基于CP2C靶向肽的抗癌剂的制作方法

基于cp2c靶向肽的抗癌剂
技术领域
1.本发明涉及基于cp2c靶向肽的抗癌剂。


背景技术：

2.虽然已开发和使用了许多蛋白质/肽类抗癌剂和基于低分子化合物的抗癌剂，但其在体内不是选择性地仅作用于癌细胞，而是对正常细胞也产生严重的副作用，并且其作用由于药物抗性癌细胞的出现有时是不显著的。另外，开发中的许多蛋白质/肽类抗癌剂具有在体内的短的半衰期，因此正在进行多种研究以克服该问题。同样地，尽管全世界竞相进行努力以开发抗癌药物，但尚未开发出在体内稳定性、安全性和药物抗性方面没有问题的抗癌药物。因此，发现可确保体内长期稳定性、仅选择性除去多种类型的癌细胞，并且作用于药物抗性癌细胞的药物，将在全世界范围内是高度有益的。


技术实现要素：

3.待解决的技术问题
4.本发明是鉴于上述问题进行的，其中重点是提供基于cp2c靶向肽的抗癌剂，该抗癌剂能够确保体内长期稳定性、仅选择性除去多种类型的癌细胞并且还作用于药物抗性癌细胞。
5.技术方案
6.根据本发明，cp2c靶向肽是指与转录因子cp2c结合以抑制包含cp2c的转录因子复合物(cp2c同四聚体和cp2c/cp2b/pias1异六聚体)的形成，从而诱导癌细胞特异性细胞死亡的肽。cp2c靶向肽对应于tyr
‑
pro
‑
gln
‑
arg(seq id no：1)，其是仅由抗癌作用所必需的氨基酸组成的尺寸最小的肽。因此，基本上包含这四个氨基酸并且通过与cp2c蛋白相互作用来表现出抗癌作用的肽可用作根据本发明的cp2c靶向肽。
7.根据本发明的cp2c靶向肽可以是由包含seq id no：1的氨基酸序列的4至20个氨基酸组成的肽。优选地，根据本发明的cp2c靶向肽可以是由6个氨基酸(6aa)
′
nypqrp(asn
‑
try
‑
pro
‑
gln
‑
arg
‑
pro，seq id no：2)
′
组成的肽(acp52)。
8.根据本发明的cp2c靶向肽可与细胞穿透肽(cpp：cell
‑
penetrating peptide)结合，以便增强细胞穿透活性。
9.例如，根据本发明的cp2c靶向肽可以是这样的肽，其包含由seq id no：2组成的肽(acp52)；以及由9个氨基酸(9aa)
′
crgdkgpdc(cys
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
lys
‑
gly
‑
pro
‑
asp
‑
cys，，seq id no：3)
′
组成的内化rgd(internalizing rgd，irgd)肽，作为细胞穿透肽(cpp)。作为根据本发明的cp2c靶向肽的一个实例，
′
acp52c
′
是其中乙酰基(ac)与acp52的n端结合，irgd与c端pro结合，并且酰胺基(nh2)与irgd的c端结合的肽(参见图7)。
10.另外，出于确保先前开发的cp2c靶向肽的体内稳定性的目的，本发明制备了与脂肪酸结合的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物。当脂肪酸与cp2c靶向肽结合时，所得缀合物与血液中的白蛋白结合，从而提高体内稳定性，并提供高治疗作用。
11.脂肪酸可以是(但不一定限于)c
12
至c
20
脂肪酸。在本发明的一个实施方案中，脂肪酸可以是c
16
脂肪酸，例如棕榈酰酸(也以
′
pal
′
表示)。另外，在本发明的一个实施方案中，脂肪酸可以是与谷氨酸(glu，e)或eglfg所示作为蛋白水解酶组织蛋白酶b的靶序列的氨基酸序列结合的经修饰脂肪酸。特别地，经修饰脂肪酸可通过脂肪酸的羧基与谷氨酸的氨基或eglfg所示氨基酸序列中的甘氨酸的氨基之间的肽键形成。在本说明书中，与谷氨酸偶联的棕榈酰酸可称为“e
‑
pal”，并且与eglfg所示氨基酸序列偶联的棕榈酰酸可称为“eglfg
‑
pal”。
12.另外，根据本发明，cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物可包含用于cp2c靶向的cp2c靶向肽(例如acp52)以及用于将cpp(例如irgd)和/或脂肪酸彼此连接的接头肽。接头肽可以是本领域已知的氨基酸或由其组合组成的肽，没有特定的限制。特别地，接头肽可包含甘氨酸(gly，g)，例如gn(其中n是1至6的整数)。在本发明的另一个实施方案中，接头肽可由g
n
kg
m
(其中n和m各自独立地为0至6的整数)所示的氨基酸序列组成。例如，当n或m为0时，赖氨酸(lys，k)可位于接头肽的n端或c端，并且当n和m不为0时，赖氨酸(lys，k)可位于甘氨酸之间。对于脂肪酸和肽之间的缀合，赖氨酸(lys，k)包含在接头肽中。赖氨酸的末端官能团(
‑
hn2)可使另外的氨基酸能够结合。
13.在根据本发明的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物中，cp2c靶向肽和脂肪酸的缀合可通过接头肽实现。特别地，缀合可通过作为与经修饰脂肪酸键合的肽的谷氨酸与接头肽的赖氨酸之间的结合来实现。更特别地，经修饰脂肪酸的谷氨酸与接头肽的赖氨酸之间的结合可通过赖氨酸的官能团(nh2)与谷氨酸的羧基之间的肽键形成。
