促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基及诱导方法与流程

1.本发明涉及组织培养技术领域，更具体地说是涉及促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基及培养方法。


背景技术：

2.金铁锁为石竹科(caryophyllaceae)金铁锁属(psammosilene)草本植物，主要分布于我国贵州、云南、四川、西藏等地，生长在海拔2000～3800m的砾石山坡或石灰质岩石缝中。金铁锁是一种濒危药用植物，其根可入药，具有散淤止痛、排毒止血等功能。野生金铁锁植株的茎一般呈现紫绿色，开花期间花瓣为粉紫色，在组织培养过程中，愈伤组织一般照光情况下也会产生紫色的愈伤组织，所以金铁锁细胞有合成天然色素的能力。
3.花青素是一种天然食用色素，具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面应用广泛。目前国内市场所用的花青素多为合成色素，存在许多未知风险，而植物体内的天然色素则具有安全、无毒等优势。花青素虽广泛存在与自然界中，但环境因素严重影响原材料的获取，所以利用组织培养生产花青素即为一种有效途径。现有技术中，通常以ms培养基对植物组织进行诱导产生花青素，但大量元素、琼脂、糖类等营养元素的添加无疑是增加了生产成本。
4.魔芋是一类提供魔芋葡甘聚糖(kgm)的优质农作物。kgm具有无毒无害，吸水性强、营养物质丰富、促进微量元素吸收等重要性质。在普通的植物组织培养基中，需要提供大量元素、微量元素、铁盐、有机元素琼脂和糖类构成一个完整的培养基，利用魔芋可节省这些材料的投入成本，加以改进利用可以构成一种新型的天然魔芋培养基。
5.因此，如何提供一种以魔芋为主要成分的诱导培养基及培养方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基，促进了毛状根的脱分化，脱分化率达到100％，而且，提高了愈伤组织的诱导率，诱导率高达100％；生长速度提高40％以上；花青素的含量提高10％以上，节约了成本。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基，包括：魔芋培养基其中，每升魔芋培养基包括：魔芋粉2.7
‑
8.7g、铁粉0.10
‑
0.30g、硝酸钾1.5
‑
2.0g。
9.一种促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的诱导方法，包括下述过程：
10.1)诱导愈伤组织：以ar.a4菌液和魔芋培养基诱导金铁锁无菌苗产生毛状根，再先后以魔芋培养基对毛状根增殖、诱导，获得愈伤组织；
11.2)诱导花青素：将步骤1)所得愈伤组织置于魔芋培养基中，每升魔芋培养基中加入6
‑
ba1
‑
3mg、iaa0.1
‑
2mg、kt0.1
‑
1mg和0.01％ge
‑
132，在光照条件为2500
‑
3000lx下，22
‑
25℃培养15d；
12.3)继代培养：将含有花青素的愈伤组织转入魔芋培养基中光照2500
‑
3000lx、22
‑
25℃培养30d；每升魔芋培养基中加入6
‑
ba1
‑
3mg、iaa0.1
‑
2mg、kt0.1
‑
1mg和0.01％ge
‑
132，使花青素大量积累；
13.4)提取花青素：以提取剂提取步骤3)所得的愈伤组织中的花青素。
14.作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述ar.a4菌液od
600
为0.6
‑
0.8。
15.作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述诱导为将增殖后的毛状根捏成团，接种到魔芋培养基中进行诱导，每升魔芋培养基中加入2,4
‑
d1
‑
3mg和6
‑
ba1
‑
2mg。
16.作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，所述提取剂为盐酸
