一种用于诊断肺癌的产品的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于诊断肺癌的产品。


背景技术：

2.肺癌是一种常见的恶性肿瘤，目前临床上用于肺癌诊断的方法有影像学检查、痰细胞病理学检查、支气管内镜检查及分子病理学检查等，然而这些方法不易操作，且容易出现假阳性。为了提高肺癌的诊断与治疗，近年来许多肿瘤标志物己经被应用于肺癌领域。
3.(1)癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，cea)：cea是一种蛋白多糖复合物，主要存在于消化道上皮组织、胰腺、肝脏、胆道、肺、乳腺等组织，为目前应用最广泛的肿瘤标志物，在多种癌症组织中均有异常表达。肺癌病人cea的阳性率约为50%，腺癌高于鳞癌，cea随着临床分期的增高，血清水平增加。
4.(2)细胞角蛋白19片段（cytokeratin19fragment，cyfra21
‑
1)：细胞角蛋白属于中间丝蛋白家族，广泛分布在正常组织表面，如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血。肺癌中腺癌、鳞癌均有ck19的表达，尤其是鳞癌。细胞角蛋白的测定对判断肺癌的分型分期，尤其对非小细胞肺癌中鳞癌的诊断具有重要临床价值。
5.(3)神经元特异性烯醇化酶（neuron
‑
specificenolase,nse)：nse是参与糖酵解途径的一种烯醇化酶，存在于神经组织和神经内分泌组织中。它被发现存在于神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是小细胞肺癌中有过量的nse表达，导致血清中nse明显升高。nse对小细胞肺癌有较高的敏感性，因此在小细胞肺癌诊疗方面优于其它肿瘤标志物。
6.(4)鳞状上皮细胞癌抗原（squanlouscellcarcinomaantigen,scc
‑
ag)：鳞状细胞癌相关抗原是一种糖蛋白，存在于子宫、子宫颈、肺、头颈等鳞状上皮细胞癌的细胞浆中，特别是非角化癌的细胞中。与cea相比，scc
‑
ag对肺鳞癌敏感性低但特异性高，而它的敏感性、特异性均不及cyfra21
‑
l。
7.(5)癌抗原
‑
125(cancerantigen125,ca125)：癌抗原125为一种糖蛋白性肿瘤相关抗原，存在于卵巢肿瘤的上皮细胞内。ca125最初发现在卵巢癌患者中有明显的增高，后来发现在肺癌患者血清ca125也有较高阳性率。
8.肿瘤标志物可以反映肿瘤的存在和变化，为其诊断提供指导，且检查方法简单、可重复性好，近年来己成为癌症诊断的研究热点。筛选出更加可靠的与肺癌诊断密切相关的的生物标志物，将为肺癌的诊断提供新方法。


技术实现要素：

9.本发明公开了可用于诊断肺癌的生物标志物，所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
10.一方面，本发明提供了一种用于诊断肺癌的产品，所述的产品包括检测受试者样品中生物标志物的试剂，所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
11.如本文中在诸如
ꢀ“
a和/或b
”ꢀ
的短语中使用的术语
ꢀ“
和/或
”ꢀ
旨在包括a和b两者；a或b；a(单独) ；以及b(单独)。同样地，在诸如
ꢀ“
a、b和/或c
ꢀ”ꢀ
的短语中使用的术语
ꢀ“
和/或
”ꢀ
旨在涵盖以下实施方案的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独) ；b(单独)；以及c(单独)。
12.术语
ꢀ“
生物标志物
”ꢀ
是指以可用于预测个体的癌症状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的dna。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的dna和rna。
13.在本发明中，生物标志物例如pcdh18（geneid：54510）、cdkn2a（geneid：1029）、hoxa9（geneid：3205），包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
14.术语
ꢀ“
受试者
”ꢀ
是指任何动物(例如，哺乳动物) ，包括，但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。进一步，受试者是人类受试者。术语
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受试者
”ꢀ
、
ꢀ“
个体”和
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患者
”ꢀ
在本文中可互换使用。因此，术语
ꢀ“
受试者
”ꢀ
、
ꢀ“
个体
”ꢀ
和
ꢀ“
患者
”ꢀ
涵盖患有癌症(例如，肺癌)的个体，包括已经经历或进行切除(手术)以去除癌组织的候选者的那些个体。
[0015]“生物样品”、“样品”、“样本”以及“试验样品”在本文可互换地用于指从个体获得或以另外的方式得到的任何材料、生物流体、组织或细胞。流体样品包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆以及血清)、痰、眼泪、粘液、洗鼻液、鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、腹水、细胞、细胞提取物、以及脑脊髓液。如果需要，样品可以是来自个体的样品的组合，如组织与流体样品的组合。术语“生物样品”还包括了含有均质化固体材料的材料，如例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查的材料。术语“生物样品”还包括源自于组织培养或细胞培养的材料。用于获得生物样品的任何适合的方法都可以采用；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)以及细针抽吸活组织检查程序。还可以例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(lcm)或激光显微解剖(lmd))、膀胱冲洗、涂片(例如，pap涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的“生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何适合的方式进行处理的任何此类样品，例如，新鲜冷冻或经过福尔马林固定和/或石蜡包埋的。
