一种功能一体化的多层级皮肤创面修复支架及其制备方法与流程

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1.本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种功能一体化的多层级皮肤创面修复支架及 其制备方法，该修复支架上层具有向心取向拓扑结构以及向心梯度蛋白涂层，加速表皮细胞 的迁移和增殖，支架中层所含抗菌中药黄连素可发挥有效的抗菌作用，支架下层的涂覆脱细 胞真皮基质的网状支架能够调控脂肪肝细胞分泌，三层结构多功能一体化加速全层真皮基质 再生。


背景技术：

2.伤口愈合主要由止血、炎症、增殖、重塑四个阶段组成，但单一的非手术治疗通常只能 促进伤口愈合的。具体来说，传统的敷料管理在加速“止血”阶段方面非常出色；抗菌敷料 对于减轻“炎症”阶段是不可替代的，这是烧伤伤口愈合的限速步骤；物理治疗通过用电子 和光子直接来促进“增殖”和“重塑”阶段。理想的伤口敷料必须支持分别需要止血、抗菌 活性、细胞增殖和再生的所有阶段。静电纺丝所制备的纳米纤维支架是组织工程概念中的一 个关键组成部分，组织工程支架的功能化修饰能够使支架同时提供拓扑结构信号和生物化学 信号，从而能够促进细胞的迁移和增殖。功能化的支架的奥秘功能在于它能够产生定制的微 环境，通过特定细胞
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物质的相互作用来引导细胞行为。不同拓扑结构的纳米纤维通过模拟 细胞外基质，被发现提供了不同的接触线索来调节细胞的活动，支持细胞的增殖、血管形成 及干细胞多向分化。然而，仅由物理层面来调节细胞的活动，不足以及时的诱导组织再生， 并且再生效果不明显，需将物理特征与生化线索结合，提供接触线索，尤其是通过支架拓扑 结构的诱导和生化因子趋化性的协同作用，可以帮助快速建立一个能够模拟天然ecm结构 和功能的微环境。静电喷雾是静电纺丝技术的一种演变，提供了一种简便的方式去产生相对 均匀的纳米粒子，近年开始将静电喷雾作为涂覆生物活性蛋白的主要方法，可模拟细胞趋化 作用进而为细胞提供生物信号，协助细胞生长。
3.表皮生长因子是一种较好的促进创面愈合的制剂，具有很好的改善和治疗皮肤创面烧伤 的效果，研究发现，表皮生长因子具有很强的促进表皮细胞迁移和增殖的能力，而脱细胞真 皮基质(adm)主要是通过物理和化学的方法将组织去表皮、脱细胞，保留了细胞外基质的形 态、成分和三维结构，为宿主细胞提供了生存和代谢的场所，进而完成对缺损组织的修复和 重建。脱细胞真皮基质和表皮生长因子由于具有优良的生物相容性和组织细胞的诱导功能， 作为组织工程新型载体材料推广使用。
4.目前，还未发现关于具有本研究制备梯度蛋白研究方法及三层结构多功能一体化的研究 报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种功能一体化的多层级皮肤创面修复支架及其制备 方法，该方法设计的多层级的生物材料具有多功能性和优良的生物相容性，在创面愈合组织 工程中将会有重要的应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供的一种功能一体化的多层级皮肤创面修复支架，其主体 结构为逐层沉积的三层支架，上层支架为负载向心梯度的明胶/表皮生长因子生物活性涂层 的具有向心取向的聚己内酯纳米纤维支架，中层为聚己内酯/黄连素纳米纤维支架，下层为 涂层脱细胞真皮基质的网状纳米纤维支架。
7.本发明还提供所述功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的制备方法，具体步骤包括：
8.(1)制备支架上层：将聚己内酯溶于溶剂中，得到聚己内酯纺丝液；将聚己内酯纺丝 液作为支架上层的原材料，圆环电极中心加一个点电极作为接收装置，进行静电纺丝，即得 向心取向的聚己内酯纤维支架；然后聚己内酯纤维支架作为接收装置，将明胶/表皮生长因 子混合液进行静电喷雾，在接收装置下方更换不同直径的磁铁，即得负载向心梯度的明胶/ 表皮生长因子生物活性涂层的具有向心取向的聚己内酯纳米纤维支架；