14.同时，本发明中使用的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的肽的n端和/或c端可被修饰，以便获得所使用肽的改善的稳定性、增强的药理学特性(半衰期、吸收、效能、效力等)、改变的特异性(例如，广谱的生物活性)和降低的抗原性。优选地，该修饰可以是其中乙酰基、芴基甲氧基羰基、酰胺基、甲酰基、豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(peg)与肽的n端和/或c端键合的形式，但可包括但不限于能够改善肽的修饰，特别是肽的稳定性的组分。如在本发明中使用的，术语“稳定性”意指不仅是保护本发明的肽免受体内蛋白水解酶攻击的体内稳定性，而且是储存稳定性(例如，室温储存稳定性)。在根据本发明的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物中，肽的n端和c端可分别用乙酰基和酰胺基进行修饰。
15.根据本发明实施方案的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物如下：
16.1)ac
‑
k(e
‑
pal)
‑
gg
‑
与其中不存在ac的acp52c n端键合(c16
‑
acp52cn，acp52cg)，
17.2)ac
‑
k(eglfg
‑
pal)
‑
gg
‑
与其中不存在ac的acp52c n端键合(a16
‑
gflg
‑
acp52cn，acp52ck)，
18.3)位于acp52和irgd之间的gg
‑
k
‑
gg接头肽中的k的官能团与e
‑
pal的谷氨酸α碳羧基键合(c
‑
16
‑
acp52cm，acp52gk)
19.4)位于acp52和irgd之间的gg
‑
k
‑
gg接头肽中的k的官能团与e
‑
pal的谷氨酸γ碳羧基键合(γc16
‑
acp52cm，acp52cgk)。
20.删除图片
21.例如，根据本发明的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物中acp52gk和acp52cgk的结构如下：
[0022][0023]
在本发明的一个实例中，使用4种合成的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物分析了在用肝癌细胞(hep3b)或乳腺癌细胞(mda
‑
mb
‑
231)异种移植的小鼠模型中的体内稳定性、抗癌作用、肿瘤转移抑制作用和生理毒性。作为结果，证实了体内稳定性、肿瘤抑制作用和肿瘤转移抑制作用优异，并且缀合物是对身体无毒性的安全物质。
[0024]
另外，证实了在本发明的一个实例中在用4种合成的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物进行处理以研究抗癌作用的过程中，产生了对cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物具有抗性的细胞。因此，证实了抗性的产生机制和原因是由于在用cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物处理的细胞中细胞mdm2p90水平的降低。此外，证实了可通过cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物与能够抑制mdm2p90降解的胱天蛋白酶2(caspase2)抑制剂共处理来杀伤对cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物具有抗性的癌细胞。
[0025]
本发明提供了用于预防、改善和治疗癌症的药物组合物和健康功能性食品组合物，其包含cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物作为活性成分。
[0026]
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了治疗个体的方法，所述方法包括以药物有效量向有治疗需要的个体施用cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物或包含其的药物组合物的步骤。
[0027]
在本发明中，癌症还可包含对抗癌剂，特别是基于根据本发明的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的抗癌剂显示出抗性的抗性癌症。
[0028]
在本发明中，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的肽或包含该肽的药物组合物来改善或有益地改变癌症症状的任何行为。
[0029]
