一种具有抑菌作用的植物提取物及其应用的制作方法

1.本技术属于天然植物提取物技术领域，具体涉及一种具有抑菌作用的植物提取物及其应用。


背景技术：

2.植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种。植物中具有杀菌和抗菌活性的化学物质有萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酸类、酚类、独特的氨基酸和多糖等多种成分。由于植物此生代谢物质或植物提取物具有天然环保、易降解、生物利用率高等优势，在生物医药、农业、环境等领域广泛应用。
3.凤尾草为凤尾蕨科凤尾蕨属蕨类植物，具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，对痢疾、肠炎、黄疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病症有治疗作用。牛尾蒿,菊科，多年生草本，具有清热，凉血，解毒，杀虫的功效，可用于治疗消炎化脓性疾病，而牛尾蒿挥发油中的含氧化合物祛痰平喘作用显著。
4.传统工艺中对凤尾草、牛尾蒿等天然植物原材料的利用，以整株或部分植株整体入药为主，对其中的有效成分并不进行区分，因而有效成分利用率低，在一定程度上限制了天然植物原材料的应用。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本技术的目的是提出一种具有抑菌作用的植物提取物及其应用，通过萃取将凤尾草、牛尾蒿、商陆、葎草、鬼针草等植物中的有效成分进行提取纯化，从而得到具有高效抑菌作用的植物提取组合物。
6.为了实现上述技术目的，本技术采用以下技术方案：
7.一种具有抑菌作用的植物提取物，所述植物提取物由以下方法制得：
8.1)取适量植物原料，用乙醇浸泡、过滤得植物原料的乙醇浸提液，植物原料与乙醇的质量体积比为1
‑
5:0.2
‑
1；所述植物原料为凤尾草、牛尾蒿、鬼针草、商陆、葎草任一种；
9.2)在步骤1)所得乙醇浸提液中添加有机溶剂进行萃取，乙醇浸提液与有机溶剂的用量比为1:5～15；所述有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、丙酮和石油醚中任一种；蒸发浓缩至粘稠状；
10.3)在步骤2)所得浓缩液中添加乙酸乙酯、正丁醇或丙酮中任一种，分离溶剂，即得上述植物原料的有机提取物。
11.优选的，所述步骤1)所述植物原料为凤尾草、牛尾蒿或商陆；步骤2)所述有机溶剂为丙酮。
12.优选的，所述步骤1)所述植物原料为凤尾草或牛尾蒿；步骤2)所述有机溶剂为正丁醇。
13.基于一个总的发明构思，本发明还包括上述植物提取物在制备防治果蔬致病菌危害的抑菌剂中的应用。
14.优选的，所述植物提取物的添加量为0.25～1g/l。
15.基于一个总的发明构思，本发明包括一种由所述植物提取物组成的抑菌组合物，所述抑菌组合物由凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物按照浓度比5～7：3～5组成。
16.上述抑菌组合物在防治果蔬致病菌危害中的应用。
17.优选的，所述抑菌组合物在防治果蔬致病菌危害时的使用浓度为218mg/l～448mg/l。
18.基于一个总的发明构思，本发明包括一种含有上述抑菌组合物的抑菌剂，所述抑菌剂由以下组分组成：凤尾草正丁醇提取物400～800mg/l，牛尾蒿丙酮提取物400～800mg/l，黄酮0.6～1mg/l，对羟基肉桂酸5～10mg/l，苯丙氨酸1～5mg/l，喹宁酸4～10mg/l。
19.嘧菌酯是市场推广的新型高效、广谱、内吸性杀菌剂，属于甲氧基丙烯酸酯(strobilurin)类杀菌农药，高效、广谱，对几乎所有的真菌界(子囊菌亚门、担子菌亚门、鞭毛菌亚门和半知菌亚门)病害如白粉病、锈病、网斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性。主要防治对象有黄瓜白粉病和霜霉病，白菜、西瓜、茶树、芒果和香蕉炭疽病，香蕉黑星病、叶斑病和轴腐病，草坪褐斑病，玉米大斑病和植物健康作用等，是目前最常用的果蔬抑菌剂。本发明通过利用不同有机溶剂对凤尾草、牛尾蒿、鬼针草、商陆、葎草等植物进行萃取，得到了具有天然抑菌作用的植物提取物。经验证表明，利用本发明方法制备所得凤尾草、牛尾蒿和商陆的丙酮提取物在添加浓度为1g/l时，其抑菌效果均优于嘧菌酯；而凤尾草和牛尾蒿的正丁醇提取物使用量为1g/l时，抑菌效果也优于嘧菌酯。