[0016]
进一步，所述的样品为组织。
[0017]
进一步，所述的试剂包括通过定量pcr、ngs、rna印迹(northern blot)、dna印迹(southern blot)、微阵列、sage、免疫测定(elisa、eia、凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹(western blot)、免疫沉淀法、免疫细胞化学、流式细胞术、luminex测定)或质谱法以确定受试者样品中的生物标志物的表达水平的试剂。
[0018]
进一步，所述的免疫测定包括elisa、eia、凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹(western blot)、免疫沉淀法、免疫细胞化学、流式细胞术、luminex测定。
[0019]
进一步，所述的试剂包括引物、探针、抗体。
[0020]“引物”是指寡核苷酸，它与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点
“
探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸 ( 往往称为“靶多核苷酸”) 结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0021]“抗体
”ꢀ
是指免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，该术语涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如fab、fab
ꢀ′ꢀ
、f(ab ')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚单位结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子缀合，包括但不限于毒素和放射性同位素。
[0022]
进一步，所述的产品包括试剂盒、核酸膜条、制剂、芯片。
[0023]
用于进行本文所描述的方法的试剂、工具和/或说明书可以被提供于试剂盒中。例如，试剂盒可以包含用于确定癌症患者的适当疗法的试剂、工具以及说明书。这种试剂盒可以包括用于从患者收集(如通过活组织检查)组织样品的试剂，和用于处理所述组织的试剂。所述试剂盒还可以包括用于进行基因或基因产物表达分析的一种或多种试剂，如通过定量pcr、ngs、rna印迹、dna印迹、微阵列、sage、免疫测定或质谱法以确定受试者样品中的生物标志物的表达水平的试剂。还可以包括用于测定的适当的缓冲液。还可以包括这些测定中的任一种所需的检测试剂。适当的试剂和方法在以下进行更详细的描述。
[0024]
本文所表征的试剂盒还可以包括一份说明单，它描述了如何进行这些测定来测量基因或基因产物表达。说明单还可以包括有关如何确定参考组的说明，包括如何确定参考组中的基因或基因产物标志物的表达水平和如何汇编表达数据以确立用于与试验患者相比较的参考。说明单还可以包括有关测定试验患者中基因或基因产物的表达和有关将所述表达水平与参考组中的表达相比较以便随后确定用于所述试验患者的适当化学疗法的说明。用于确定适当化学疗法的方法在以上进行了描述并且可以在说明单中详细地描述。
[0025]
试剂盒中所包括的信息材料可以是涉及本文所描述的方法和/或用于本文所描述的方法的试剂的使用的描述性、指导性、销售或其它材料。例如，试剂盒的信息材料可以包含联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的使用者可以获得关于进行基因表达分析和解释结果的大量信息，特别是在它们应用于可能对特定治疗剂具有阳性反应的人类时。
[0026]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌，优选的，所述的肺癌为肺鳞癌。
[0027]
另一方面，本发明提供了适用于诊断肺癌的装置，其包含：a) 包含特异性结合生物标志物的一种或多种检测试剂的分析器单元，所述单元适用于测定样品中的一种或多种生物标志物的量；和
b) 用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此诊断肺癌，所述单元包含一个或多个参考量的数据库和用于实施比较的计算机执行的算法；所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
[0028]
如本文所使用，术语“比较”涵盖将由待分析的样品包含的如本文提及的生物标志物的量（表达水平）与本说明书中别处指定的合适参考来源的量进行比较。应当理解如本文所使用的比较是指相应参数或值的比较，例如绝对量与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度比较，或得自测试样品的强度信号与参考样品的相同类型的强度信号比较。本发明的方法的步骤(b)中提及的比较可以手动或通过计算装置实施。对于计算机辅助比较，测定量的值可以与对应于合适参考的值比较，所述合适参考的值通过计算机程序存储于数据库中。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以合适输出格式自动化提供所需评估。所述结果可以，优选地，充当评价对象是否应当进行如本文别处所述的基于成像的诊断评价的辅助手段。例如，比较的结果可以以原始数据给出(绝对或相对量)，而在一些情况下以词语、短语、符号、或数值的形式的指示物给出，其可以指示具体的诊断。因此，应当选择参考量使得比较的量中的差异或相似性允许实施本发明的诊断。
[0029]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌。
[0030]
进一步，所述的肺癌为肺鳞癌。
[0031]
另一方面，本发明提供了生物标志物在制备用于诊断肺癌的产品中的用途，所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
[0032]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌。
[0033]
进一步，所述的肺癌为肺鳞癌。
[0034]
