制备细胞基片的方法、制备试剂盒的方法及联检方法与流程

技术特征：
1.一种制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，所述方法包括以下步骤：步骤s1将多种病原体分别进行细胞传代培养；步骤s2将多种病原体中的至少两种传代细胞分别制成细胞悬液；步骤s3将制成的细胞悬液分别施加于同一载玻片上的不同载玻孔中，待所述不同载玻片孔中的细胞悬液中的细胞均吸附后，在相同的条件下固定所述不同载玻片孔中的细胞；所述多种病原体包括从呼吸系统感染病原体、消化系统感染病原体和生殖系统感染病原体中选择的任意一种病原体中的至少两种病原微生物，在步骤s3中，所述相同的条件为在相同的温度条件下使用无水乙醇固定相同的时间，之后在湿度小于50％的同一湿度环境下干燥相同的时间形成所述细胞基片。2.根据权利要求1所述的制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，其特征在于，所述相同的温度条件为环境温度选自范围23℃～27℃之间的同一温度，所述固定相同的时间是固定时间选自范围30min～3h之间的同一时间，所述干燥相同的时间是干燥时间选自范围30min～3h之间的同一时间。3.根据权利要求2所述的制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，其特征在于，所述相同的温度条件是25℃，所述固定相同的时间是1h，所述干燥相同的时间是2h，所述无水乙醇为
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20℃无水乙醇，所述湿度小于50％的同一湿度是选自范围10％～20％之间的同一湿度，在步骤s2中，细胞悬液的制备包括细菌悬液的制备和感染非细菌的细胞悬液的制备。4.根据权利要求3所述的制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，其特征在于，所述细菌悬液的制备包括以下步骤：将传代培养的细菌细胞放入无菌生理盐水中制成细菌悬液；感染非细菌的细胞悬液的制备包括以下步骤：步骤s21将多种病原体中的至少两种传代细胞分别用浓度范围在0.1％～0.5％之间的胰酶消化分离，待所述至少两种传代细胞脱离培养器皿的底时停止消化分离并吸出所述胰酶；步骤s22将消化分离后的至少两种传代细胞分别置于湿度≥90％且温度37℃、co2浓度为5％的co2培养箱中吸附1h～3h；步骤s23将吸附后的至少两种传代细胞的补充浓度范围在5％～20％的胎牛血清培养基，之后继续在湿度≥90％且温度37℃、co2浓度为5％的co2培养箱中感染细胞24h～96h，直至至少两种传代细胞中所有的病原体细胞均发生病变；步骤s24将发生病变的至少两种传代细胞分别用浓度范围在0.1％～0.5％之间的胰酶消化分离，待所述至少两种感染的病原体细胞脱离培养器皿的底部时加入浓度范围在1％～5％之间的胎牛血清培养基停止消化，形成细胞悬液。5.根据权利要求3所述的制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，其特征在于，所述感染非细菌的细胞悬液的制备包括以下步骤：将所述多种病原体的细胞分别加入多种病原体中对应的病原体传代细胞中感染预定时间；将多种病原体中的至少两种转染的病原体细胞分别进行细胞消化分离以确保细胞活力，将消化分离后的至少两种转染的病原体细胞继续培养至细胞发生病变，之后将发生病
