一种冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段的序列鉴定方法与流程

1.本发明属于蛋白多肽鉴定技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段的序列鉴定方法。


背景技术：

2.冬虫夏草作为一种传统的名贵中药材在我国已有上千年的历史，主产于青藏高原及其横断山区，具有补肺益肾、止血化痰、止咳定喘之功效。由于天然冬虫夏草资源日益匮乏，且人工养殖冬虫夏草难以在市场中普及，寻找可培育的替代品显得尤为迫切。我国学者从上世纪70年代就致力于从冬虫夏草药材中分离出不同的菌种，并人工培育成菌丝体，以缓解冬虫夏草的资源紧缺问题。目前已经有相关的5种不同发酵虫草菌丝体制剂在销售和使用。
3.由于发酵虫草菌粉多为粉末，原有的发酵形态受到破坏，另外，冬虫夏草粉碎后，原来的外观形态也受到破坏，故冬虫夏草与各发酵虫草菌粉及制剂的质量控制多采用理化鉴别和某单一化学成分的含量测定方法，缺乏专属性的鉴别方法，由此导致市场上有大量掺伪掺假品存在，严重扰乱市场秩序。
4.各虫草类样品中真菌的菌种不同，其真菌蛋白的氨基酸序列必然不同，寻找差异性的蛋白片段(特征多肽)必定为鉴别冬虫夏草与各发酵虫草菌粉及制剂提供了新思路与新方法，从根本上解决了冬虫夏草与各发酵虫草菌粉及制剂的真菌蛋白鉴别难题，这也是当前蛋白组学的核心技术之一，即蛋白酶切
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液质联用识别技术。基于上述分析，提出一种冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段的序列鉴定方法。