‑
甲醇提取剂，且浓度为1
‑
3％。
17.作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，提取花青素时料液比为1:10～1:15，提取时间为5
‑
20h，提取温度为4
‑
50℃。
18.由以上技术方案可知，本发明达到的技术效果是：
19.(1)利用魔芋制成天然培养基能够利用魔芋本身的营养物质为金铁锁无菌苗提供大量元素、微量元素及碳源；另外，利用魔芋葡甘聚糖的特性使其自身具有良好的凝固性减少琼脂的加入，节约了培养成本，天然的培养基也使其培养的目标产物更加安全可信；魔芋培养基促进外植体诱导出愈伤组织，时间缩短至7d左右；而且，魔芋培养基促进愈伤组织生长，单位时间内生物量提高80％；同时，魔芋培养基具有诱导花青素合成的作用，使花青素提高3倍以上；
20.(2)由于人工合成色素大多对人体健康存在一定的安全隐患，而天然色素基本无毒副作用。本发明以金铁锁无菌苗茎端叶片为外植体诱导毛状根，再用毛状根诱导产生愈伤组织并继代增殖，再选择适宜的植物激素和光照条件，从而诱导其愈伤组织积累花青素，避免了副作用的产生；
21.(3)发根农杆菌ar.a4中的ri质粒具有使浸染后的植物细胞快速增殖、遗传稳定、并激发自身合成所需目的激素，促进自身有利细胞的生长的优势，所以，ar.a4的加入可以促进毛状根的生成，又因，毛状根增殖快、自身能合成部分植物生长调节剂，可以减少激素的使用浓度，可在短期内获得较高产量的花青素；
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
23.图1附图为本发明提供的毛状根诱导示意图；
24.图2附图为本发明提供的愈伤组织示意图；
25.图3附图为本发明提供的合成花青素后的愈伤组织的示意图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1魔芋培养基的制备
28.(1)准确称取2.7g魔芋粉加入1l水，搅拌均匀等待其溶胀达到稳定；
29.(2)55℃恒温水浴加热加入盐酸搅拌2h左右；
30.(3)加入0.10mg铁粉加入到培养基中混合均匀；
31.(4)加入1.5g硝酸钾并且调整其ph至7.5。
32.实施例2魔芋培养基的制备
33.(1)准确称取8.7g魔芋粉加入1l水，搅拌均匀等待其溶胀达到稳定；
34.(2)55℃恒温水浴加热加入盐酸搅拌2h左右；
35.(3)加入0.30mg铁粉加入到培养基中混合均匀；
36.(4)加入2.0g硝酸钾并且调整其ph至7.5。
37.实施例3
38.魔芋培养基的制备
39.(1)准确称取4.2g魔芋粉加入1l水，搅拌均匀等待其溶胀达到稳定；
40.(2)55℃恒温水浴加热加入盐酸搅拌2h左右；
41.(3)加入0.20mg铁粉加入到培养基中混合均匀；
42.(4)加入1.75g硝酸钾并且调整其ph至7.5。
43.实施例4
44.利用实施例1制备的魔芋培养基诱导产花青素的方法，包括：
45.1)金铁锁毛状根的诱导
46.(11)将金铁锁幼嫩的叶片及茎分别放在魔芋培养基上光照条件下进行预培养48h；
47.(12)将ar.a4发根农杆菌菌液在28℃、130r/min黑暗下培养至od
600
＝0.7；
48.(13)将浓度为20mg/l的乙酰丁香酮与菌液共同摇匀30min；
49.(14)将步骤(11)预培养的金铁锁茎、叶与步骤(13)处理好的菌液一起摇匀25min；
50.(15)将步骤(14)处理完的茎、叶分别擦干置于魔芋培养基上共培养直至周围长出菌斑；
51.(16)将步骤(15)中的材料用加入cef500mg/l的魔芋培养基进行除菌处理，直至农杆菌完全清除干净；
52.(17)将步骤(16)中的材料培养至产生毛状根，将其剪下进行高浓度抗生素的抗性筛选；
53.(18)将步骤(17)中的生长旺盛的毛状根进行扩大培养并进行碱性硝酸银显色的冠瘿碱检测，出现棕色斑点证明诱导成功；见图1；
54.2)外植体选择与愈伤组织的诱导