在本发明中，术语“施用”是指通过任何合适的方法向对象引入预定物质，即根据本发明的肽的衍生物或包含其的药物组合物。施用途径的途径可以是任何一般途径，只要药物可到达靶组织即可。例如，施用途径可包括但不限于腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、经口施用、表面施用、鼻内施用、肺内施用或经直肠施用。然而，由于肽在经口施用时被消化，因此优选配制用活性剂包被的或免于在胃中降解的经口组合物。优选地，肽将以注射剂的形式施用。另外，根据本发明的药物组合物可通过能够将活性物质运输至靶细胞的任何装置来施用。
[0030]
在本发明中，术语“作为活性成分被包含”意指在适用于药物治疗的合理的风险效益比的情况下，足以治疗疾病的量。有效剂量水平可根据患者的疾病类型、严重程度、药物
活性、药物敏感性、施用时间、施用途径、排出速率、治疗持续时间、包含伴随药物的因素和医学领域公知的其他因素来确定。根据本发明的肽或包含其的药物组合物可作为单独的治疗剂施用或可与其他治疗剂组合施用，可与常规治疗剂顺序或同时施用，并且可一次或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用可获得最大作用且无副作用的最小量，这可由具有医学专业知识的那些来容易地确定。本发明的药物组合物的剂量和频率是基于作为活性成分的药物的类型，与数个相关因素例如疾病类型、施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度一起来确定的。
[0031]
本文中使用的术语“药物有效量”意指在适用于药物治疗的合理的风险效益比的情况下，足以治疗疾病的量。本发明的药物组合物的合适剂量根据因素例如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重和性别、疾病严重程度、食物、施用时间和途径、施用途径、排出速率和响应敏感性来变化，并且对于所期望的治疗，普通技术医师可容易地确定和开出有效剂量。
[0032]
本文中使用的本发明的术语“个体”包括动物，例如马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、犬或人，其症状可通过施用根据本发明的治疗组合物来改善。疾病可通过向个体施用根据本发明的药物组合物来有效地预防和治疗。根据本发明的治疗方法可以是治疗除人以外的动物的方法，但不限于此。换言之，考虑到人可患有其症状可通过施用根据本发明的组合物来改善的疾病，根据本发明的组合物可充分用于人的治疗。
[0033]
因此，根据本发明的药物组合物可包含多种可药用载体，只要根据本发明的肽作为活性成分被包含即可。可药用载体可包括用于经口施用的黏合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂和矫味剂。注射剂可通过混合缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等张剂或稳定剂来使用。对于表面施用，可使用基质、赋形剂、润滑剂或防腐剂。本发明的药物组合物的制剂可通过与如上所述的可药用载体混合以多种方式来制备。例如，其可以以用于经口施用的片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂或晶片剂的形式来制备，并且其可以以用于注射的单剂量安瓿或多剂量的形式来制备。其也可以以其他溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂或持续释放制剂的形式来制备。
[0034]
同时，适合于制剂的载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。另外，还可使用填充剂、抗团聚剂、润滑剂、润湿剂、矫味剂或防腐剂。
[0035]
根据本发明的肽也可作为活性成分被包含在健康功能性食品组合物中。根据本发明的食品组合物可通过与已知具有抗癌功能的已知活性成分混合来以组合物的形式制备，并且还可包含科学上可接受的食品补充添加剂。本发明的保健功能性食品组合物包含用于所有类型的食品的组合物，例如功能性食品、营养补充剂、健康食品和食品添加剂的组合物。
[0036]
上述多种食品组合物可根据常规方法以多种形式来制备。例如，健康食品可以以多种形式，例如片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、胶剂、维生素复合物、果汁和饮料来制备，并且可使包含根据本发明的肽作为活性成分的食品组合物颗粒化、胶囊化或粉末化用于摄取。本发明的食品组合物可包含通常在食品生产期间添加的成分，例如蛋白质、碳水化合物、脂