9.(2)制备支架中层：将明胶和黄连素混合物溶于溶剂中，得到明胶/黄连素纺丝液；将 明胶/黄连素纺丝液作为支架中层的原材料，进行无规纺丝，即得明胶/黄连素纳米纤维支架 中层；
10.(3)制备支架下层：将聚己内酯和吲哚菁绿混合物溶于溶剂中，得到聚己内酯/吲哚菁 绿纺丝液；将聚己内酯/吲哚菁绿纺丝液作为支架下层的原材料，制备纳米纱线，手动制备 网格结构，光焊交叉点，然后将明胶纺丝液在网格基础上无规纺丝，将脱细胞真皮基质喷雾 液进行静电喷雾涂层，即得涂层脱细胞真皮基质的网状纳米纤维支架；
11.(4)制备功能一体化的多层级皮肤创面修复支架：上述三层支架逐层沉积，即得功能 一体化的多层级皮肤创面修复支架。
12.所述步骤(1)中溶剂为六氟异丙醇，聚己内酯与六氟异丙醇的质量体积比为0.12g:1ml。
13.所述步骤(1)中明胶/表皮生长因子混合液的制备方法为：将明胶和表皮生长因子溶于 乙酸中，明胶、表皮生长因子和乙酸的质量体积比为0.006g：1ml：1ml。
14.所述步骤(2)中溶剂为六氟异丙醇，明胶、黄连素与六氟异丙醇的质量体积比为0.12 g：0.0012g
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0.012g：1ml。
15.所述步骤(3)中溶剂为六氟异丙醇，聚己内酯、脱细胞真皮基质与六氟异丙醇的质量 体积比为0.12g：0.001g：1ml。
16.所述步骤(3)中脱细胞真皮基质喷雾液的制备方法为：将脱细胞真皮基质溶于六氟异 丙醇中得到脱细胞真皮基质喷雾液，脱细胞真皮基质与六氟异丙醇的质量体积比为0.02g： 1ml。
17.所述步骤(3)中明胶纺丝液的制备方法为：将明胶溶于六氟异丙醇中得到明胶纺丝液， 明胶与六氟异丙醇的质量体积比为0.12g：1ml。
18.所述步骤(1)中静电纺丝pcl纺丝液的电压为10kv，流速为1ml/h，持续时间为10min。
19.所述步骤(1)中静电喷雾明胶/表皮生长因子喷雾液的电压为18kv，流速为0.5ml/h， 每种梯度持续时间为30s。
20.所述步骤(2)中静电纺丝明胶/黄连素纺丝液的电压为15kv，流速为1ml/h，持续时间 为1h
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2h，采用滚筒作为接收装置，转速为900rmp。
21.所述步骤(3)中静电纺丝聚己内酯/吲哚菁绿混合液的正电压为9.6kv、负电压为 3.5kv，流速为1ml/h，持续时间为1h
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2h，收集辊接收，手动摆放为网格状结构(长度为 3mm)，光焊交叉点。
22.所述步骤(3)中静电喷雾adm喷雾液的电压为18kv，流速为0.5ml/h，持续时间为3min。
23.所述步骤(3)中静电纺丝明胶纺丝液的电压为10kv，流速为1ml/h，持续时间为2min， 光焊好的网格纤维支架作为接收装置。
24.本发明还提供所述功能一体化的多层级皮肤创面修复支架在制备促进伤口愈合材料中的 应用。
25.本发明涉及的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架为贯穿细胞愈合各个过程的多层级 生物活性支架，其支架上层为向心取向的纳米纤维支架基础上改变磁场力分布的简便方法来 进行梯度的沉积，将生物活性因子(表皮生长因子)通过静电喷雾的方式形成渐变梯度，加速 损伤的创面不同方向的愈合速度，引导皮肤中的细胞迁移并牵拉皮肤组织从四周向中心创面 缺损逐渐减小；支架中层由抗菌中药黄连素和生物活性物质明胶的纳米纤维支架组成，是为 解决伤口愈合中由于细菌感染而导致的久经不愈；而将支架下层制备成网状拓扑结构并涂层 adm，为组织细胞提供了一个生长代谢的立体框架，网状纤维支架调控脂肪干细胞旁分泌生 长因子物质可加速组织的重塑，从而完成了组织的生理性修复。本发明提出了功能一体化的 多层级皮肤创面修复支架的概念模型，目前主要针对慢性伤口、烧伤伤口愈合做进一步的研 究，在组织工程修复中具有重要的研究意义和应用价值。
26.本发明与现有技术相比，有益效果为：