55.以金铁锁叶片诱导的毛状根作为外植体，选用组培瓶，以魔芋培养基，添加2,4
‑
d2mg/l、6
‑
ba1.5mg/l，每个培养基接种5个毛状根尖，培养温度为25℃，黑暗条件，培养7d后产生愈伤组织，30d后继代增殖培养以获得大量愈伤组织；见图2；
56.3)花青素的诱导与积累
57.花青素的诱导：由于非胚性愈伤组织质地疏松，细胞相对较大，内含大液泡，且色素大多存在于液泡内，因此须挑选质地疏松的白色愈伤组织用于花青素的诱导。称取4g白色愈伤愈伤组织分别置于培养基中，以魔芋培养基，外加6
‑
ba2mg/l、iaa0.6mg/l、kt0.2mg/l和0.01％ge
‑
132培养温度为23℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d；培养15d；
58.4)继代培养：金铁锁白色愈伤组织产生少量花青素后需进行继代培养以积累大量的花青素；继代培养时称取3.0g带有花青素的愈伤组织置于魔芋培养基中，添加6
‑
ba2mg/l iaa0.6mg/l kt0.2mg/l 0.01％ge
‑
132,培养温度为23℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d，30d后可使90％以上愈伤组织形成花青素，见图3；
59.5)金铁锁毛状根愈伤组织花青素的提取
60.选择有花青素积累的愈伤组织(用滤纸吸干愈伤组织表面水分)，平均称取1g愈伤组织于研钵中研碎，加10ml3％盐酸
‑
甲醇转移至25ml试管中，并于32℃水浴锅中提取18h，再置于n＝530nm处测定吸光值，每个处理重复3次。计算色素提取率，色素提取率达5.6％。
61.提取率的计算公式：
62.注：上式中：a为色素在530nm波长处的吸光度；v为定容体积；n为比色时的稀释倍数；98.2为色素在530nm波长处的消光系数；m为愈伤组织质量。
63.实施例5
64.利用实施例1制备的魔芋培养基诱导产花青素的方法，包括：
65.1)金铁锁毛状根的诱导
66.(11)将金铁锁幼嫩的叶片及茎分别放在魔芋培养基上光照条件下进行预培养48h；
67.(12)将ar.a4发根农杆菌菌液在28℃、130r/min黑暗下培养至od
600
＝0.6；
68.(13)将浓度为20mg/l的乙酰丁香酮与菌液共同摇匀30min；
69.(14)将步骤(11)预培养的金铁锁茎、叶与步骤(13)处理好的菌液一起摇匀25min；
70.(15)将步骤(14)处理完的茎、叶分别擦干置于魔芋培养基上共培养直至周围长出菌斑；
71.(16)将步骤(15)中的材料用加入cef500mg/l的魔芋培养基进行除菌处理，直至农杆菌完全清除干净；
72.(17)将步骤(16)中的材料培养至产生毛状根，将其剪下进行高浓度抗生素的抗性筛选；
73.(18)将步骤(17)中的生长旺盛的毛状根进行扩大培养并进行碱性硝酸银显色的冠瘿碱检测，出现棕色斑点证明诱导成功；
74.2)外植体选择与愈伤组织的诱导
75.以金铁锁叶片诱导的毛状根作为外植体，选用组培瓶，以魔芋培养基，添加2,4
‑
d 3mg/l、6
‑
ba 2mg/l，每个培养基接种5个毛状根尖，培养温度为22℃，黑暗条件，培养7d后产生愈伤组织，30d后继代增殖培养以获得大量愈伤组织；
76.3)花青素的诱导与积累
77.花青素的诱导：由于非胚性愈伤组织质地疏松，细胞相对较大，内含大液泡，且色素大多存在于液泡内，因此须挑选质地疏松的白色愈伤组织用于花青素的诱导。称取4g白
色愈伤愈伤组织分别置于培养基中，以魔芋培养基，外加6
‑
ba3mg/l、iaa2mg/l、kt1mg/l和0.01％ge
‑
132，培养温度为25℃，光照强度为2800lx，光照时间为12h/d，培养15d；
78.4)继代培养：金铁锁白色愈伤组织产生少量花青素后需进行继代培养以积累大量的花青素。继代培养时称取3.0g带有花青素的愈伤组织置于魔芋培养基中，添加6
‑
ba3mg/l iaa2mg/l kt1mg/l 0.01％ge