肪、营养素和调味料。例如，当制备成饮料时，可将柠檬酸、高果糖玉米糖浆、糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁、枣提取物或甘草提取物添加至本发明的肽中。另外，通常用于烹饪的食品添加剂，例如矫味剂、着色剂、填充剂或稳定剂，可用作食品补充添加剂。另外，如在常规饮料中，可包含多种矫味剂或天然碳水化合物作为另外的成分。天然碳水化合物的一些具体实例包括：例如，单糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如麦芽糖和蔗糖，多糖例如糊精和环糊精，以及糖醇例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除上述那些以外的矫味剂，还可使用天然矫味剂(奇异果甜蛋白、甜菊提取物(例如，莱鲍迪苷a、甘草甜素等))和合成矫味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
[0037]
此外，本发明的食品组合物可包含多种营养素、维生素、矿物质(电解质)、矫味剂例如合成和天然矫味剂、着色剂、增稠剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类或用于碳酸饮料的碳化剂。这些组分可单独或组合使用。
[0038]
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。应当理解的是所包含的实施例仅用于具体说明本发明的精神，并不作为本发明的任何形式的限制。
[0039]
发明的效果
[0040]
为了鉴定转录因子cp2c靶向肽acp52c(其显示出作为通用抗癌剂的作用)的提高的体内稳定性的最终候选物，将c
16
脂肪酸与cp2c靶向肽先导物质acp52c连接，并证实了该缀合物在癌细胞异种移植小鼠模型中显示出体内稳定性和抗癌作用。另外，在多种癌细胞和正常细胞中证实了最终抗癌候选物的癌细胞特异性抗癌作用。最终候选物的抗癌作用显示为胱天蛋白酶2依赖性，并且通过用胱天蛋白酶2抑制剂和最终候选物的组合进行处理来证实了其对具有抗癌药物抗性的癌细胞的治疗作用。
附图说明
[0041]
图1示出了取决于多种癌细胞系中acp52c处理的g1
50
值。
[0042]
图2a至d示出了acp52c处理诱导g2/m细胞周期阻滞和细胞死亡(亚g1细胞(sub g1 cell))，如由facs所显示的。
[0043]
图3a至c示出了acp52c处理引起调节细胞周期和凋亡的p53表达的提高。
[0044]
图4a至c示出了由acp52c处理诱导的凋亡。
[0045]
图5示出了acp52c在mda
‑
mb
‑
231细胞系中的时间依赖性亚细胞运动、定位和量。
[0046]
图6a至h示出了acp52c肽的体内半衰期分析结果。
[0047]
图7示出了用于提高体内稳定性的c16脂肪酸结合肽的构建。
[0048]
图8a至d示出了取决于用c
16
脂肪酸结合肽(acp52c；acp52cg；acp52ck)在多种癌细胞系中进行处理的细胞生长分析结果。
[0049]
图9a至c示出了取决于用c
16
脂肪酸结合肽(acp52c；acp52cg；acp52ck)在多种p53突变或缺失(null)癌细胞系中进行处理的细胞生长分析结果。
[0050]
图10a至g示出了取决于用acp52cgk在正常细胞系(beas2b、hmsc)和癌细胞系(hep3b、hs746t、caov
‑
3、mda
‑
mb
‑
231、u343、hct116、panc1、pc3、a549、thp
‑
1)中进行处理的细胞生长分析结果。
[0051]
图11a至e示出了acp52cg、acp52ck在hep3b细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作
用分析结果。
[0052]
图12a至d示出了acp52ck在通过den处理诱导的肝癌小鼠模型中的抗癌作用分析结果。
[0053]
图13a至d示出了acp52cg、acp52ck在通过den处理诱导的肝癌小鼠模型中的抗癌作用分析结果。
[0054]
图14a至d示出了acp52cg、acp52ck在mda
‑
mb
‑
231(lm1)细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作用分析结果。
[0055]
图15a至j示出了当用acp52cgk以三种不同剂量以3天的间隔进行处理时，在hep3b细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作用(肿瘤尺寸和重量、体重和血液学分析)和转移抑制作用的分析结果。
[0056]
图16a至k示出了当用acp52cgk以三种不同剂量以5天的间隔进行处理时，在hep3b细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作用(肿瘤尺寸和重量、体重和血液学分析)和转移抑制作用的分析结果。
[0057]
图17a至j示出了当用acp52cgk以三种不同剂量以3天的间隔进行处理时，在mda
‑
mb
‑
231(lm1)细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作用(肿瘤尺寸和重量、体重和血液学分析)和转移抑制作用的分析结果。
[0058]
图18a至k示出了当用acp52cgk以三种不同剂量以5天的间隔进行处理时，在mda
