一种生鲜果蔬中专用于敌敌畏农药残留的快速检测方法与流程

1.本发明属于农药残留快速检测领域，具体涉及ache酶的超高灵敏荧光探针底物及其应用。


背景技术：

2.敌敌畏（ddvp,dichlorvos）是有机磷杀虫剂的一种，杀虫谱广，药效迅速，具有胃毒、触杀和熏蒸作用，可防治菜青虫、小菜蛾、蚜虫、菜螟、黄曲条跳甲、黏虫、甘蓝夜蛾、斜纹夜蛾、红蜘蛛、大猿叶虫等，对害虫击倒力强而快，常被用于蔬菜瓜果临近收获时害虫的防治。如果临近果蔬采摘前、或超量使用敌敌畏，易造成残留超标对人体造成危害。近些年市场监管部门时有敌敌畏在苹果、梨、芹菜、西红柿等果蔬中残留超标的报道，因此，开发一种可便利、准确、快速检测果蔬中敌敌畏残留量检测方法显得十分必要。
3.农药残留检测技术主要分为传统检测和快速检测。传统检测主要涉及气相色谱、液相色谱及其和质谱技术的联用，检测成本高、耗时长，不利于大范围、高通量展开。近年发展起来的荧光探针技术应用于酶抑制原理，可实现高通量、广谱、快速检测农残。中国发明专利（zl201810408171.6）以罗丹荧为母体合成了可检测乙酰胆碱酯酶（ache）活性的荧光探针ndro
‑
1，基于酶抑制原理开发了可快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药方法。有机磷和氨基甲酸酯类农药对ache酶都具有一定的抑制能力，这类基于酶抑制原理的检测方法，还难于实现对果蔬中敌敌畏农残的专项检测。国家标准gb/t5009.199
‑
2003（蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测，水解底物为乙酰胆碱）中农残检出限为：甲胺磷2.0mg/kg、敌敌畏0.1mg/kg、呋喃丹0.05mg/kg；本专利申请人发表的硕士论文（张淑芳，鸭血胆碱酯酶近红外荧光检测探针的研究，2018年，水解底物为荧光探针）中农残检出限为：甲胺磷0.03mg/l、敌敌畏0.2
µ
g/l、呋喃丹0.02mg/l。分别应用胆碱酯和荧光探针2种底物建立的检测方法所得到的农残检测限巨大差异，显示2种底物所作用的ache酶活性中心位点不同，并且利用荧光探针方法中超低的敌敌畏检测限，改进检测方法应用于专项检测敌敌畏农残成为可能。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种ache酶（从鸭血中提取）的荧光检测探针在敌敌畏专项农残检测中的应用。该底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物荧光具有更高的灵敏度。利用该探针可对ache快速检测方法，间接实现敌敌畏农残的定量检测。利用荧光探针方法中超低的敌敌畏检测限，改进检测方法应用于专项检测敌敌畏农残成为可能。
5.本发明提供了一种ache的荧光检测探针，该底物的酯键可以被ache水解，生成具有荧光属性的产物。该底物结构如式
‑
1所示。
6.本发明还提供了检测ache荧光探针底物的应用。作为ache的底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶的活性；具体测定方法为：——体系中以罗丹荧探针衍生物作为酶底物；反应体总系积为335
µ
l，底物浓度选择1.0~20
µ
m，单点测定时底物浓度优选10
µ
m；ache酶浓度为34
µ
g/ml；——在pbs缓冲液中，反应温度优选37
o
c；优选ph7.4为最优反应ph值；——ache酶与农残反应的预孵时间为7min；探针与酶的反应时间为12min，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限；物转化率不超过35％时终止反应；——反应结束后，加入200
µ
l乙腈作为终止剂，使最后的荧光强度检测操作更简便。
7.间接地定量体系中敌敌畏含量的方法，包括以下步骤：s1.将萃取的溶液稀释100倍，使待测溶液中农药的含量为0.1~6μg/l；s2.向稀释后的萃取溶液中，加入酶剂，在恒温混匀仪37
o
c下，预孵反应7min；s3.取预孵溶液加入比色皿，再加入含荧光探针的dmso溶液，在恒温混匀仪37