‑
132,培养温度为25℃，光照强度为2800lx，光照时间为12h/d，30d后可使90％以上愈伤组织形成花青素。
79.5)金铁锁毛状根愈伤组织花青素的提取
80.选择有花青素积累的愈伤组织(用滤纸吸干愈伤组织表面水分)，平均称取1g愈伤组织于研钵中研碎，加25ml1％盐酸
‑
甲醇转移至25ml试管中，并于50℃水浴锅中提取5h，再置于n＝530nm处测定吸光值，每个处理重复3次。计算色素提取率，色素提取率5.6％。
81.提取率的计算公式：
82.注：上式中：a为色素在530nm波长处的吸光度；v为定容体积；n为比色时的稀释倍数；98.2为色素在530nm波长处的消光系数；m为愈伤组织质量。
83.实施例6
84.利用实施例1制备的魔芋培养基诱导产花青素的方法，包括：
85.1)金铁锁毛状根的诱导
86.(11)将金铁锁幼嫩的叶片及茎分别放在魔芋培养基上光照条件下进行预培养48h；
87.(12)将ar.a4发根农杆菌菌液在28℃、130r/min黑暗下培养至od
600
＝0.8；
88.(13)将浓度为20mg/l的乙酰丁香酮与菌液共同摇匀30min；
89.(14)将步骤(11)预培养的金铁锁茎、叶与步骤(13)处理好的菌液一起摇匀25min；
90.(15)将步骤(14)处理完的茎、叶分别擦干置于魔芋培养基上共培养直至周围长出菌斑；
91.(16)将步骤(15)中的材料用加入cef500mg/l的魔芋培养基进行除菌处理，直至农杆菌完全清除干净；
92.(17)将步骤(16)中的材料培养至产生毛状根，将其剪下进行高浓度抗生素的抗性筛选；
93.(18)将步骤(17)中的生长旺盛的毛状根进行扩大培养并进行碱性硝酸银显色的冠瘿碱检测，出现棕色斑点证明诱导成功；
94.2)外植体选择与愈伤组织的诱导
95.以金铁锁叶片诱导的毛状根作为外植体，选用组培瓶，以魔芋培养基，添加2,4
‑
d 1mg/l、6
‑
ba 1mg/l，每个培养基接种5个毛状根尖，培养温度为23℃，黑暗条件，培养7d后产生愈伤组织，30d后继代增殖培养以获得大量愈伤组织；
96.3)花青素的诱导与积累
97.花青素的诱导：由于非胚性愈伤组织质地疏松，细胞相对较大，内含大液泡，且色素大多存在于液泡内，因此须挑选质地疏松的白色愈伤组织用于花青素的诱导。称取4g白色愈伤愈伤组织分别置于培养基中，以魔芋培养基，外加6
‑
ba1mg/l、iaa0.1mg/l、kt0.1mg/l和0.01％ge
‑
132，培养温度为22℃，光照强度为3000lx，光照时间为12h/d，培养15d；
98.4)继代培养：金铁锁白色愈伤组织产生少量花青素后需进行继代培养以积累大量的花青素。继代培养时称取3.0g带有花青素的愈伤组织置于魔芋培养基中，添加6
‑
ba3mg/l iaa2mg/l kt1mg/l 0.01％ge
‑
132,培养温度为25℃，光照强度为2800lx，光照时间为12h/d，30d后可使90％以上愈伤组织形成花青素。
99.5)金铁锁毛状根愈伤组织花青素的提取
100.选择有花青素积累的愈伤组织(用滤纸吸干愈伤组织表面水分)，平均称取1g愈伤组织于研钵中研碎，加25ml1％盐酸
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甲醇转移至25ml试管中，并于50℃水浴锅中提取5h，再置于n＝530nm处测定吸光值，每个处理重复3次。计算色素提取率，色素提取率为46％
‑
51％。
101.实施例7
102.利用实施例1制备的魔芋培养基诱导产花青素的方法，包括：
103.1)金铁锁毛状根的诱导
104.(11)将金铁锁幼嫩的叶片及茎分别放在魔芋培养基上光照条件下进行预培养48h；
105.(12)将ar.a4发根农杆菌菌液在28℃、130r/min黑暗下培养至od
600
＝0.8；
106.(13)将浓度为20mg/l的乙酰丁香酮与菌液共同摇匀30min；
107.(14)将步骤(11)预培养的金铁锁茎、叶与步骤(13)处理好的菌液一起摇匀25min；
