一种亮腹釉小蜂成虫质量检测与评价的方法与流程

1.本发明属于农业害虫生物防治领域，具体涉及一种亮腹釉小蜂成虫质量检测与评价的方法。


背景技术：

2.亮腹釉小蜂(tamarixia radiata)是柑橘木虱(diaphorina citri kuwayama)的优势寄生蜂，寄生4～5龄的柑橘木虱若虫。一头亮腹釉小蜂通过取食和寄生的方式可杀灭柑橘木虱若虫多达500头。1998年美国佛罗里达州引进亮腹釉小蜂进行释放，到2006年，该蜂已遍及佛罗里达的所有橘园，除此之外，亮腹釉小蜂已在美国加利福尼亚州、哥伦比亚瓜达卢普、法国留尼汪、中国台湾、菲律宾及非洲毛里求斯等地区成功引入；在巴西、阿根廷、委内瑞拉、墨西哥等地区均有分布。目前，亮腹釉小蜂已在巴西、墨西哥、美国加利福尼亚州、美国得克萨斯州和佛罗里达州工厂化生产，在中国，广东省科学院动物研究所于2020年实现规模化生产。
3.然而，不同地区生产的亮腹釉小蜂，其寄生率有明显差异。在美国佛罗里达州，亮腹釉小蜂在春夏季寄生率相对较低，秋季最高，平均寄生率达60％以上；在得克萨斯州，大量释放亮腹釉小蜂可使柑橘木虱种群数量降低91.2％；在巴西，寄生率为43.3％～88.8％；在墨西哥西部，平均寄生率达60.58％。这可能受释放地温度、湿度等环境因素影响，也与亮腹釉小蜂的质量相关。尤其是同一释放地区寄生率的大幅度波动，极可能与寄生蜂质量有直接关系。因此，对亮腹釉小蜂成虫进行质量检测和建立亮腹釉小蜂质量评价标准，对其生产和应用有重要意义。