20.为了进一步优化抑菌效果，本发明还将抑菌效果较优的凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物按照浓度比6:4、5:5、7:3进行复配，所得组合物的浓度为218mg/l～448mg/l时，抑菌效果明显优于嘧菌酯，说明将上述有机萃取物同时使用，其抑菌效果要优于单独添加一种提取物的情况。
21.为了达到更佳的优化抑菌效果，发明人还将凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物与其他辅料成分共同配制成一种植物抑菌剂，该抑菌剂可用于瓜果蔬菜田间炭疽病防治，在发病前或发病初期开始施药，每隔7～10天施药一次，安全间隔期为14天，使用次数不超过4次，使用方法为叶面喷雾。经大田试验证明，该抑菌剂对炭疽菌具有较高的防治效果。由于该药剂为天然植物的提取物，对于瓜果蔬菜没有任何毒副作用，且该药剂能延长作物生长时间，实现作物的增产增收。
附图说明
22.图1凤尾草正丁醇提取物对炭疽菌菌丝生长抑制的毒力曲线；
23.图2牛尾蒿丙酮提取物对炭疽菌菌丝生长抑制的毒力曲线；
24.图3商陆丙酮提取物对炭疽菌菌丝生长抑制的毒力曲线；
25.图4实施例3中涂布植物提取组合物前后番茄表面霉斑对比；图中a为没有涂布提取组合物的番茄；b为涂布提取组合物的番茄。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
27.1、试验材料
28.本发明所用炭疽菌(colletotrichum gossypii)分离自枣树的果实，所用收集方法为常规菌种分离和鉴定方法；所用凤尾草、牛尾蒿、鬼针草、商陆、葎草等植物样品于2019年7月采自河南省洛阳市卢氏县，上述植物样品清洗后晾干，粉碎得干粉，过40目筛，备用；所用嘧菌酯购自先正达公司；
29.其他所用试剂如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯等，或仪器如光照培养箱、旋转蒸发仪等均为普通市售或本领域技术人员通过公开途径可以获得。
30.2、试验方法
31.2.1植物提取物的制备方法
32.1)称取凤尾草、牛尾蒿、鬼针草、商陆、葎草各1kg，用75％乙醇500ml，对不同植物样品浸泡6
‑
8小时、过滤，得乙醇浸提液；
33.2)将乙醇浸提液依次用乙酸乙酯、正丁醇、丙酮和石油醚溶液于旋转蒸发仪上蒸发浓缩，乙醇浸提液与乙酸乙酯、正丁醇、丙酮的体积比均为1：10；浓缩时间为30
‑
90分钟；浓缩程度至粘稠状液体；
34.3)用乙酸乙酯对上述浓缩液进行分离提取；所用有机溶剂密度较轻且溶于乙酸乙酯，而植物提取物较重沉于底部，分离即得上述植物原料的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、丙酮提取物和石油醚提取物。保存于4℃冰箱中，待用。
35.2.2数据分析方法
36.利用spss软件中anova方法对试验数据进行方差分析，并用duncan’s新复极差法比较数据之间的差异显著性；试验数据采用microsoft excel软件,进行提取物浓度对数值和浓度抑制率或相对防效的机率值之间的线性回归分析。
37.实施例1
38.首先，利用所得不同溶剂的植物提取物进行植物病原真菌菌丝生长抑制试验。
39.采用吴文君的抑制菌丝生长速率法的方法进行。取不同溶剂提取物到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)培养基中，不同溶剂提取物的浓度设置为1g/l、0.5g/l、0.25g/l、0.125g/l；每个培养皿放置1个菌饼，相同条件下进行培养。上述过程以未添加植物提取物的处理组为空白组(ck)，以添加农药嘧菌酯为对照组(嘧菌酯的浓度为0.5*10