108.(15)将步骤(14)处理完的茎、叶分别擦干置于魔芋培养基上共培养直至周围长出菌斑；
109.(16)将步骤(15)中的材料用加入cef500mg/l的魔芋培养基进行除菌处理，直至农杆菌完全清除干净；
110.(17)将步骤(16)中的材料培养至产生毛状根，将其剪下进行高浓度抗生素的抗性筛选；
111.(18)将步骤(17)中的生长旺盛的毛状根进行扩大培养并进行碱性硝酸银显色的冠瘿碱检测，出现棕色斑点证明诱导成功；
112.2)外植体选择与愈伤组织的诱导
113.以金铁锁叶片诱导的毛状根作为外植体，选用组培瓶，以魔芋培养基，添加2,4
‑
d 3mg/l、6
‑
ba 2mg/l，每个培养基接种5个毛状根尖，培养温度为(25
±
1)℃，黑暗条件，培养7d后产生愈伤组织，30d后继代增殖培养以获得大量愈伤组织；
114.3)花青素的诱导与积累
115.花青素的诱导：由于非胚性愈伤组织质地疏松，细胞相对较大，内含大液泡，且色素大多存在于液泡内，因此须挑选质地疏松的白色愈伤组织用于花青素的诱导。称取4g白色愈伤愈伤组织分别置于培养基中，以魔芋培养基，外加6
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ba2mg/l、iaa0.6mg/l、kt0.2mg/l和0.01％ge
‑
132，培养温度为(23
±
1)℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d。
116.4)花青素的积累：金铁锁白色愈伤组织产生少量花青素后需进行继代培养以积累大量的花青素。继代培养时称取3.0g带有花青素的愈伤组织置于魔芋培养基中，添加6
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ba2mg/l iaa0.6mg/l kt0.2mg/l 0.01％ge
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132，培养温度为(23
±
1)℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d，30～40d后可使90％以上愈伤组织形成花青素。
117.5)金铁锁毛状根愈伤组织花青素的提取
118.选择有花青素积累的愈伤组织(用滤纸吸干愈伤组织表面水分)，平均称取1g愈伤组织于研钵中研碎，加50ml3％盐酸
‑
甲醇转移至25ml试管中，并于4℃水浴锅中提取20h，再置于n＝530nm处测定吸光值，每个处理重复3次。计算色素提取率，色素提取率5.6％。
119.提取率的计算公式：
120.注：上式中：a为色素在530nm波长处的吸光度；v为定容体积；n为比色时的稀释倍数；98.2为色素在530nm波长处的消光系数；m为愈伤组织质量。
121.实施例7
122.以实施例4的方法进行培养，为试验组1；
123.以实施例4的方法进行培养，但是直接以外植体进行培养，诱导愈伤组织，不诱导产生毛状根，为试验组2；
124.以实施例4的方法进行培养，但是直接以外植体进行培养，诱导愈伤组织，不诱导产生毛状根，且将魔芋培养基更换为ms培养基，为试验组3；
125.以实施例4的方法进行培养，将魔芋培养基更换为ms培养基，为试验组4；
126.统计每组中生物量的增长、花青素含量、愈伤组织发生时间，结果见表1；
127.表1
[0128][0129]
由表1可知，本发明利用天然物质魔芋粉制成天然培养基，降低外源物质的添加，降低了植物组织培养技术的成本，也为生产天然物质提供更安全放心的依据；利用组织培养技术生产天然色素，利用毛状根的特性外加愈伤增殖快的特性，使目的产物产量更高，并且不受外界环境的影响，更能满足市场的需求。
[0130]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0131]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。