‑
mb
‑
231(lm1)细胞系
‑
异种移植小鼠模型中的抗癌作用(肿瘤尺寸和重量、体重和血液学分析)和转移抑制作用的分析结果。
[0059]
图19a至b示出了使用荧光标记的acp52cgk的体内半衰期分析结果。
[0060]
图20a至b示出了acp52cgk在mda
‑
mb
‑
231细胞系中随时间的迁移途径、胞内定位和胞内停留时间的分析结果。
[0061]
图21示出了通过elisa研究是否形成针对acp52c、acp52cg、acp52ck和acp52cgk的抗体的分析结果。
[0062]
图22a至e示出了acp52c的突发和重复的体内毒性测试结果。
[0063]
图23示出了acp52cgk的重复的毒性测试结果。
[0064]
图24示出了用acp52cgk重复毒性测试的主要器官的组织学分析结果。
[0065]
图25a至d示出了acp52cgk在来源于乳腺癌患者的肿瘤组织的细胞的培养物中的效力分析结果。
[0066]
图26a至d示出了acp52cgk在来源于冷冻保存的乳腺癌患者癌组织的细胞的培养物中的效力分析结果。
[0067]
图27a至d示出了acp52cgk在从pdx肿瘤组织中培养的特定代(specific generation)的细胞中的效力比较分析结果。
[0068]
图28a至b示出了acp52cgk在患者肿瘤组织来源的细胞中的效力和抗性分析结果。
[0069]
图29示出了在对acp52c显示抗性的肺癌细胞系中cp2c转录活性非依赖性途径蛋白的表达分析结果。
[0070]
图30a至c示出了在肺癌细胞系(a549、pc9、kcl22)中cp2c转录活性非依赖性途径蛋白的acp52c处理依赖性表达分析结果。
[0071]
图31a至b示出了在肺癌细胞系(a549、pc9)中cp2c转录活性非依赖性途径蛋白的
mdm2过表达依赖性表达分析结果。
[0072]
图32a至d示出了其中长期诱导mdm2过表达的a549细胞系的acp52c处理依赖性细胞生长分析结果。
[0073]
图33a至d示出了mdm2p60表达模型和肺癌细胞系特异性选择性剪接和snp分析结果。
[0074]
图34a至d示出了在acp52c抗性细胞中取决于胱天蛋白酶2抑制剂和acp52c的组合处理的效力分析结果。
[0075]
图35示出了在acp52c抗性细胞中，取决于胱天蛋白酶2抑制剂和acp52c的组合处理的细胞形态变化。
具体实施方式
[0076]
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。应当理解的是，所包含的实施例仅用于具体说明本发明的精神，并不作为本发明的任何形式的限制。
[0077]
[制备例1]与细胞穿透肽缀合的cp2c靶向肽的制备
[0078]
已知转录因子cp2c在多种癌症中过表达。根据美国研究小组的研究，报道了在肝癌细胞系中抑制cp2c的表达抑制了细胞生长，而cp2c的过表达导致癌症恶化和转移[grant et al.，antiproliferative small
‑
molecule inhibitors of transcription factor lsf reveal oncogene addiction to lsf in hepatocellular carcinoma，proc.nail.acad.sci.2012；109(12)：4503
‑
4508]。
[0079]
本发明人通过噬菌体展示法鉴定了与转录因子cp2c(也称为tfcp2、lsf、lbp1、ubp1等)结合的肽[kang et al.，identification and characterization of four novel peptide motifs that recognize distinct regions of the transcription factor cp2，febs journal 2005；272：1265
‑
1277]，在鉴定的肽中选择来源于一种干扰cp2c的dna结合的肽的一种类型的肽(cp2c靶向肽，seq id no：2)，并通过将由9个氨基酸(9aa)*crgdkgpdc(cys
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
lys
‑
gly
‑
pro
‑
asp
‑
cys，seq id no：3)组成的作为细胞穿透肽(cpp)的内化rgd(irgd)肽与cp2c
‑
靶向肽结合来合成acp52c先导物质，以便提高细胞通透性(图7)。
[0080]
[实施例1］acp52c的抗癌作用的确定
[0081]
所选择的肽与cp2c结合并抑制包含cp2c的转录因子复合物(cp2c同四聚体和cp2c/cp2b/pias1异六聚体)的形成，从而间接干扰cp2c的dna结合。作为在多种癌中分析靶向合成的acp52c的抗癌作用的结果，证实了其显示出癌细胞特异性生长抑制和细胞死亡效力(图1)。
[0082]