27.(1)本发明首次选取类似于人体天然材料如表皮生长因子、脱细胞真皮基质、明胶和 具有良好的生物相容性的聚合物材料聚己内酯作为基础材料，制备具有梯度的生物活性蛋白 的多层级生物活性皮肤组织修复支架。针对表皮和真皮组织再生设计多层级支架的不同结构 和生物功能，适于大面积创面愈合，所提供的物理线索和生化信号协同引导细胞从边缘部位 向中心部位的细胞迁移是十分重要的。
28.(2)本发明设计的梯度结构的生物材料具有较好的优良的生物相容性及可降解性，尤 其具有促进细胞长入的潜能，在创面修复再生组织工程中具有重要的应用，为纳米纤维的功 能化提供了新思路。
附图说明：
29.图1为本发明涉及的制备支架上层中聚己内酯纤维支架的装置结构原理示意图。
30.图2为本发明涉及的制备支架上层中负载表皮生长因子向心梯度步骤的方法原理示意图。
31.图3为本发明涉及的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的梯度表征结果示意图。
32.图4为本发明涉及的实施例2生物活性蛋白梯度信号对表皮细胞迁移的影响实验结果示 意图，其中a
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c本发明成纤维细胞在圆形渐变梯度涂层表面生长3天后细胞迁移状况的荧光 显微镜照片；d
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e对总细胞数及三个区域细胞数的统计。
33.图5为本发明涉及的实施例3支架中层不同比例的明胶/黄连素在均匀的金黄色葡萄球 菌琼脂糖培养板孵育24h后的抗菌试验结果示意图。
34.图6为本发明涉及的实施例4中功能一体化的多层级皮肤创面修复支架接种脂肪干细胞 生长3天后细胞骨架荧光显微镜照片。
35.图7本发明涉及的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的三层支架的实物图，其中a 为支架上层(向心取向支架)，b为支架中层(在中药黄连素无规支架)，c为支架下层(网状纤 维支架)。
36.图8本发明涉及的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的动物实验结果示意图。
具体实施方式：
37.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
38.实施例1：
39.本实施例涉及一种功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的制备方法，具体步骤包括：
40.(1)制备支架上层：将0.24g的聚己内酯溶于2ml六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶 解，得到聚己内酯纺丝液；取2ml的聚己内酯纺丝液，圆环电极中心加一个点电极作为接收 装置，将聚己内酯纺丝液吸入5ml注射器中，连接20号不锈钢针头并与10kv高压相连接， 流速为1ml/h，持续时间为10min，得到向心取向的纳米纤维支架；然后取2ml的明胶/表皮 生长因子混合液，将混合液吸入5ml注射器中，连接20号不锈钢针头并与18kv高压相连接， 控制微量注射泵调节混合液流速(ml/h)为：0.3ml/h，采用静电喷雾法，向心取向支架作 为接收装置，在支架下方放置直径分别为4/8/12的圆形磁铁来制备梯度，最后一层不加磁 铁，每层持续时间为30s，得到负载表皮生长因子向心梯度的向心取向纳米纤维支架为支架 上层；
41.所述明胶/表皮生长因子混合液的制备方法为：将0.006g的明胶溶于1ml的乙酸中并与 1ml表皮生长因子母液混合，磁力搅拌至完全溶解得到明胶/表皮生长因子混合液；
42.下面通过荧光强度试验证明本实施例在向心排列的纳米纤维上生成了一个活性蛋白的圆 形梯度，
43.为了可视化梯度，使用罗丹明b作为染料，并按步骤(1)的方法通过改变圆形磁铁的 直径和数量(图2)分别获得覆盖了低梯度、高梯度和均匀的罗丹明涂层的纳米纤维支架。 图3为纳米纤维支架上不同位置的相对荧光强度，中心区域的相对荧光强度是外围区域的近 20倍(图3，低梯度)。该梯度的斜率也可以通过使用模具来增加，其尺寸与底下磁铁完全 相同(图3，高梯度)，在这种情况下，在中心和外围之间的相对荧光强度上有40倍的差异。