‑4g/ml)每个条件设置6个重复，试验结果取平均值。培养结束测定菌落直径并计算菌丝生长抑制率，所述菌落直径和菌丝生长抑制率按照下列公式计算：
40.菌落直径/mm＝测量菌落直径平均值－4(菌饼直径) (1)
[0041][0042]
具体试验结果见表1至表4；
[0043]
表1不同植物的正丁醇提取物对炭疽菌的抑制效果对比(％)
[0044][0045]
表2不同植物的乙酸乙酯提取物对炭疽菌的抑制效果对比(％)
[0046][0047]
表3不同植物的丙酮提取物对炭疽菌的抑制效果对比(％)
[0048][0049][0050]
表4不同植物的石油醚提取物对炭疽菌的抑制效果对比(％)
[0051][0052]
从不同植物组分来看，凤尾草的有机提取物抑菌效果整体最佳：凤尾草正丁醇提取物、丙酮提取物和石油醚提取物均具有一定抑菌效果，且当凤尾草的正丁醇提取物、丙酮提取物添加浓度1g/l，对炭疽菌菌丝生长的抑制率可以达到100％；与添加农药嘧菌酯的对照组相比，凤尾草的正丁醇提取物0.25～1g/l或丙酮提取物0.5～1g/l时，对炭疽菌的抑菌
效果均优于对照组；
[0053]
牛尾蒿的有机提取物的抑菌效果次之：牛尾蒿丙酮提取物添加量为1g/l时，对炭疽菌菌丝生长的抑制率可以达到100％；且牛尾蒿的丙酮提取物0.5～1g/l或正丁醇提取物1g/l时，对炭疽菌的抑菌效果优于农药嘧菌酯对照组；
[0054]
另外两种植物商陆和鬼针草的有机提取物对炭疽菌的抑菌效果较差，其中鬼针草仅其丙酮提取物和正丁醇提取物添加量为1g/l时，可以抑制炭疽菌菌丝的生长，但是抑菌效果弱于对照组；其他条件下的鬼针草有机提取物对炭疽菌生长均没有抑菌效果。
[0055]
对比不同溶剂对相同植物的提取效果可以看出，用丙酮对上述植物组分进行提取效果最好：在1g/l条件下，凤尾草、牛尾蒿和商陆的丙酮提取物对炭疽菌的抑制率均可达到100％，其次是正丁醇的提取效果。用乙酸乙酯对上述植物组分进行提取的效果最差，四种植物的乙酸乙酯提取物均没有抑制炭疽菌的作用。
[0056]
根据上述试验结果选择凤尾草正丁醇提取物、牛尾蒿丙酮提取物以及商陆丙酮提取物进行炭疽菌菌丝生长抑制毒力效果分析，不同萃取物浓度对炭疽菌菌丝生长抑制的毒力曲线见图1～3，毒力回归方程和相关系数r值对比见表5。
[0057]
表5不同萃取物的毒力测定回归方程对比
[0058][0059][0060]
注:x为萃取物的浓度对数，y为萃取物对炭疽菌相对抑制率的机率值，r值为极显著。
[0061]
从表5中可以看出，凤尾草正丁醇提取物对炭疽菌的菌丝生长有明显的抑制作用，其毒力曲线为y＝99.304x 11.426，抑制中浓度ec
50
为0.3884g/l(抑制中浓度指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑制50％所需的浓度)。牛尾蒿丙酮提取物对炭疽菌的菌丝的毒力曲线为y＝107.6x
‑
4.75，抑制中浓度ec
50
为0.5088g/l；商陆丙酮提取物毒力曲线为y＝106.9x
‑
9.75，抑制中浓度ec
50
为0.5637g/l；牛尾蒿丙酮提取物与商陆丙酮提取物的抑制效果接近。
[0062]
实施例2
[0063]
根据实施例1中的抑菌效果，选取凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物进行复配，并考察不同配比对植物病原真菌菌丝生长抑制效果。
[0064]
将凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物按照6:4、5:5、7:3进行混合，添加到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)培养基中，具体添加浓度见表6。理论上在药剂复配时，根据每种药的抑制中浓度ec
50
可进行预期防治效果的估算：
[0065]
预期防治效果(％)＝(单剂1的ec
50
值剂量实际抑制率*配比中的百分率 单剂2的ec
50
剂量实际抑制率*配比中的百分率)/100。
[0066]
将炭疽菌菌饼放置于上述条件的培养平板上，培养温度为25℃
‑
