已知修饰fc和fcrn之间的界面可消除蛋白a结合，该观察结果也被发明人用il
‑
12fc变体证实。为了确认在放大过程中制备的可行性，发明人决定验证通过蛋白g亲和柱纯化il
‑
12fc变体的可能性。大多数发明人的变体保留了对蛋白g的亲和力，但令发明人惊讶的是，所有包含i253n和h310a突变二者的变体都不适合蛋白g纯化(表2)。该影响与435位的另外的突变无关。为了进一步研究，发明人已将他们的注意力集中在具有保留的蛋白g亲和力的变体上。
[0400]
实施例8：人il
‑
12fc变体具有降低的fcrn亲和力
[0401]
为了验证il
‑
12fc变体对fcrn的亲和力，发明人使用了表面等离子体共振(spr)，一种表征蛋白
‑
蛋白相互作用的无标记方法。发明人固定了人fcrn并测量了il
‑
12fc变体在不同浓度下在溶酶体ph范围(ph＝6.0)内的结合(43)。如图5a所示，大多数修饰的il
‑
12fc变体对人fcrn的亲和力降低，其中nhq变体表现出最强的降低(大约低8倍)。发明人使用可商购的人单克隆抗gfp igg4抗体作为对照。
[0402]
此外，发明人使用il
‑
12fcwt、抗gfpigg4和公开的变体iaq作为参考，用nhq构建体的elisa数据证实了这些数据。iaq和nhq二者显示出结合降低，其中nhq的亲和力最低(图5b)。发明人因此得出结论，nhq的置换组合似乎最显著地降低了与fcrn的结合。这与kenanova及其同事(kenanova等人.,2005,cancer research 65:622
–
631)的结果形成对比，他们认为组合的突变h310a和h435q导致在低ph下与fcrn结合的减少最强。
[0403]
实施例9：nhq突变的引入减少了对局部递送的hil
‑
12fc的全身暴露
[0404]
发明人假设降低fcrn亲和力将增加hil
‑
12fc在cns中的保留，并同时阻止其全身累积。这以与hil
‑
12fc wt和重组人il
‑
12的比较类似的方式得到解决(图1b)。向fcrn
tg
小鼠注射单剂量的1μg il
‑
12fc wt或nhq变体，并通过elisa测量同侧脑半球中和血清中的il
‑
12。与注射了hil
‑
12fc wt的小鼠相比，注射了nhq变体的小鼠显示更低的血清与脑比(图
6a)。发明人推测这可能是在cns中增加的保留以及由于fcrn介导的再循环导致的减弱的全身累积两者的作用。
[0405]
此外，发明人使用ced代替推注，比较了ced后24小时血浆和注射半球中hil
‑
12fc wt、iaq、aaa和nhq的浓度，并观察到与推注相比，在优化的递送环境中nhq变体也表现出最显著降低的血浆与脑比(图6b)。这种与降低的全身暴露合并的增加的cns保留可能会改善局部il
‑
12fc治疗的安全性。
[0406]
实施例10：il
‑
12fc变体nhq比其他低亲和力变体具有更高的脑组织保留
[0407]
发明人测量了颅内递送蛋白质后的组织保留。为此，发明人注射了1μg未修饰的il
‑
12fc wt，两种先前公开的具有降低的fcrn亲和力的变体，即iaq和aaa，以及根据发明人的测量具有最低fcrn亲和力的变体nhq(图5a)。为了确保脑半球的最大灌注，发明人使用了具有梯级导管和递增注射方案的ced方案代替蛋白质溶液的推注。为了研究在大多数生理环境中在fcrn结合界面的不同修饰的影响，发明人采用fcrn
tg
小鼠。如前所述，fcrn对于从cns输出和血清中含fc分子的累积二者都很重要。为了将这两种影响解耦并仅专注于防止从cns转运，发明人测量了ced后6小时留在大脑中的蛋白的量。将小鼠安乐死，用pbs灌注，分离同侧脑半球中的总蛋白并通过elisa测量hil
‑
12。如图7所示，与il
‑
12fc wt相比，il
‑
12fc nhq具有优异的组织保留。重要的是，它也优于两种其他具有降低的fcrn亲和力的变体iaq和aaa。令人惊讶的是，iaq和aaa与il
‑
12fc wt没有显著差异。
[0408]
实施例11：体内抗肿瘤作用
[0409]
人il
‑
12仅与鼠il
‑
12受体的交叉反应性差。这意味着为了在鼠模型中研究体内抗肿瘤作用，必须使用替代分子。为了测试对fcrn亲和力降低的影响，发明人将单链鼠il
‑
12融合到与hil
‑
12fc相同的人igg4 fc(图8a)。
[0410]
il
‑
12诱导ifnγ在靶细胞(例如t细胞和nk细胞)中的表达(tugues等人.,cell death and differentiation(2015),22:237