44.这些结果证实了活性蛋白沿着径向排列的纳米纤维成功地产生圆形梯度。
45.(2)制备支架中层：取5ml的明胶/黄连素纺丝液吸入5ml的注射器中，采取无规静电 纺丝方式，连接20号不锈钢针头并与10kv高压相连接，控制注射泵流速为1ml/h，持续时 间为2h，以900rmp转速的滚筒接收到无规纳米纤维；即为支架中层；
46.所述明胶/黄连素纺丝液的制备方法为：分别将0.6g的明胶和黄连素混合物溶于
5ml六 氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解；其中明胶和黄连素的质量比为1:1；
47.(3)制备支架下层：取10ml的聚己内酯/吲哚菁绿纺丝液分别吸入5ml的注射器中， 采取纳米纱线对纺方式，连接20号不锈钢针头并与9.6kv正电压、3.5kv的负电压相连接， 控制注射泵流速为1ml/h，收集辊接收纱线，后手工摆放呈网格状结构，光焊网格四角；取 2ml明胶纺丝液装入5ml注射器，连接20号不锈钢针头并与10kv高压相连接，控制微量注 射泵流速为1ml/h，上述网格纤维支架接收，即得支架下层；将adm溶于六氟异丙醇中得到 adm喷雾液，adm与六氟异丙醇的质量体积比为0.02g：1ml，在支架下层表面进行adm静 电喷雾，电压为18kv，流速为0.5ml/h，持续时间为3min，得含adm生物活性的支架下层。
48.所述明胶/黄连素纺丝液的制备方法为：将明胶
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1.2g、黄连素
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0.12g溶于10ml的六氟 异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，得到明胶/黄连素纺丝液；
49.所述聚己内酯/吲哚菁绿纺丝液的制备方法为：将1.2g的聚己内酯/吲哚菁绿混合物溶 于10ml的六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，得到聚己内酯/吲哚菁绿纺丝液；其中聚己 内酯/吲哚菁绿的质量比为120:1；
50.(4)制备功能一体化的多层级皮肤创面修复支架：上述三层支架逐层沉积，即得功能 一体化的多层级皮肤创面修复支架。
51.实施例2:
52.本实施例为研究生物活性蛋白梯度信号对表皮细胞迁移的影响实验。首先将按照实施例 1步骤(1)中的方法，分别制备向心梯度涂层纤维片、均匀一致涂层纤维片及纯玻片，纯玻 片作为空白对照组，分别放置到24孔板的孔中，每个孔中纤维支架的中心部位放置一个直 径为6mm的聚二甲基硅氧烷(pdms)圆柱体，将表皮细胞分别均匀种植到聚二甲基硅氧烷 圆柱体未覆盖到纤维支架的外周区域，细胞种植浓度为5
×
105细胞/ml。待细胞粘附6h 后，移除聚二甲基硅氧烷圆柱体，使细胞开始迁移。
53.本实施例研究了生物活性蛋白蛋白的梯度涂层对人皮肤成纤维细胞迁移的影响，并以均 匀的纤维连接蛋白涂层和空白玻片作为对照组，以促进全方位的伤口愈合。图4a
‑
c显示培 养3天后的成纤维细胞在梯度蛋白涂层和均匀蛋白涂层覆盖的纤维片上迁移及显示空白玻片 上迁移。越来越多的细胞倾向于在梯度组的整个迁移区迁移。如图所示4d时，相对于均匀 组(p<0.05)和空白玻片(p<0.01)，梯度组整个迁移区的细胞总数显著增加。很明显，生物活 性蛋白梯度提供的趋化性诱导细胞向蛋白质含量较高的区域迁移。本实施例还将迁移区平均 划分为三个区域，并测量了不同区域的迁移细胞的数量。在离播种区(区域i最近的区域)， 与空白载玻片相比，梯度组有更多的迁移细胞(p<0.05)。如4e示，相对于均匀组和空白玻 片，细胞倾向于迁移到梯度组上更远的位置。与均匀组和空白玻片相比，梯度组ii区域和 iii区域的迁移细胞数显著增加(p<0.05和p<0.01)。
54.实施例3：
55.本实施例为支架中层黄连素的抗菌性能实验，按照实施例1步骤(2)制备支架中层的 制备方法分别制备含1％、5％和10％黄连素的黄连素/明胶纳米纤维支架，纯明胶纳米纤维支 架作为对照组。采用圆盘琼脂扩散法测定其抗菌性能。首先，将近似为1
×