o
c下，震荡反应；向比色皿加入终止剂，混匀，得到1号待测溶液；s4.启动荧光检测仪；将比色皿放入检测仪，在手机app上读取数据，保存。
8.s5.酶活性抑制率计算公式：抑制率（%）=[(a0–
a1）/a0]
·
100式中，a0为无农药的空白相对荧光强度，a1为含农药的测试组相对荧光强度；s6.根据相对荧光强度计算抑制率，再根据抑制率计算出萃取液中敌敌畏的含量；s7.根据测得的萃取液中敌敌畏的含量乘上稀释倍数200，得到果蔬样品中敌敌畏的含量。
[0009]
该探针底物本身没有荧光，而其水解产物具有荧光属性，采用荧光快速检测仪实现产物及底物的快速灵敏检测；所述荧光检测条件为：激发波长465nm，在550～560nm进行荧光发射谱的检测。
[0010]
特异性检测敌敌畏的原理为：以上方法适用于检测体系中敌敌畏加标量与其他农药加标量相同时，敌敌畏减弱的荧光强度（i
敌敌畏
）比其他农药（i
其他农药
）要低100倍以上，通过对农残萃取液稀释100倍，其他农药浓度减低至无法测定程度，进而可以减除其他农药对ache的影响，实现特异性检测敌敌畏。
[0011]
有益效果：基于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（ache，来源于鸭血提取）活性的特异性抑制作用，应用超高灵敏荧光素荧光探针检测其抑制程度。在这个检测体系中敌敌畏加标量相同时，敌敌畏减弱的荧光强度（i
敌敌畏
）比其他农药（i
其他农药
）要低100倍以上，显示即使敌敌畏含量低于其他农药100倍时，也可定量检测其残留量。通过对农残萃取液稀释100倍，减除其他农残对ache的影响，实现特异性检测敌敌畏农残范围10~200μ
g/l，检测标准曲线误差率r2>0.98；生鲜果蔬的加标回收率达到80
‑
110%。
[0012]
说明书附图图1是农药检测的机理图。
[0013]
图2是敌敌畏的标准曲线图。
具体实施方式
[0014]
实施例1：荧光探针底物式
‑
1合成合成路线：中间体b的合成：称取2.00g荧光素a，1.71gcs2co3，加入10mldmf溶解，室温下搅拌，滴加0.75g（0.75ml）ch3i。反应结束后，加入5%的氢氧化钠溶液，用dcm萃取，有机相用饱和食盐水洗涤后，蒸留除去溶剂，得中间体b1.55g，产率71.4%。1hnmr（500mhz,cdcl3）δ8.24（d,j=7.9hz,1h）,7.74（t,j=7.2hz,1h）,7.67（t,j=7.6hz,1h）,7.31（d,j=7.5hz,1h）,6.97（d,j=2.3hz,1h）,6.87（dd,j=18.1,9.3hz,1h）,6.74（dd,j=8.9,2.3hz,1h）,6.54（d,j=9.7hz,1h）,6.47（s,1h）,3.92（s,2h）,3.64（s,1h）。
[0015]
中间体c的合成：取中间体b0.800g，加入20mlch3oh，10%的naoh溶液5ml，室温下搅拌6h水解。蒸馏除去甲醇后，用10ml（36%浓盐酸:水=1:11）中和，用dcm萃取，除去dcm得粗品。用硅胶层析柱纯化（展开剂dcm:ch3oh=40:1），得中间体c0.40g，产率52%。1hnmr（500mhz,meod）δ8.02（d,j=7.7hz,1h）,7.79（td,j=7.5,1.1hz,1h）,7.74
‑
7.69（m,1h）,7.22（d,j=7.7hz,1h）,6.87（d,j=1.7hz,1h）,6.75
‑
6.64（m,3h）,6.57（dt,j=8.7,5.5hz,2h）,4.89（s,8h）,3.86（s,3h）,3.34（dd,j=11.3,9.7hz,6h）。
[0016]
探针式
‑
1的合成：取中间体c40mg，加入10滴三乙胺及0.125ml乙酰氯，冰浴下搅拌，反应结束后，用dcm萃取，蒸馏除去dcm后，用硅胶层析柱纯化（展开剂dcm:ch3oh=50:1），得荧光探针式
‑
117mg，产率37.8%。1hnmr（500mhz,cdcl3）δ8.03（d,j=7.5hz,1h）,7.66（ddt,j=14.0,7.4,3.8hz,1h）,7.18（d,j=7.6hz,1h）,7.07（t,j=7.0hz,1h）,6.88