acp52c的生长抑制和细胞死亡诱导效力通过在通过双胸苷阻断法将细胞周期同步至g1/s期之后，通过用acp52c来处理细胞进行的facs分析来证实。作为结果，证实了当细胞周期阻滞在g2/m期时形成了多倍体。另一方面，已证实了当将acp52c施加于用胸苷/诺考达唑(nocodazole)处理同步至g2/m期的细胞系时，细胞周期阻滞在亚g1期，并诱导细胞死亡(图2a至d)。
[0083]
已证实acp52c诱导的g2/m期阻滞是由chk1/2蛋白的表达提高和cdc25c、cdk1和细胞周期蛋白b蛋白的表达降低引起的，而细胞死亡诱导是由促凋亡蛋白的表达提高以及抗
凋亡标志物蛋白的表达降低，以及通过胱天蛋白酶激活导致的凋亡引起的(图3a至c，图4a至c)。
[0084]
通过共聚焦显微术随时间分析了在用cy5标记的肽(cy5
‑
acp52c)处理30分钟的细胞中acp52c的亚细胞运动、定位和稳定性。大多数肽穿过胞质，4小时起位于细胞核中，8小时时移回胞质，并且16小时时在胞质中降解。证实了cy5
‑
acp52c肽在处理之后1小时起与cp2c共定位于细胞核中，并且cp2c在处理之后8小时也倾向于与cy5
‑
acp52c一起分布在胞质中(图5)。
[0085]
在将acp52c在包含10％血清的溶液中孵育多次并随后在hplc分析之前用centricon(mw10，000)除去血清蛋白之后，用hplc(模型：uhplc dionex ultimate 3000；流量＝1.000ml/分钟)分析acp52c在包含血清的溶液中的半衰期。作为实验的结果，acp52c未完全降解直至24小时时。同时，在通过尾静脉将acp52c注射到小鼠之后，随时间提取血液样品，并通过hplc分析血液样品中acp52c降解的程度。作为结果，ec50(保留50％的完整acp52c的时间)为约2小时。另外，当在通过尾静脉注射cy5标记的肽(cy5
‑
acp52c)的小鼠中，通过实时成像过程随时间测量小鼠体内的剩余荧光强度时，尽管在处理之后7.95小时小鼠体内的总荧光强度减半，但是即使在注射之后5天也能在癌组织中观察到acp52c(图6a至h)。
[0086]
[制备例2］cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的合成
[0087]
我们的数据表明，尽管acp52c显示出良好的抗癌活性，但acp52c在体内可能不稳定。作为提高acp52c的体内稳定性的努力，合成了4种类型的白蛋白亲和c
16
脂肪酸(棕榈酰酸)缀合肽(图7)。合成了n端和c端被修饰的每种肽，随后将c
16
脂肪酸与每种肽缀合。
[0088]
[实施例2］cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的体外抗癌作用的确定
[0089]
在多种癌细胞中分析了制备例2中合成的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的抗癌作用。作为结果，所有3种类型的c
16
脂肪酸结合肽(acp52cg，acp52ck和acp52cgk)均诱导与对照组(acp52c)类似的癌细胞特异性细胞死亡，并且在处理之后48小时计算的gi
50
值与对照的gi
50
值相似或比对照的gi
50
值更有效(图8a至d，图10a至g)。另外，在对具有不同p53突变的多种癌细胞系用acp52cg和acp52ck处理之后，通过mtt测定计算细胞存活曲线和gi
50
值。作为结果，尽管每种细胞系的gi
50
值显示出偏差，但其为10mm或更少，这与正常细胞系的结果(约1,000mm)有明显的区别(图9a至c)。总之，acp52cg、acp52ck和acp52cgk的抗癌作用与acp52c的抗癌作用类似，并且与复合物结合的脂肪酸对癌细胞和正常细胞均未显示出任何负面影响。
[0090]
[实施例3]在用多种癌细胞系移植的小鼠模型中取决于用cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物处理的肿瘤生长抑制作用和一般生理毒性的确定
[0091]
[3
‑
1］在用肝癌和乳腺癌细胞系移植的小鼠模型中acp52cg、acp52ck和acp52gk的肿瘤生长抑制作用和一般生理毒性的确定
[0092]
为了分析制备例2中合成的cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物在动物模型中的抗癌效力，以3天的间隔通过尾静脉5次将acp52cg和acp52ck注射到hep3b异种移植小鼠中。作为结果，acp52cg和acp52ck二者均显示出与索拉非尼(sorafenib)类似的效力，但其效力小于acp52c的效力。然而，在正常组织和血液水平中未发现特定的异常，并且未观察到毒性(图11a至e)。
[0093]
另外，将在den处理之后经过22周的小鼠分为3组(7至8只小鼠/组)，例如仅用载剂处理的对照组(模拟)、索拉非尼组(经批准的用于肝癌治疗的药物)和acp52cg
‑
gflge(acp52ck)组。药物以3天的间隔通过尾静脉以5mg/kg的浓度注射共12次。作为分析的结果，索拉非尼处理组与对照组相比显示出显著的抗癌作用(p＝0.04)，并且acp52cg