‑
246))。反过来，ifnγ可以在称为适应性耐药的过程中导致骨髓细胞和肿瘤细胞上pd
‑
l1的上调(o’rourke等人.,sci.transl.med.(2017),(9),eaaa0984.)。发明人推断pd
‑
l1因此将用作诱导锚定物(anchor)以进一步增加il
‑
12组织保留。
[0411]
为了评估il
‑
12fc与局部施用的抗pd
‑
l1抗体治疗组合的功效，生成了双特异性fc融合分子。它结合了mil
‑
12hfc与抗pd
‑
l1半抗体以及含有nhq突变的higg1 fc。杵臼(knobs
‑
into
‑
holes)方法用于异二聚体重链组装(ridgway等人.,protein eng(1996),9:617
‑
621)。抗pd
‑
l1半分子源自阿特珠单抗，其为一种临床上批准的抗体，可与鼠和人pd
‑
l1交叉反应(us 8217149b2)(图8a)。
[0412]
发明人在体外证实了mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq分子的生物活性：对于il
‑
12功能，使用了il
‑
12敏感报告细胞系，il
‑
12导致碱性磷酸酶分泌，其转而催化比色反应(图8b)。与细胞结合的pd
‑
l1的结合通过流式细胞术确认，所述流式细胞术检测异二聚体双功能构建体与细胞表面上的pd
‑
l1的结合(图8c)。双功能异二聚体构建体在其c
h
2和c
h
3结构域中包含nhq变体，因此与未修饰的抗pd
‑
l1抗体相比，fcrn结合被消除，如通过表面等离子体共振和相对高的k
d
值所证实的(图8d)。
[0413]
在体外表征之后，发明人继续测量其体内特性。使用鼠胶质瘤模型gl
‑
261，在体内监测抗肿瘤作用和全身分布。简言之，荷瘤小鼠通过ced接受采用rmil
‑
12、mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq、mil
‑
12hfc wt或nhq或溶媒对照(仅注射缓冲液)的两次颅内注射(图9a)。使用生物发光成像监测肿瘤尺寸的变化，通过临床评分监测临床影响(图9b)。为了评估ced后的渗漏和输出，在不同时间点测量血浆中的全身il
‑
12和ifnγ水平(图9c)。虽然接受rmil
‑
12或mil
‑
12hfc wt的动物在ced后表现出全身il
‑
12信号的急剧增加，紧接着ifnγ的急剧增加，但接受mil
‑
12hfc nhq或mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq的动物显示迅速返回基线的强烈降低的全身il
‑
12信号，以及显著降低的ifnγ信号(图9c)。ced1后已经6小时，mil
‑
12hfc wt和mil
‑
12hfc nhq之间的组织保留差异导致全身il
‑
12信号更低(图9d)。关于治疗动物的临床病程，与对照组相比，接受il
‑
12构建体的所有组均显示存活率显著增加，即使在疾病很大程度上进展的非常晚的干预时间点，即肿瘤接种后3周也是如此(图9e)。值得注意的是，接受nhq构建体(mil
‑
12hfc nhq或mil
‑
12hfc:apd
‑
l1 nhq)的组的治疗反应显示全身il
‑
12和ifng严重降低，但当与接受mil
‑
12hfc wt或rmil
‑
12的组相比时，对治疗的反应至少同样好。
[0414]
实施例12:il
‑
12fc和igg变体对hfcrn的亲和力测量
[0415]
为了进一步评价低fcrn亲和力对局部递送到cns后有利影响血浆与脑比的影响，将iaq、aaa和nhq变体与未修饰的抗体进行比较(图10)。发明人选择了针对pd
‑
l1的人igg1(图10a和图10b，阿特珠单抗)和人抗甲型流感igg4抗体(图10c和图10d，流感ha3.1，us2014/0370032a1)。
[0416]
hil
‑
12fc是功能性的，比rhil
‑
12具有更高的组织保留，并且在渗漏的情况下消除全身再循环可以增加安全界限，这一发现对任何含有fc的分子的局部给药具有潜在的广泛影响。这些修饰能够安全有效地局部递送任何抗体或fc融合分子，用于局部治疗神经系统疾病。
[0417]