27℃，培养72h，测量菌落直径，并计算不同条件下的菌丝生长抑制率和毒性比率；所述毒性比率计算公式如下：
[0067]
毒性比率＝实际抑制率(％)/预期抑制率(％)
[0068]
若毒性比率明显大于1，为增效作用；若毒性比率明显小于1，为拮抗作用；若毒性比率为1左右，则为相加作用；
[0069]
上述试验以不添加萃取物的培养条件为空白组(ck)，以添加农药嘧菌酯(嘧菌酯的浓度为0.5*10
‑4g/ml)为对照组；每个条件设置三个平行，试验结果取平均值。不同配比条件下萃取组合物对炭疽菌的防治效果对比见表6；毒性比率对比见表7。
[0070]
表6不同配比条件下萃取组合物对炭疽菌的菌丝生长抑制率对比
[0071][0072][0073]
表7不同配比条件下萃取组合物对炭疽菌的毒性比率对比
[0074][0075]
从表6和表7数据可以看出，凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物的复配比例为6：4和5：5时，在防治炭疽菌时，毒性比率在1.2以上，相加效果明显。在这两个复配比例下，凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物的复配组合物浓度为436～448mg/l时，复配组合物对炭疽菌的抑制效果可以达到100％；复配组合物浓度为218～224mg/l时，复配组合
物对炭疽菌的抑制效果也可以达到80％以上。上述结果证明，将凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物复配后，抑菌效果显著优于单独添加一种萃取物的情况。
[0076]
实施例3
[0077]
利用凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物的组合物进行番茄果实霉菌防治试验。
[0078]
选取健康新鲜、形状和大小均匀和成熟度一致的番茄果实，表面用75％的酒精擦拭消毒，晾干备用，将上述组合物配置成浓度为1g/l的供试药液(体积比1:1)，用棉花蘸药轻轻涂于番茄果实表面，置于已消过毒的塑料盆中，盆底铺以滤纸并加无菌水保湿，24h后在果实表面用针刺法接种番茄灰霉病菌；6d后观察处理前后果实的病斑直径(图4)，观察药剂的保护作用；对比不同涂布浓度对番茄果实霉菌的防治效果。可以看出，番茄表面被霉菌侵蚀后，菌斑周围组织呈塌陷开裂状；涂布萃取组合物后，霉菌侵染的程度有所缓和，菌斑相对集中，菌斑周围开裂程度小，说明该萃取组合物能抑制霉菌侵染，减缓果实的腐烂。
[0079]
以清水涂布为空白对照，对比凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物的组合物与嘧菌酯对番茄灰霉病菌的防治效果：用同样的方法(针刺法)处理6d后测量各番茄果实的病斑直径；相对防效按照下列公式计算；
[0080]
病斑直径/mm＝测量病斑直径平均值－4(菌饼直径)
[0081][0082]
计算结果显示，凤尾草和牛尾蒿的萃取组合物的对番茄灰霉病具有防治作用，相对防效为50.65％
‑
100％，略高于对照药剂嘧菌酯相对防效55.55％。
[0083]
实施例4
[0084]
将凤尾草正丁醇提取物和牛尾蒿丙酮提取物与其他辅料成分配制一种具有植物抑菌剂，具体组分和配比见表8；
[0085]
表8一种植物抑菌剂的具体配方
[0086][0087]
所用奎宁酸是一种抗氧化剂、防腐保鲜剂；黄酮具有强抗氧化作用，具有稳定的胶原质作用；对羟基肉桂酸具有强导电性，经常被用于日化行业产品中；苯丙氨酸是一种生理活性的芳香族氨基酸，可降低药物的毒副作用。将上述成分与有效成分一起共同组成抑菌剂，能够提高有效成分的稳定性并降低对植物可能带来的毒副作用。
[0088]
该抑菌剂用于瓜果蔬菜田间炭疽病防治，在发病前或发病初期开始施药，每隔7～10天施药一次，安全间隔期为14天，使用次数不超过4次，使用方法为叶面喷雾。大田试验证明，该抑菌剂对炭疽菌具有较高的防治效果，且用药期灵活、持效期长。由于该药剂为天然
植物的提取物，对于瓜果蔬菜没有任何毒副作用。另外，大田试验结果表明，该药剂能延长作物的生长时间，在一定程度上实现了作物的增产增收。