‑
gflge(acp52ck)处理组显示出与索拉非尼处理组类似的抗癌作用(p＝0.001)(图12a至d)。此外，acp52cg和acp52ck在den处理之后15周的小鼠中的效力分析结果也优于另一个对照fqi1，但与acp52c相比未显示出任何更优的效力(图13a至d)。
[0094]
当将acp52cg和acp52ck以3天的间隔通过尾静脉5次注射到mda
‑
mb
‑
231(lm1)异种移植小鼠中时，acp52cg和acp52ck二者均显示肿瘤消退效力，但抗癌作用不显著。在血液水平中未发现特定的异常，因此未观察到毒性(图14a至d)。
[0095]
当将acp52gk以3天的间隔通过尾静脉5次注射到hep3b异种移植小鼠中，随后分析效力时，证实了acp52gk效力低于acp52c的效力，但该效力优于对照fqi1组的效力。
[0096]
[3
‑
2]在用肝癌和乳腺癌细胞系移植的小鼠模型中acp52cgk的肿瘤生长抑制作用、转移抑制作用和一般生理毒性的确定
[0097]
将acp52cgk以3天的间隔通过尾静脉以3种不同浓度(1.39、2.77或5.54mg/kg)5次注射到hep3b异种移植小鼠中。在药物注射之后每3天测量肿瘤体积。肿瘤和主要组织是从在肿瘤细胞注射之后在第24天处死的小鼠中切除的。将肿瘤称重，并与主要器官一起用4％甲醛固定。在通过石蜡切片制作组织载片之后进行苏木精/伊红染色。使用coulter lh 750血液分析仪对收集的血液样品进行基本的cbc分析。使用excel程序对获得的数据进行统计学处理。
[0098]
作为结果，acp52cgk表现出的肿瘤抑制作用与acp52c的肿瘤抑制作用类似，并且在正常组织和血液水平中未发现异常(图15a至d和15g至j)。另外，根据图15e至f，显示了转移至肺的肿瘤面积的平均值和标准偏差，证实了acp52cgk在肿瘤转移抑制作用方面优于acp52c。
[0099]
将acp52cgk以5天的间隔通过尾静脉以3种不同浓度(1.39、2.77、5.54mg/kg)5次注射到hep3b异种移植小鼠中，并以与上述相同的方式评价抗癌作用。作为结果，所有三种浓度的acp52cgk均显示出优于索拉非尼和acp52c处理组的肿瘤抑制和转移抑制作用，并且该抑制作用是浓度依赖性的(图16a至g)。另外，通过5天间隔注射的acp52cgk比通过3天间隔注射的acp52cgk显示出更有效的肿瘤抑制和转移抑制作用(比较图15a至j与图16a至k)。作为综合分析所有结果的结果，2.77mg/kg是最佳浓度。另外，在血液水平中未发现特定的异常，因此未观察到毒性(图16h至k)。
[0100]
acp52cgk的抗癌作用是在mda
‑
mb
‑
231(lm1)异种移植小鼠中以与hep3b异种移植小鼠模型实验中相同的方式进行分析的。类似地，在所有三种浓度(1.39、2.77、5.54mg/kg)的acp52cgk中的肿瘤抑制和转移抑制作用优于索拉非尼和acp52c处理组的肿瘤抑制和转移抑制作用(图17a至f和18a至g)。当以5天间隔而不是以3天间隔进行注射时，观察到更优的抗癌作用，并且2.77mg/kg是最佳浓度。另外，在血液水平中未发现特定的异常，因此未观察到毒性(图17g至j和18h至k)。
[0101]
[实施例4]cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物的稳定性和安全性评价
[0102]
为了分析acp52cgk的体内半衰期，将cy5标记的acp52cgk注射到小鼠尾静脉，随后
通过实时成像过程随时间测量小鼠体内剩余的荧光强度。作为结果，半衰期为约20.2小时(图19a至b)。这些结果表明，与显示出7.95小时半衰期的先导物质acp52c相比，与脂肪酸的缀合引起了显著提高的体内稳定性。
[0103]
为了分析acp52cgk在培养的细胞中的亚细胞运动、定位和稳定性，将cy5标记的acp52cgk在细胞培养基中处理30分钟，随后随时间追踪肽的亚细胞运动。另外，通过共聚焦显微术分析亚细胞运动，是否cy5标记的acp52cgk也迁移到线粒体(hsp60)和溶酶体(lc3)。作为结果，acp52cgk从4小时起穿过胞质并且主要位于细胞核，并且在8小时之后从胞质中出来；其中一些在线粒体中，但最终迁移至溶酶体并在16小时时降解。acp52cgk的这些亚细胞运动、定位和稳定性现象与acp52c中的那些并无不同(图20a至b)。
[0104]
同时，推测acp52c不表现出免疫原性，因为它由15个氨基酸组成。为了验证这一点，在得到最终新药物候选物的过程中直接测试了acp52cg和acp52ck的免疫原性。由于最终候选物质可以是在化学组成方面与acp52cg和acp52ck无区别的c
‑
16棕榈酰酸缀合的acp52c肽，因此决定分析是否在acp52cg和acp52ck上形成抗体。作为对从用acp52cg和acp52ck注射三次的兔中分离的血清进行elisa分析的结果，两种兔血清均未在acp52cg、acp52ck和acp52cgk，包括acp52c上诱导免疫应答。因此，结论是最终候选物质(acp52cgk)在人体中也未显示免疫原性(图21)。