技术实现要素：

4.为了提高亮腹釉小蜂成虫商品质量，加强产品质量管理，保障农产品质量安全及生态环境安全，参照其他寄生蜂质量评价体系，本发明提供一种亮腹釉小蜂成虫质量检测与评价的方法，该方法可用于鉴定亮腹釉小蜂产品并检测其品质。
5.本发明的目的是提供一种亮腹釉小蜂成虫质量检测与评价的方法，是先对物种形态特征、物种分子特征、外观、产品数量、雌蜂率、寄生率及不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率共7个质量指标进行检测，再根据质量标准进行评价，所述的质量标准为：
[0006][0007]
在一优选例中，对所述的物种形态特征进行质量检测是对亮腹釉小蜂雄蜂和和雌蜂进行鉴定，鉴定内容包括体长、体色、触角、柄节、棒节、腹部。
[0008]
在另一优选例中，对所述的物种分子特征进行质量检测是利用细胞色素氧化酶i(cytochrome oxidase subunit i，coi)的保守区域和内转录间隔区1、2(internal transcribed spacer，its
‑
1、its
‑
2)进行物种分子鉴定。
[0009]
在另一优选例中，对所述的外观进行质量检测是记录体色暗淡、残肢残翅的雌蜂亮腹釉小蜂的数量，并统计占总检测数量的比率。
[0010]
在另一优选例中，对所述的产品数量进行质量检测是通过手动计数的方式，记录每瓶中亮腹釉小蜂的实际数量占包装瓶标识数量(200头/瓶)的比率。
[0011]
在另一优选例中，对所述的雌蜂率进行质量检测是通过手动计数的方式，记录每瓶中雌性亮腹釉小蜂占每瓶中总数量的比率。
[0012]
在另一优选例中，对所述的寄生率进行质量检测是采用15cm
×
15cm的60目防虫袋，在其中转入4龄末柑橘木虱若虫与亮腹釉小蜂雌蜂(头数比10∶1)，24h后移除亮腹釉小蜂；7～9d后检查统计被寄生的柑橘木虱数量，统计寄生率。
[0013]
在另一优选例中，对所述的不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率进行质量检测是在15℃、25℃及30℃下，利用人工气候箱进行贮存10h，记录亮腹釉小蜂的死亡数量，统计死亡率。
[0014]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的检测与评价方法能够提高亮腹釉小蜂成虫商品质量和加强产品质量管理，保障农产品质量安全及生态环境安全；利用本发明检测方法筛选质量合格的亮腹釉小蜂释放到田间可有效控制柑橘木虱的种群数
量，以促进亮腹釉小蜂天敌产品的商业化。
附图说明
[0015]
图1为亮腹釉小蜂雌蜂的形态特征。
[0016]
图2为亮腹釉小蜂雄蜂的形态特征。
具体实施方式
[0017]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018]
以下实施例所使用的亮腹釉小蜂均为广东省科学院动物研究所规模化生产的产品。
[0019]
实施例1物种形态特征鉴定
[0020]
对亮腹釉小蜂产品质量进行评价首先应进行形态鉴定，保证物种形态特征与检测结果相吻合。本文随机选择5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中10头(5头雌、5头雄)进行物种形态鉴定。鉴定结果如下：
[0021]
(1)雌蜂(图1)：
[0022]
体长0.92～1.04mm，大部分黑褐色，复眼和单眼红褐色，头宽于长，上颚2齿及1截齿，下颚须和下唇须各1节。触角8节(触角式1，1，3，3)，具1小环状节；柄节长为宽的3.7倍；梗节等长或稍长于第1索节；第1～3索节长比分别为11:10:9，分别具4～7个刺状感觉器；棒节3节，末端具针状突出，各棒节分别具7～11个刺状感觉器。触角基节暗褐色，柄节浅色，背缘暗色，其余各节暗黄色。
[0023]
中胸盾中叶近侧缘具2对毛，小盾片亚中线外缘具2对毛，盘状感觉器靠近前1对毛；并胸腹节褶不完整，具不规则的网状纹。翅透明，前翅长为宽的2.3倍；亚缘脉端部呈折断痕，亚缘脉具1根刚毛，端部下方具2～3根毛；前缘室基部具1～2根细毛，端部具3～4根细毛；缘脉具7～9根刚毛。足跗节4
‑4‑
4，足浅黄色，基节和跗节末端暗褐色。
[0024]
腹部腹板黄色，第1～4节背板或第1～5节背中央大部分黄色，呈大黄色斑。第3产卵瓣暗褐色，产卵器从腹部第2腹节伸出，稍突出腹末端，产卵器为中足胫节长的1.6倍，第3产卵瓣为产卵器长0.2倍。
[0025]
(2)雄蜂(图2)：
[0026]
体色与形态相似于雌虫，体长0.84～1.05mm。触角9节(触角式1，1，4，3)；柄节基向近2/5～1/2处具1小长圆形感觉区；索节4节，各节分别具1排6～7根长刚毛；第1棒节1排刚毛稍短，棒节末端具针状突出。腹部第1～2节背板中央大部分暗黄色，边缘黑褐色，呈小暗黄色斑；腹部第1～3腹板大部分暗黄色，其余腹板黑褐色。雄性外生殖器长，从腹部第4腹节基部伸出，指状突端部暗褐色。
[0027]
实施例2物种分子特征鉴定
[0028]
利用细胞色素氧化酶i(cytochrome oxidase subunit i，coi)的保守区域和内转录间隔区1、2(internal transcribed spacer，its
‑
1、its
‑
2)进行物种分子鉴定。
[0029]
随机抽样选择5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中1头进行总dna的提取，试剂盒选用天根生物血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，实验步骤严格遵循试剂盒说明。上下游引物见表1。
[0030]
表1
[0031][0032]