通过全身途径(os或i.v.)将治疗剂给药到cns具有挑战性，主要是因为bbb和与身体其他部位相比，只有一小部分目前的治疗剂实际上到达大脑。不幸的是，抗体和含有fc的生物制品，特别是fc融合蛋白，不容易穿过bbb，此外还被主动输出。正在广泛研究使抗体跨过bbb转运到脑实质中，例如通过利用受体介导的转铁蛋白的转胞吞作用。细胞因子在循环中具有短的半衰期，并且具有高不良反应风险，缩小了它们的治疗机会窗口。细胞因子可以与归巢到肿瘤的抗体相连，它们会在肿瘤累积，特别是nhs
‑
il
‑
12。即使在皮下给药后，这些抗体在通过血流到达肿瘤时也诱导ifnγ应答。最初，评估了il
‑
12用于治疗非脑癌的全身递送。然而，这些临床试验不得不提前终止，因为在有效剂量下，静脉施用导致严重的不良事件，包括死亡。主要原因之一似乎是il
‑
12诱导ifnγ。
[0418]
通过将治疗部分与抗体的可结晶片段(fc)直接融合，可以改善蛋白质治疗剂的血清半衰期和溶解度。对于在解剖学不同位置的直接局部施用，这也会导致不太理想的效果。其中之一可以是fcrn介导的包含fc的分子从免疫赦免的解剖部位，特别是大脑输出，并且其类似于igg再循环的血清累积。
[0419]
本发明人已经观察到，将il
‑
12fc融合细胞因子局部给予到脑中触发il
‑
12fc通过bbb进入循环的fcrn依赖性输出。il
‑
12fc在血液中累积并触发潜在危险的ifnγ产生。
[0420]
本发明人发现，与重组il
‑
12以及未修饰的il
‑
12fc相比，具有降低的fcrn亲和力的il
‑
12fc是功能性的并且具有更高的组织保留。当在脑组织保留实验中进行比较时，nhq突变体与il
‑
12fc wt以及iaq和aaa变体相比显示更高的脑组织保留(参见图7)。令人惊讶
的是，iaq和aaa这两种据报道具有显著降低的fcrn结合的变体与未修饰的il
‑
12fc没有不同，这表明为了获得生物学差异，必须使fcrn亲和力降低超过只有nhq修饰达到的给定的阈值。供选择地，不能排除nhq突变引入了以不依赖fcrn的方式改善组织保留的其他特征。
[0421]
这转化为改善的安全性并拓宽了il
‑
12fc治疗脑肿瘤的治疗窗。此外，发明人的发现可以转化到任何含有fc的治疗剂，主要是其中局部颅内给药有很强的理论依据的治疗性抗体。这样的施用途径将是优选的，因为当全身给药时功效较弱，可能穿过bbb的效果不佳，或者因为期望的治疗效果应该被局部包含。使用针对这样的递送优化的生物制品的局部治疗应排除全身毒性，因此提高药物的安全性。
[0422]
表1.引入il
‑
12fc的fc部分的突变的列表。氨基酸位置根据eu编号系统编号(edelman等人.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america(1969)63(1):78
‑
85)。
[0423][0424][0425]
表2.il
‑
12fc变体及其与蛋白g结合的能力的列表。
[0426]
名称seq id no.对蛋白g色谱珠保留的亲和力：fc wtseq id no.001 iaqseq id no.002 ahqseq id no.003 nhqseq id no.004 aaqseq id no.005 naqseq id no.006
‑
ahhseq id no.007 nhhseq id no.008 aahseq id no.009 nahseq id no.010
‑
naaseq id no.011
‑
naeseq id no.012
‑
aaaseq id no.013 aaeseq id no.014
[0427]
表3.分子的序列的列表，该组合使双特异性抗体或抗体样分子与人或小鼠il
‑
12受体特别以激动性方式结合，以及与人或小鼠pd
‑
l1结合。
[0428][0429][0430]
组合的双特异性分子可以由描述为以下序列的分子组成：seq id no 15与seq id no 21，seq id no 16与seq id no 21，seq id no 17与seq id no 22，seq id no 18与seq id no 22，seq id no 17与seq id no 23和seq id no 24，seq id no 18与seq id no 23和24，seq id no 19与seq id no 22，seq id no 20与seq id no 22，seq id no 19与seq id no 23和seq id no 24，seq id no 20与seq id no 23和seq id no 24。