[0105]
用雌性和雄性小鼠进行了acp52cgk体内施用的重复毒性试验。作为初步实验，当100mg/kg和1000mg/kg的acp52c重复施用两次时，所有小鼠均存活，并且在未观察到任何肝毒性或对主要器官的不良反应。作为全面实验，在将acp52cgk以3天的间隔静脉内输注至各6只雄性和雌性的溶剂组和高剂量组(100mg/kg)28天之后，分析了重量变化、饮水摄取、和器官的主要组织学分析、器官重量、血液学测试和血液生化测试。总之，未检测到异常发现(图22a至e、23和24，以及表1、2、3和4)。
[0106]
【表1】
[0107]
表1.用acp52cgk处理或未用acp52cgk处理的小鼠的绝对器官重量(g)
[0108][0109]
【表2】
[0110]
表2.用acp52cgk处理或未用acp52cgk处理的小鼠的相对器官重量(％)
[0111][0112]
【表3】
[0113]
表3.用acp52cgk处理或未用acp52cgk处理的小鼠的血液学
[0114][0115]
【表4】
[0116]
表4.用acp52cgk处理或未用acp52cgk处理的小鼠的血清生化学
[0117][0118]
为了研究在癌细胞系和异种移植小鼠模型上测试的acp52cgk的效力是否可同样施加于实际临床实践，在从在乳腺癌患者的新鲜状态的肿瘤组织中培养的细胞中评价了acp52cgk的效力。作为初步结果，证实了acp52cgk在gi50：约2μm下诱导细胞死亡，这与癌细胞系实验中的那些类似(图25a至d)。因此，将乳腺癌患者的冷冻保存的癌组织进行解冻并进行原代培养。当对于从其中获得的细胞分析acp52cgk的作用时，也证实了在gi50：约2μm下诱导细胞死亡(图26a至d)。
[0119]
[实施例5]对cp2c靶向肽
‑
脂肪酸缀合物表现出抗性的细胞的抗性原因分析
[0120]
作为分析acp52cgk在从pdx(患者来源的异种移植物)肿瘤组织中原代培养的每一代细胞中的效力的结果，证实了来源于相同起源的细胞中对acp52cgk的敏感性无显著差异(图27a至d)。然而，来自一些pdx肿瘤组织的原代培养细胞显示出对acp52cgk具有抗性(图28a至b)。
[0121]
对acp52cgk表现出抗性的细胞(主要是肺癌细胞系)倾向于显示出mdm2p90的低表达水平和mdm2p60的相对高表达。事实上，通过免疫印迹证实了在用acp52c处理的三种肺癌细胞系(a549、pc9、kcl22)中yy1的表达降低，但p53、p63和p73的表达未显示出任何变化。在这些细胞系中mdm2(p90和p60)的表达未降低。由于已知mdm2p60是其中mdm2p90的包含通过atm磷酸化的位点(s386、s395和s407)的c端区域被删除的蛋白质，因此推测mdm2降解未通过acp52c处理来适当调节(图29、图30a至c)。
[0122]
据此，通过用多西环素(doxycycline)处理3周，mdm2p90持续过表达，并且令人感兴趣是通过免疫印迹，在cp2c转录活性依赖性和非依赖性标志物蛋白中p53蛋白和yy1的表达逐周降低。同时，由于通过mtt测定分析根据acp52c处理诱导的细胞死亡，证实从第二周开始诱导细胞死亡。因此，证明肺癌细胞系中mdm2p90的低表达是acp52c抗性的原因(图31a至b，图32a至d)。
[0123]
已经提出了mdm2p60的产生是由于mdm2p90的胱天蛋白酶2切割或选择性剪接的两
种模型。当使用能够检测多种癌细胞系中mdm2的选择性剪接形式的引物组进行rt
‑
pcr时，未发现肺癌细胞特异性剪接形式。另外，当在pcr克隆之后测试基因组dna的核苷酸序列分析，以确定mdm2p60是否是从由于在特别地针对肺癌细胞系的mdm2基因中存在snp而截短的mrna中产生的时，未观察到肺癌细胞特异性snp(图33a至d)。
[0124]
同时，当对胱天蛋白酶2抑制剂(ac
‑
vdvad
‑
cho)进行处理以鉴定由于特别地在肺癌细胞中胱天蛋白酶2的高活性而发生的现象时，通过免疫印迹发现mdm2p90的蛋白量提高，而mdm2p60的蛋白量根据用胱天蛋白酶2抑制剂的处理而降低。因此，我们得出结论，在肺癌细胞中过表达的mdm2p60形式是通过胱天蛋白酶2切割mdm2p90的结果。基于这些结果，通过用胱天蛋白酶2抑制剂和acp52c的组合处理对acp52c显示出抗性的细胞(a549和pdx细胞、乳腺f0
‑
jos)来分析细胞死亡诱导作用。作为结果，在用胱天蛋白酶2抑制剂和acp52c的组合处理的组中在gi50约1μm左右观察到效力(图34a至d，图35)。
[0125]
因此，acp52cgk肽与现有的acp52c肽相比提高了体内稳定性，并且在所有癌细胞中显示出如acp52c中的生长抑制/细胞死亡，但对正常细胞无显著作用。另外，证实了对acp52c表现出抗性的癌细胞可通过acp52c与胱天蛋白酶2抑制剂的组合处理来杀伤。