一种检测仙台病毒抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用的制作方法

1.本发明属于免疫荧光层析试纸检测领域，具体涉及一种检测仙台病毒抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用。


背景技术：

2.仙台病毒(sendai virus，sev)属于副粘病毒科副粘病毒属(paramyxoviridae)，是一个具有细胞融合活性的包膜病毒，可引起啮齿类动物呼吸道疾病，通常表现为被毛粗乱、弓背、呼吸困难、发育不良、消瘦等症状。在实验鼠群中多呈隐性感染，鼠群一旦感染常会改变体内细胞免疫反应，干扰试验结果，而且难以从鼠群中清除，影响幼鼠发育成长和降低成年母鼠的繁殖率。1952年，首先在日本分离到了仙台病毒，继而世界各地都有报道。本病一年四季均可发生，但以冬春季多发，加强日常监测，建立无仙台病毒的鼠群，是提高啮齿类实验动物质量的重要措施之一。
3.仙台病毒是实验用大鼠和小鼠严格控制的病毒性疾病，严重影响实验动物的质量，因此清洁级以上实验大小鼠中必须严格控制。对小鼠、大鼠仙台病毒的诊断最传统、最经典的方法是病毒分离。该方法比较耗时、繁琐。目前在病毒性病原体的检测中多采取血清学方法，仙台病毒具有凝集动物红细胞的特点，使血凝抑制试验(hi)检测仙台病毒抗体得到了发展，此试验简便易操作，但要选择敏感性的红细胞，要严格控制试剂，以减少试验不稳定性和阅读结果主观性强的问题。补体固定试验(cf)需要注意过夜温育，血清需要做系列稀释，结果判定主观性强且补体的滴度直接影响检测的准确性。在我国的实验动物国家标准中也推荐了如免疫荧光法和酶联免疫吸附试验等血清学方法，针对抗体的酶联免疫吸附法(elisa)方法发展很快，elisa检测仙台病毒抗体，敏感性高，特异性好，但耗时比较久，只适用于实验室检测。免疫荧光法有较好的敏感性，但需要荧光显微镜，不适宜基层单位的检测之需。
4.仙台病毒传染性强，又容易扩散，是最难控制的病毒之一。因此，建立高灵敏、特异性好、快速、简便且成本低廉的新型检测方法是感染性疾病诊断的当务之急。
5.免疫层析试验作为poct的一种主要方法，其产品已经从第一代胶体金定性免疫层析检测、第二代胶体金半定量色板卡比色或仪器阅读，向着第三代全定量、自动化、信息化、智能化方向发展。该技术独特的立体反应模式，具有酶联免疫吸附法、化学发光法、气相
‑
液相色谱法、毛细管电泳等方法所不具备的优点，快速、简便、灵敏、直观、价格低廉，可进行现场检测，在检测技术中处于重要地位，是对传统和大型仪器检测方法的有力补充。传统示踪物为胶体金。胶体金也称金溶胶，是由金盐还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金具有胶体性质、呈色性及光吸收性。胶体金免疫层析技术已经在临床诊疗中广泛应用，在许多方面具有明显优势，但是在实际应用中也暴露出一些不足。胶体金试纸条/卡结果判定容易受环境、标本加样量多少，观察时间等因素影响；一些病原体检测存在交叉反应；检测中可出现假阳性和假阴性反应，存在前带现象，其敏感性和特异性不如elisa和化学发光法；多数产品不能定量或定量不准确，检测范围有待进一步拓宽。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的在于，针对现有试纸条检测范围小、灵敏度低等问题，提供一种灵敏度更高，检测范围更大的免疫荧光层析试纸条。
7.本发明的第二个目的在于提供上述试纸条在检测仙台病毒抗体中的应用。
8.本发明的第三个目的在于提供一种检测仙台病毒抗体的试剂盒。
9.本发明的第四个目的在于提供一种检测仙台病毒抗体的方法。
10.本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一个方面，提供一种免疫荧光层析试纸条，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的仙台病毒抗原，所述纤维素膜上设有一条包被葡萄球菌蛋白a的检测t线，以及一条包被羊抗小鼠igg的质控c线。
12.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述荧光微球标记的仙台病毒抗原的浓度为0.5～1.5mg/ml，所述结合垫上荧光微球标记的仙台病毒抗原的喷涂量为0.1～0.5μl/cm。
13.优选地，根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述荧光微球标记的仙台病毒抗原的浓度为1mg/ml，所述结合垫上荧光微球标记的仙台病毒抗原的喷涂量为0.3μl/cm。
14.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白a的浓度为0.2～1.5mg/ml，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白a的划线量为0.5～1.2μl/cm。
15.优选地，根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白a的浓度为1mg/ml，所述纤维素膜上葡萄球菌蛋白a的划线量为1μl/cm。
16.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述羊抗小鼠igg的浓度为0.5～2mg/ml，所述羊抗小鼠igg的喷涂量为0.01～0.05μl/cm。