技术实现要素：

5.本发明提供一种冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段的序列鉴定方法。
6.本发明包括以下步骤：
7.a对所述冬虫夏草及各发酵虫草制剂的样品进行了真菌蛋白提取和酶解，并对酶解肽段进行了lc
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ms
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ms分析；
8.b对冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段的质谱数据进行分析,将三维lc/ms数据进行降维处理，并以二维矩阵形式将结果列出。
9.c通过虫草类样品中的离子分布数据分析结果筛选出特征离子，即特征肽离子。
10.d根据各虫草类样品特征肽离子的二级质谱，在数据库中进行检索，以特征肽为母离子，进行二级扫描，进而鉴定特征肽序列。
11.进一步地，所述数据分析的方法包括根据各样品采集的一级和二级质谱数据，对质谱数据进行分析。
12.进一步地，所述质谱数据分析参数设定为：保留时间为60min，质谱范围为150～2000da，质谱允许偏差设定为0.05da，噪音消除水平为6.00，强度阈值设为100，质谱窗口设为0.05，保留时间窗口设为0.2。
13.进一步地，在步骤c中对所述虫草类样品进行主成分分析，后进一步进行因子分析，利用无监督统计学模型，结合正交偏最小二乘法进行二维数据分析,将冬虫夏草与各发酵虫草菌粉及制剂的样品数据进行分析，寻找各样品的特征离子，即特征肽离子。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明建立了冬虫夏草及各发酵虫草菌粉及制剂特征肽段的质谱数据信息库，为分析、鉴别冬虫夏草及各发酵虫草菌粉、制剂提供了技术支撑，不需要单体对照品为对照，只根据冬虫夏草及各发酵虫草类样品中特征肽段的一级、二级质谱信息即可进行定性分析。
16.附图表说明
17.表1为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉及制剂的特征肽段数据库；
18.图1为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉的蛋白多肽数据分布图；
19.图2为冬虫夏草与其他5种发酵虫草菌粉比较的散点图；
20.图3为冬虫夏草中选取的特征离子在所有样品中的强度分布；
21.图4为百令胶囊菌粉与冬虫夏草及其他4种发酵虫草菌粉比较的散点图；
22.图5为百令胶囊菌粉中选取的特征离子在所有样品中的强度分布；
23.图6为金水宝胶囊菌粉与冬虫夏草及其他4种发酵虫草菌粉比较的散点图；
24.图7为金水宝胶囊菌粉中选取的特征离子在所有样品中的强度分布；
25.图8为心肝宝胶囊菌粉与冬虫夏草及其他4种发酵虫草菌粉比较的散点图；
26.图9为心肝宝胶囊菌粉中选取的特征离子在所有样品中的强度分布
27.图10为宁心宝胶囊菌粉与冬虫夏草及其他4种发酵虫草菌粉比较的散点图；
28.图11为宁心宝胶囊菌粉中选取的特征离子在所有样品中的强度分布；
29.图12为至灵胶囊菌粉与冬虫夏草及其他4种发酵虫草菌粉比较的散点图；
30.图13为至灵胶囊菌粉中选取的特征离子在所有样品中的强度分布；
具体实施方式
31.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
32.在本实施例子中包括以下步骤：
33.根据各样品采集的一级和二级质谱数据，采用数学应用软件对质谱数据进行分析。分析参数设定为：保留时间为60min，质谱范围为150～2000da，质谱允许偏差设定为0.05da，噪音消除水平为6.00，强度阈值设为100，质谱窗口设为0.05，保留时间窗口设为0.2。
34.a对所述冬虫夏草及各发酵虫草菌粉及制剂进行了真菌蛋白提取和酶解，并对酶解肽段进行了lc
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ms
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ms分析；
35.本发明对6种虫草类样品进行了真菌蛋白提取和酶解，并对酶解肽段进行了lc
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ms
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ms分析并得到6种虫草类样品的总离子流色谱图，这些总离子流色谱图中所包含的多维信息不易识别，无法直观判断出各个样品中的差异性成分，需利用多元统计软件对6种虫草类的离子流色谱图做进一步分析。
36.b对冬虫夏草及各发酵虫草制剂特征肽段进行数据分析,将三维lc/ms数据进行降
维处理，并以二维矩阵形式将结果列出。
37.第一步是将三维lc/ms数据转换成二维矩阵，，并以二维矩阵形式将结果列出。
38.本实验共得到了34307个精确质量保留时间(emrt)数据对，对这些数据进行主成分分析，结果表明：各个虫草类样品分别落在不同的区域，说明各个虫草类样品存在特征成分，即差异性成分。
39.c通过各虫草类样品中的离子分布数据分析结果筛选出特征离子，即特征肽离子。为进一步鉴定冬虫夏草与各发酵虫草菌粉在多肽组成上的差异，利用无监督统计学模型，结合正交偏最小二乘法进行二维数据分析。将冬虫夏草与其他各发酵虫草菌粉的数据进行比较，得到数据分析结果散点图。在散点图中，每个点代表一个精确质量和保留时间的数据对(emrt)，一个数据点距离0点越远，该点对样品差异的贡献率越大，因此，在s型曲线两端的emrt数据对代表了来自每个样品组可信度最高的特征离子。图2中，接近s图左下角的emrt数据对为来自冬虫夏草样品可信度最强的特征标记物，选取任意其中的一个数据点，图3显示冬虫夏草中的该数据点(特征离子)在各虫草类样品中的离子分布图，可见，该特征离子在冬虫夏草中可被检出，而在其他各虫草菌粉样品中几乎未检出，这些特征的emrt数据对可以被选择性地捕获，并获得每组样品中的特征标记物列表，见表1。这些特征离子的质谱图中同位素峰与主峰的差值多数为0.5da，说明这些特征离子多数为双电荷离子。
40.本实验通过主成分分析，可以很好地将冬虫夏草及5种发酵虫草菌粉样品分别进行区分。pca图显示，各样品各自聚在一起，说明各样品中的多肽序列是不同的，且有特征。
41.进一步通过因子分析和主成分分析寻找到了各虫草样品的特征肽。从总离子流色谱图中，难以直观区分出各个虫草样品的来源，系因虫草真菌蛋白具有高度同源性，大多数肽段的序列相同，具有鉴别意义的特征性肽段的数量在真菌蛋白序列中占比较少。
42.百令胶囊(发酵冬虫夏草菌粉)、金水宝胶囊(发酵虫草菌粉)、心肝宝胶囊(人工虫草菌粉)、宁心宝胶囊(虫草头孢菌粉)及至灵胶囊(虫草被孢菌粉)特征肽的寻找均按“冬虫夏草特征肽的寻找”项下处理方法，分别得到5种发酵虫草菌粉的特征离子(即特征肽离子)。
43.根据各虫草类样品特征肽的二级质谱，进行uniprot数据库进检索，鉴定特征肽序列。各虫草类样品的特征肽段序列鉴定结果见表1，并经过了肽段合成与验证。
44.本发明通过对样品特征肽段的二级质谱数据分析，采用mascot数据软件检索，搜索uniprot相关数据库，鉴定了冬虫夏草与各发酵虫草菌粉的特征肽序列，其中冬虫夏草鉴定2个特征肽的序列，百令胶囊菌粉鉴定3个特征肽的序列，心肝宝胶囊菌粉鉴定2个特征肽序列，金水宝胶囊鉴别2个特征肽的序列，至灵胶囊菌粉鉴定1个特征肽的序列，宁心宝胶囊鉴定2个特征肽的序列，将鉴定的特征肽序列进行blast比对，验证特征肽的专属性，结果冬虫夏草、百令胶囊菌粉、心肝宝胶囊菌粉和宁心宝胶囊菌粉的特征肽匹配度较高。
45.特征肽段数据库的建立
46.本发明采用检测双电荷离子，并自动采集二级质谱的检测方式，从复杂的虫草真菌蛋白的酶解肽中得到各个虫草类样品的特征肽信息，是非常高效、专属的检测方法。通过测定样品，结合特征肽段数据库进行匹配，形成快速、经济的检测平台，可以有效地鉴定虫草类相关药材及制剂的种属来源，该方法同样适合于几种虫草类的混合样品检测，所建立的特征多肽数据库如表1所示。
47.表1为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉及制剂的特征肽段数据库
[0048][0049]
以冬虫夏草及各发酵虫草菌粉为研究对象，建立虫草类样品的特征肽段数据库信息，包括保留时间、分子离子峰、带电荷数和二级碎片离子等，满足国际上对于质谱定性鉴别离子识别点的要求。待测样品在相同的测定条件下，若样品中出现于正品虫草类药材相同的特征峰数量、各特征峰具有相同的保留时间和二级碎片离子，即可达到鉴别的目的。
[0050]
本次实验也对部分特征肽进行了合成与验证，结果表明这些特征肽离子的色谱保留时间、分子离子峰和二级碎片离子与样品中提取的相应离子的色谱保留时间、分子离子峰和二级碎片离子均较为一致，验证了特征肽的准确。
[0051]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。