‑
6.75（m,1h）,6.70（d,j=8.8hz,1h）,6.63（dd,j=8.8,2.5hz,1h）,5.30（s,1h）,3.84（s,2h）,2.49
‑
2.19（m,2h）。
[0017]
实施例2：果蔬中农残萃取方法：蔬菜、水果的可食用部分，称取试样0.3g于2ml的离心管中，加入1.5ml萃取液（乙酸乙酯/丙酮=9:1），在震荡混合器萃取5min。离心后，取100μl上清液至2ml离心管中，吹干。加入0.6mlpbs（100mm,ph=7.4）溶解，待测。
[0018]
实施例3：农残检测通用方法1. 从前处理制备得到的0.6ml待测萃取剂（或加标农药的pbs溶液，或pbs溶液）取6
µ
l，再用pbs（100mm,ph=7.4）稀释100倍至600
µ
l；2.向稀释后的萃取液300
µ
l加入5
µ
l酶剂（从鸭血提取，ache蛋白含量2.3mg/ml），在恒温混匀仪37
o
c下，预孵反应7min；
3.取预孵溶液300
µ
l，加入比色皿，再加入含荧光探针（非特指为式
‑
1荧光探针）的dmso溶液30
µ
l，在恒温混匀仪37
o
c下，震荡反应12min；4.向比色皿加入200
µ
l终止剂b，混匀，待测；5.启动荧光检测仪，与手机app链接；根据荧光探针不同，设置相应的激发波长和发射接收波长；6.将比色皿放入检测仪，在手机app上读取数据，保存；7.酶活性抑制率计算公式：抑制率（%）=[(a0–
a1）/a0]
·
100式中，a0为空白（无农药）相对荧光强度，a1为测试组（含农药）相对荧光强度。
[0019]
实施例4：本技术中荧光探针式
‑
1与ndro
‑
1两种荧光探针底物对ache酶活性对比按照实施例2操作方法，检测体系中无农药加标，只改换探针底物的种类和浓度，其他检测条件相同。
[0020]
本技术中荧光探针底物：本技术中探针式
‑
1与ndro
‑
1相比，对ache酶结合能力和催化活性等动力学常数都有较大的提高。反应后的探针式
‑
1的相对荧光强度是ndro
‑
1的2.5倍，显示了更高的灵敏性。探针式
‑
1的结构和性能特点，能充分发挥特异性检测敌敌畏农残方法的优势。
[0021]
实施例5：不同农药检测限比较按照实施例2操作方法，检测体系中不同浓度加标敌敌畏、甲胺磷、呋喃丹，探针底物为式
‑
1，其他检测条件相同。
[0022]
在pbs（100mm，ph=7.4）加标农药0.1mg/l检测中，甲胺磷或呋喃丹对荧光强度减弱很少，敌敌畏对荧光强度减弱至仪器的最低检测限，显示在相同农药含量下敌敌畏比其他农药对荧光强度减弱100倍左右。
[0023]
实施例6：敌敌畏检测标准曲线根据标准曲线的测定方法，得到抑制率（%）与敌敌畏浓度之间的标准曲线为y=
12.955x 14.893，r2=0.9945，x为敌敌畏的浓度；敌敌畏在pbs缓冲液中的检测范围为0.1~6.0
µ
g/l；再根据检测方法的总稀释倍数200，换算得到果蔬样品的检测范围为0.02~1.2mg/kg。该检测范围可以满足国标对果蔬中敌敌畏的限量要求（国家标准gb/t2763
‑
2019，食品安全国家标准
‑
食品中农药最大残留限量，敌敌畏：0.1~0.5mg/kg）。
[0024]
实施例7：混合农药加标的影响在pbs（100mm，ph=7.4）中加标，敌敌畏、敌敌畏 甲胺磷、敌敌畏 呋喃丹、敌敌畏 甲胺磷 呋喃丹,再用pbs（100mm，ph=7.4）稀释100倍后，按实施例3检测，根据抑制率计算结果再乘以总稀释倍数100。
[0025]
通过以上实验可以看出，甲胺磷、呋喃丹等农药含量对该探针检测敌敌畏的含量影响较小，该方法可以专用于敌敌畏含量的检测。
[0026]
实施例8：敌敌畏农残回收率测试将敌敌畏的丙酮溶液，按0.10mg/kg量，喷洒在0.30g果蔬上,晾干后，按照实施例2萃取，萃取液再用pbs（100mm,ph=7.4）稀释100倍，最后按照实施例3检测，根据抑制率计算结果再乘以总稀释倍数200。
[0027]
本发明的检测方法，对果蔬中敌敌畏农残回收率达到行业70~110%标准。