另一方面，本发明提供了生物标志物在制备用于诊断肺癌的产品中的用途，所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
[0035]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌。
[0036]
进一步，所述的肺癌为肺鳞癌。
[0037]
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括pcdh18的促进剂、cdkn2a的抑制剂和/或hoxa9的抑制剂。
[0038]
在一些实施方案中，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。
[0039]“药学可接受的”意指不降低活性成分的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的 (见remington’s pharmaceutical sciences,第18版, a.r gennaro编, mack publishing company(1990)及handbook of pharmaceutical excipients, 第3版, a.kibbe编, pharmaceutical press(2000)）。
[0040]
术语“缓冲液”意图指以稳定ph为目的的含有酸
‑
碱混合物的水溶液。 缓冲液的例子是trizma、bicine、tricine、mops、mopso、mobs、tris、 hepes、hepbs、mes、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐 (glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、aces、ada、酒石酸盐、amp、ampd、 ampso、bes、cabs、卡可酸盐(cacodylate)、ches、dipso、epps、乙醇胺、甘氨酸、heppso、咪唑、咪唑乳酸、pipes、ssc、sspe、popso、taps、tabs、tapso和tes。
[0041]
本发明所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分
散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。
[0042]
赋形剂可以是下列一种或多种：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇、和环状糊精，其被添加至组合物， 例如以便于冻干。聚合物的例子是不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐(alginates)、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或具有各种组成的其共聚物、及聚乙烯吡咯烷酮(它们都具有不同分子量)，其被添加至组合物，例如以控制粘性，实现生物粘着，或保护活性成分免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单、二和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和度)、蛋卵磷脂(egg lecithin)、大豆卵磷脂、氢化的卵磷脂和大豆卵磷脂，其出于与聚合物相似的原因被添加至组合物。矿物的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加至组合物以获得诸如降低液体积累或有利的色素特性等益处。
[0043]
另一方面，本发明提供了前面所述的药物组合物在制备预防或治疗肺癌的药物中的应用。
[0044]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌。
[0045]
进一步，所述的肺癌为肺鳞癌。
[0046]
另一方面，本发明提供了生物标志物在筛选预防或治疗肺癌的候选药物中的应用，所述的生物标志物包括pcdh18、cdkn2a和/或hoxa9。
[0047]
进一步，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌。
[0048]
进一步，所述的肺癌为肺鳞癌。
附图说明
[0049]
图1为pcdh18差异表达的箱线图；图2为cdkn2a差异表达的箱线图；图3为hoxa9差异表达的箱线图；图4为pcdh18诊断肺鳞癌的roc曲线图；图5为cdkn2a诊断肺鳞癌的roc曲线图；图6为hoxa9诊断肺鳞癌的roc曲线图；图7为pcdh18和cdkn2a联合诊断肺鳞癌的roc曲线图；图8为cdkn2a和hoxa9联合诊断肺鳞癌的roc曲线图；图9为pcdh18和hoxa9联合诊断肺鳞癌的roc曲线图；图10为pcdh18 cdkn2a hoxa9联合诊断肺鳞癌的roc曲线图。
具体实施方式
[0050]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0051]
实施例1 肺鳞癌差异表达基因
从癌症基因组图谱数据库(tcga)中下载肺鳞癌的原始数据，之后在r中进行了取对数的处理，以用于后续的分析。去除临床信息不完整的样本后，tcga队列中包含的样本数为癌旁：癌=49:502。
[0052]
使用r软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为adj.pvalue<0.01，|log2fc|>1。在此标准下，tcga中差异表达的基因有8571个，上调的差异表达基因有5455个，下调的差异表达基因有3116个。本发明所涉及的基因在肺鳞癌中的表达情况如图1
‑
3、表1所示。
[0053]
表1 基因差异表达数据实施例2 诊断效能分析本发明使用r语言proc对上述基因进行roc诊断分析，以筛选具有诊断价值的生物标志物。roc曲线下面积越大，诊断价值越高。
[0054]
本发明所涉及的生物标志物及生物标志物组合的诊断效能数据如图4
‑
10，表2所示，与单个生物标志物相比，生物标志物组合具有更好的诊断效能。该结果证明，本发明所涉及的生物标志物及生物标志物组合可用于诊断肺鳞癌。
[0055]
表2 生物标志物及生物标志物组合的诊断效能上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。