pcr反应使用50μl体系，dna模板2μl，引物(表1)各0.5μm，25μlmix(2x santaq pcr mix预混液，含蓝染料，生工生物b532061)，用无菌水补足。反应条件：预变性94℃(5min)
→
变性94℃(30s)
→
退火50
‑
60℃(30s)
→
延伸72℃(30～60s)
→
延伸72℃(10min)
→
保存4℃(∞)，其中第2步的变性至第4步的延伸重复35个循环。
[0033]
亮腹釉小蜂分子鉴定结果显示，目的基因coi、its
‑
1和its
‑
2在ncbi(national center for biotechnology information search database)数据库中比对的种内相似度均较高(表2)，coi的种内相似度为98.5％～100.0％，而种间相似度，t.radiata与t.dryi最高为94.0％；its
‑
1种内相似度最低为97.9％，而与属内的t.drukyulensis相似度仅为82.0％；its
‑
2种内相似度为99.0％～100.0％，而与t.drukyulensis相似度小于82.7％。因此本标准规定，coi、its
‑
1和its
‑
2相似度高于97％，则认为该种为亮腹釉小蜂。
[0034]
表2
[0035]
目的基因genbank序列号片段长度ncbi比对相似度coimz558501655bp98.5％～100.0％its
‑
1mz560764504bp97.9％～100.0％its
‑
2mz561418502bp99.0％～100.0％
[0036]
实施例3雌蜂体色及残疾检测
[0037]
利用体视显微镜观察雌性亮腹釉小蜂是否体色暗淡，是否残翅残肢。随机选择10瓶亮腹釉小蜂，每两瓶为1个样本，每个样本取200头雌性亮腹釉小蜂测试，分别记录体色暗淡、出现残翅残肢的雌蜂数量，并分别统计体色暗淡和残肢残翅个体数量占总数的比率(体色暗淡率和残肢残翅率)，共检测5次，检测结果如表3所示。
[0038]
表3
[0039]
检测项目(％)12345平均体色暗淡率1.01.50.51.01.51.1
±
0.2残肢残翅率0.20.40.40.40.40.36
±
0.4
[0040]
从表3可知，在5次亮腹釉小蜂雌蜂外观检测中，亮腹釉小蜂体色暗淡率最高为1.5％，亮腹釉小蜂残肢残翅率的比率最高为0.4％。结合生产实际，规定亮腹釉小蜂产品中的雌性亮腹釉小蜂体色暗淡率不高于2.0％、残肢残翅率不高于1.0％。
[0041]
实施例4数量检测
[0042]
随机选择5瓶亮腹釉小蜂进行手动计数，记录每瓶中亮腹釉小蜂的实际数量，计算
每瓶亮腹釉小蜂数量占包装瓶标识数量(200头/瓶)的比率，每瓶为一个样本，共检测5个样本，检测结果如表4所示。
[0043]
表4
[0044]
检测项目12345平均数量占标识的比率(％)106.099.0100.0102.5105.0102.5
±
1.4
[0045]
随机抽取5瓶亮腹釉小蜂产品，其数量占标识的比率最低为99.0％(表4)。根据检测结果结合生产实际，本文规定产品包装中亮腹釉小蜂的数量比率不低于标识数量的95.0％。
[0046]
实施例5雌蜂率检测
[0047]
随机选择5瓶亮腹釉小蜂，记录其雌蜂数量，统计雌蜂率，共检测5次，检测结果如表5所示。
[0048]
表5
[0049]
检测项目12345平均雌蜂率(％)71.078.083.075.071.075.6
±
2.3
[0050]
在5次检测中，雌蜂率最低为71.0％(表5)。规定产品质量标准中的雌蜂率不低于70.0％。
[0051]
实施例6不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率检测
[0052]
随机选择15瓶亮腹釉小蜂并分成3组，每瓶取100头；将各组亮腹釉小蜂分别置于15℃(低温)、25℃(常温)及30℃(高温)的人工气候箱中处理10h，记录亮腹釉小蜂的死亡数量，统计死亡率，检测结果如表6所示。
[0053]
表6
[0054]
贮存10h死亡率(％)12345平均15℃3.01.03.03.02.02.4
±
0.425℃0.01.01.02.02.01.2
±
0.430℃2.02.04.02.03.02.6
±
0.4
[0055]
从表6可知，15℃低温贮存死亡率最高为3.0％，25℃常温贮存死亡率最高为2.0％，30℃高温贮存死亡率最高为4.0％。根据检测结果，规定产品质量标准中不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率均不得高于5.0％。
[0056]
实施例7寄生率检测
[0057]
准备带有嫩稍的年橘，选取合适位置套15cm
×
15cm的60目防虫袋，在其中转入100头4龄末柑橘木虱若虫。从1瓶亮腹釉小蜂产品中随机选取10头雌虫转入上述防虫袋中，24h后移除亮腹釉小蜂。7～9d后检查统计被寄生的柑橘木虱数量，统计寄生率。以上实验在26℃，相对湿度为60％，光周期l:d为14:10的条件下进行，重复5次，检测结果如表7所示。
[0058]
表7
[0059]
检测项目12345平均寄生率(％)92.093.098.0100.095.095.6
±
1.5
[0060]
随机抽取的亮腹釉小蜂寄生率最低为92.0％，最高可达到100.0％(表7)。因此，本质量标准规定，亮腹釉小蜂产品在实验室条件下寄生率不低于90％。检测结果用于质量评
价指标，不能用于田间标准评价。
[0061]
实施例8建立亮腹釉小蜂产品质量标准
[0062]
根据检测结果确定了亮腹釉小蜂成虫质量的检测项目和检测指标，检测项目包括检测物种形态及分子特征、外观(体色暗淡率、残肢残翅率)、产品数量、雌蜂率、寄生率及不同温度下(15℃、25℃及30℃)亮腹釉小蜂贮存死亡率共7个质量指标。通过检测广东省科学院动物研究所生产的亮腹釉小蜂各项指标，首次确立了指标参数，制定了亮腹釉小蜂成虫的质量标准，见表8。
[0063]
表8
[0064]