108/ml的大肠杆 菌悬液接种于直径为9cm的营养琼脂平板上。不同比例的黄连素支架中层切成直径为1.5 cm的圆形。纳米纤维垫用磷酸盐缓冲溶液(pbs)浸泡，然后覆盖在琼脂板的中心。整个过程 在无菌条件下进行。然后将琼脂平板置于37℃下孵育24h，进一步观察。
56.所述1％、5％、10％的黄连素/明胶纺丝液的制备方法为：1％黄连素/明胶纺丝液：将 0.6g明胶与0.006g的黄连素溶于5ml的六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，得到1％黄 连素/明胶纺丝液；5％黄连素/明胶纺丝液：将0.6g明胶与0.03g的黄连素溶于5ml的六氟 异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，得到5％黄连素/明胶纺丝液；10％黄连素/明胶纺丝液： 将0.6g明胶与0.06g的黄连素溶于5ml的六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，得到10％ 黄连素/明胶纺丝液。
57.通过测定支架中层在琼脂平板上形成的大肠杆菌生长抑制抗菌区的大小，评价不同数量 的黄连素的抗菌作用。如图5所示，纯明胶和1％黄连素的纳米纤维支架基本上没有生长抑 制。而当黄连素含量增加到5％和10％时，生长抑制区直径增加。纳米纤维敷料的生长抑制区 的大小取决于中层纤维的黄连素部分在整个内部纤维孔中产生的扩散距离。伤口感染中的细 菌通常来源于在伤口消毒中存活下来的细菌以及那些从外部环境入侵的细菌。本技术方案设 计的支架中层抗菌敷料旨在建立抗菌浓度最高的有效区，使外部入侵微生物在通过中间层的 过程中失活。
58.实施例4：
59.本实施例为功能一体化的多层级皮肤创面修复支架对脂肪干细胞形态试验：将脂肪干细 胞接种于功能一体化的多层级皮肤创面修复支架后培养3天，用4％多聚甲醛固定20min， 0.1％tritonx
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100溶液渗透5min，用1％牛血清白蛋白溶液封闭1h，然后用phalloidin
‑ꢀ
ifluor 488和dapi染色肌动蛋白细胞骨架和细胞核。在每个过程之间，样品用pbs洗涤三 次。显微镜采用荧光正置显微镜(尼康，东京，日本)获得。
60.图中6荧光显微图显示了脂肪干细胞在多层级支架上的细胞形态。脂肪干细胞的细胞骨 架呈穿梭状，形态拉伸。总体结果表明，功能一体化的多层级皮肤创面修复支架对脂肪干细 胞伸展有积极影响。
61.实施例5：
62.本实施例为功能一体化的多层级皮肤创面修复支架的动物实验，具体为：取280
±
10g 的sd大鼠9只，适应性喂养2天后，术前24h背部备皮。应用10％水合氯醛0.35ml/100g腹 腔注射，麻醉大鼠。碘伏扩大消毒术区，于背部用尺子设计4个直径为1.5cm大小的圆形， 无菌组织剪均匀去除全层皮肤，制造全层皮肤缺损模型，每隔一天观察创面情况，并常规消 毒。
63.创面制备完成后将大鼠随机分为4组，分别为空白组、纱布组、多层级修复支架组和多 层级修复支架负载脂肪干细胞组，其中空白组不做处理，纱布组给予大鼠创面覆盖纱布；多 层级修复支架组给予大鼠创面功能一体化的多层级皮肤创面修复支架处理；多层级修复支架 负载脂肪干细胞组给予大鼠创面负载上脂肪干细胞的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架 处理；分别于术后0、4、7和14天数码相机拍照创面愈合大体观。image
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pro plus 6.0软 件分析创面愈合情况。结果见图8。
64.如图8所示，多层级支架组和多层级支架负载脂肪干细胞组处理后的伤口部位经上皮化 几乎完全关闭，而纱布组和空白对照组的伤口部位保持不变。第4天时，空白组和纱布组明 显处于炎症感染期，而多层级支架组及多层级支架负载脂肪干细胞组的大鼠创面已结痂，所 形成的结痂防止外来微生物的入侵，第14天时，多层级支架负载脂肪干细胞组的创面明显 要小于其他三组。由此说明，本发明的功能一体化的多层级皮肤创面修复支架
调控脂肪干细 胞的分泌能加速伤口的愈合。