17.优选地，根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述羊抗小鼠igg的浓度为1mg/ml，所述羊抗小鼠igg的喷涂量为0.05μl/cm。
18.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述荧光微球为羧基荧光微球。
19.进一步地，根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述微球直径为100nm～400nm，微球激发波长365
±
10nm，发射波长610
±
10nm。
20.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述底板为pvc底板。
21.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述纤维素膜为硝酸纤维素膜。
22.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述检测线和质控线之间的距离为1～4mm。
23.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述样品垫含有1％bsa、0.9％nacl、2％peg4000、1％triton x
‑
100和0.3
‰
proclin300的0.2m硼砂
‑
硼酸缓冲液，ph为9.0。
24.根据本发明第一个方面所述的试纸条，所述吸水垫为普通吸水纸。
25.本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的试纸条在检测仙台病毒抗体中的应用。
26.本发明的第三个方面，提供一种检测仙台病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一个方面所述的试纸条。
27.本发明的第四个方面，提供一种检测仙台病毒抗体的方法，具体为在本发明第一
个方面所述的试纸条样品垫上滴加样品，反应后检测荧光信号。
28.本发明的有益效果是：
29.本发明基于以荧光微球作为示踪剂建立一种检测小鼠仙台病毒抗体免疫荧光层析试纸条。与传统快速检测技术性能比较，具有很好的敏感性、特异性和稳定性，减少样本中干扰物质的影响，检测结果准确可靠，检测范围更宽，操作简单，快速，成本低廉，易于推广。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条进行定量检测血清中仙台病毒抗体的标准曲线。
31.图2为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条的特异性检测结果。
32.图3为本发明实施例1中的免疫荧光层析试纸条的灵敏度检测结果。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。
34.实施例1一种检测仙台病毒抗体的免疫荧光层析试纸条的制备
35.材料：硝酸纤维素膜，玻璃纤维膜，吸水纸，pvc底板，划膜喷金仪，切条仪均购自于上海捷宁生物科技有限公司；葡萄球菌蛋白a(spa)，羊抗鼠igg均购自于索莱宝科技有限公司；羧基荧光微球，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)均购自于赛默飞世尔科技有限公司等。小鼠仙台病毒elisa试剂盒购自美国ebi
‑
xpress biotech international公司。
36.其中仙台病毒抗原的制备方法为：选择9～11日龄的鸡胚，向尿囊液中注入0.1～0.3ml的仙台病毒悬液，用融化的石蜡封孔，直立孵化。在接种后24～48h收获尿囊液。将尿囊液以40000rpm离心2h，收集沉淀，最后用pbs洗脱沉淀，即获得仙台病毒抗原。
37.免疫荧光层析试纸条的制备：
38.s1：取20μl荧光微球加入500μl 0.05mol/l的硼酸缓冲液(ph＝9.0)旋涡振荡混匀后，加入50μl edc溶液(1mg/ml)和50μl nhs(1mg/ml)作为活化剂混匀后，振荡活化30min，12000rpm离心30min，弃上清；加入800μl 0.05mol/l硼酸缓冲液(ph9.0)复溶沉淀后，再加入10μg仙台病毒抗原，室温下振荡偶联2h，12000rpm离心30min，弃上清；加入400μl微球保护液复溶沉淀后，加入50μl 10％bsa溶液振荡封闭1h，置于4℃保存备用。
39.s2：将荧光微球标记的仙台病毒抗原按0.3μl/cm的喷涂量喷涂于结合垫上，37℃干燥3h。1mg/ml葡萄球菌蛋白a和1mg/ml羊抗小鼠igg分别包被与nc膜上作为t线和c线，37℃干燥3h，将样品垫、微球结合垫、nc膜、吸水垫按顺序粘贴于pvc底板上，切裁至4mm试纸条待检。
40.其中样品垫含有1％bsa、0.9％nacl、1％peg4000、0.5％triton x
‑
100、和0.3
‰
proclin300的0.2m硼砂
‑
硼酸缓冲液，ph为9.0；微球保护液为0.01m pbs，2％蔗糖，0.5％
bsa，0.3
‰
proclin。
41.实施例2检测结果