变的至少两种转染的病原体细胞制成细胞悬液；其中，多种病原体的原代细胞不包括细菌细胞，原代细胞与传代细胞的数量比例范围在1:2～1:1之间，感染预定时间的范围为24h～72h。6.根据权利要求1所述的制备用于多病原体联检的细胞基片的方法，其特征在于，在步骤s1中，细胞传代培养包括细菌细胞的传代培养和非细菌细胞的传代培养，所述细菌细胞的传代培养包括以下步骤：将高压灭菌后的培养基待凝固后接种细菌菌种，之后置于湿度小于50％且温度为37℃培养箱中培养24h～48h长成菌膜形成细菌传代细胞；所述非细菌细胞的传代培养包括以下步骤：步骤s11将多种病原体的原代细胞分别放入不同的培养器皿中，之后分别加入浓度范围在5％～20％之间的胎牛血清培养基，再置于湿度小于50％且温度为37℃的浓度为5％的co2培养箱中培养第一预定时间进行复苏；步骤s12将复苏的多种病原体用浓度范围在0.1％～0.5％之间的胰酶消化分离，待多种病原体的细胞脱离培养器皿的底时停止消化并吸出所述胰酶，之后置于湿度≥90％且温度为37℃的浓度为5％的co2培养箱中培养第二预定时间，所述第一预定时间小于第二预定时间。7.一种制备用于多病原体联检的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：提供细胞基片，所述细胞基片为根据权利要求1
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6中任一项所述的方法所制备的细胞基片；提供用于标记的荧光素结合物；提供用于预处理样本的吸附剂；提供用于预处理样本的样本稀释液；提供用于清洗载有样本的细胞基片的浓缩洗涤液。8.一种多病原体的联检方法，所述联检方法包括以下步骤：步骤s100提供试剂盒，所述试剂盒为根据权利要求7所述的方法所制备的试剂盒；步骤s200配置所述试剂盒中的浓缩洗涤液并预处理样本；步骤s300将预处理后的样本分别加入至细胞基片上的不同载玻片孔中，之后放入湿盒并在温度范围在4℃～37℃之间的环境中温育20min～12h；步骤s400使用配置后的浓缩洗涤液清洗温育后的细胞基片，之后在清洗后的细胞基片的不同载玻片孔中加入所述试剂盒中的荧光素结合物进行标记，将标记后的细胞基片放入湿盒并在温度范围在4℃～37℃之间的环境中温育20min～12h，获得能够判读结果的细胞基片，所述能够判读结果的细胞基片中阳性结果为第一颜色，阴性结果为第二颜色，所述第一颜色与第二颜色为不同的两种颜色，在步骤s300中的细胞基片为根据权利要求1
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6中任一项所述的方法所制备的细胞基片或根据权利要求7中所述的方法所制备的试剂盒中的细胞基片。9.根据权利要求8所述的多病原体的联检方法，其特征在于，在步骤s200中，所述预处理样本包括以下步骤：
步骤s201将样本与所述样本等体积的所述试剂盒中的吸附剂混匀，之后在预定的转速下离心预定时间；步骤s202将吸附后的样本按照预定比例加入至所述试剂盒中的样本稀释液中混匀。10.根据权利要求8所述的多病原体的联检方法，其特征在于，在步骤s201中，预定转速为10000rpm，离心预定时间为5～15min，在步骤s202中，预定比例为吸附后的样本与样本稀释液的体积比范围为1:5～1:3之间，在步骤s200中，配置所述试剂盒中的浓缩洗涤液为将所述试剂盒中的浓缩洗涤液稀释30～50倍。

技术总结
本发明公开了一种制备用于多病原体联检的细胞基片的方法、制备用于多病原体联检的试剂盒的方法及多病原体的联检方法，属于免疫检测领域。制备用于多病原体联检的细胞基片的方法包括以下步骤：将多种病原体分别进行细胞传代培养；将至少两种传代细胞分别制成细胞悬液；将细胞悬液分别施加于同一载玻片上不同载玻片孔中，待细胞吸附后在相同条件下固定不同载玻片孔中的细胞；多种病原体包括从呼吸系统感染病原体、血液系统感染病原体、消化系统感染病原体和生殖系统感染病原体中选择任意一种病原体中至少两种病原微生物，相同的条件为在相同温度条件下使用无水乙醇固定相同时间，之后在湿度小于50％的同一湿度环境下干燥相同时间形成细胞基片。同时间形成细胞基片。同时间形成细胞基片。


技术研发人员：张秀杰 吴吟妮 张晓刚 刘洋 刘雪敏
受保护的技术使用者：北京英诺特生物技术股份有限公司
技术研发日：2021.08.20
技术公布日：2021/12/16