42.实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条检测原理：采用样品稀释液将血清稀释10倍后，取100μl样品加样，10min后进行检测，记录荧光定量分析仪上的t值、c值。
43.1.线性范围
44.通过荧光值和浓度曲线关系可以计算出被检测样本的浓度，本实验血清作为真实建标基质建立标准曲线，以lg(t/c)为纵坐标，以自定义的标准品浓度(tu/ml
‑
1)的对数为横坐标，血清样本在选定的线性范围10～640tu/ml的标准曲线为y＝
‑
0.2522x2 1.6697x
‑
2.3755，线性关系r2为0.9993，如图1。结果显示，实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条的检测范围为0～640tu/ml。
45.2.特异性
46.使用实施例1中的荧光免疫层析试纸条对小鼠呼肠孤病毒iii型(reo
‑
3)、小鼠肝炎病毒(mhv
‑
a59)、小鼠脑脊髓炎病毒(tmev)、小鼠细小病毒(mvm)、小鼠肺炎病毒(pvm)、鼠痘病毒(ect)、多瘤病毒(poly)、小鼠诺如病毒(mnv)、小鼠肺支原体(mpul)及小鼠仙台病毒(仙台病毒)的阳性血清进行特异性检测，同时设小鼠阴性血清作为阴性对照，具体结果显示见表1和图2，其中图2从左到右依次为鼠痘病毒(ect)、小鼠脑脊髓炎病毒(tmev)、多瘤病毒(poly)、小鼠诺如病毒(mnv)、小鼠肺支原体(mpul)、小鼠呼肠孤病毒iii型(reo
‑
3)、小鼠肺炎病毒(pvm)、小鼠细小病毒(mvm)、小鼠肝炎病毒(mhv
‑
a59)、小鼠仙台病毒(仙台病毒)及阴性对照。
47.表1仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条特异性检测结果
48.病原荧光值(tu/ml)结果判断reo
‑
3＜10阴性mhv
‑
a59＜10阴性tmev＜10阴性mvm＜10阴性pvm＜10阴性ect＜10阴性poly＜10阴性mnv＜10阴性mpul＜10阴性sev106.23阳性阴性对照＜10阴性
49.从结果可以看出，reo
‑
3，mhv
‑
a59，tmev，mvm，pvm，ect，poly，mnv，mpul阳性血清检测均为阴性，只要仙台病毒阳性血清检测为阳性，表明实施例1中的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条特异性良好并与其他小鼠阳性血清没有交叉反应。
50.3.灵敏度检测
51.将仙台病毒高免阳性血清稀释6个梯度(1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:20000，1:25600)，使用实施例1中的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条进行灵敏度检测。结果见图3和表2。
52.表2仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条灵敏度检测结果
[0053][0054][0055]
从结果可以看出，实施例1中的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条对仙台病毒高免血清的最低检出量为1:20000，具有很高的灵敏度。
[0056]
4.重复性实验
[0057]
选取稀释度为1:3200，1:6400，1:20000的血清作为质控品，分别对同批次的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测，计算批内变异系数。对3个不同批次的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测，计算批间变异系数。结果如表3所示。
[0058]
表3仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条重复性检测结果
[0059][0060]
从表3可以看出，批内变异系数分别为2.35％，3.74％，5.27％；批间变异系数分别为4.32％，5.53％，7.25％，批内批间的变异系数都在10％以下，证明实施例1中制备得到的试纸条重复性好。
[0061]
5.临床样品检测
[0062]
将采集的不同感染时间段小鼠血清10份和临床小鼠血清样本50份，分别用小仙台病毒elisa试剂盒和实施例1中的仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条进行检测对10份人工感染仙台病毒不同时间段小鼠血清(编号为ai
‑
1～ai
‑
10)和50份临床小鼠血清样本(标号为1～50)进行检测，检出10份仙台病毒阳性样本，50份仙台病毒阴性样本，结果见表4。
[0063]
表4仙台病毒抗体免疫荧光层析检测试纸条与elisa试剂盒检测临床样品结果
[0064]
[0065][0066]
注：荧光值＞10tu/ml为阳性，荧光值＜10tu/ml为阴性；od值＞0.3为阳性，od值＜0.3为阴性。
[0067]
从表4可以看出，实施例1中所制备的试纸条与elisa检测结果对比，检测结果完全一致，阳性符合率为100％，阴性符合率100％，总符合率100％，说明实施例1中的试纸条具有很好的准确率。
[0068]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。