基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统和方法与流程

1.本发明属于细胞分析、测量技术领域，特别涉及一种基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统和方法。


背景技术：

2.单细胞表征提供了细胞基本结构、功能信息和病理状态，在揭示细胞异质性中起着重要作用，对生命科学研究、疾病诊断和个性化医学意义重大。一直以来，荧光标记是单细胞分析和成像的主要工具，它通过对细胞标记具有分子特异性的检测标签(如荧光染料、量子点、磁珠和稳定同位素等)来识别细胞中的组分及其状态。对细胞进行荧光标记不但需要细胞特异性的先验知识，而且标记过程的侵入式操作会改变细胞状态，使分析过程复杂化，限制后续分析。相比之下，细胞的生物物理特性(如电学特性和机械特性)同样与细胞内的分子组成有关，已被证明是诊断疾病(癌症、疟疾、糖尿病和镰状细胞性贫血等)的有效生物标记，且生物物理特性表征无需标记细胞，表征过程中细胞状态基本不变，表征后细胞仍然可以进行下一步操作和分析，如分选、培养、组学分析等，因此广受关注。
3.单细胞生物物理特性表征已有不少经典方法，如：利用原子力显微镜、微管吸吮、光纤拉伸、流体挤压、力诱导变形等测量单细胞机械参数。这些方法大都在准确性上表现优异，在帮助人类对细胞的理解和认识上取得了巨大的进步，至今也在不断演进，但在细胞样品处理上存在通量低和系统不易操作等固有问题，实用性上大打折扣。近年来，微流控技术已发展成为单细胞生物物理特性表征的有力工具。微流控技术所需样品体积小、整合能力强、生物兼容性好、响应速度快，在通量和系统集成度方面具有很强的优势，促进了细胞特性表征的发展。
4.作为生物物理特性之一，细胞机械特性反映了细胞膜、细胞骨架网络(肌动蛋白丝、中间丝和微管)及细胞核间的联系与特征。机械特性表征的基本原理是在流道中产生细胞的受力变形，通过细胞变形过程和力学模型求取机械特性参数，往往要使用高速相机捕捉毫秒级的受力变形动态过程。美国加州大学伯克利分校rosenbluth课题组提出具有多平行收缩微流道结构的微流控器件，利用结构诱导变形原理，以细胞穿越收缩流道的时间来表征细胞的机械特性。德国德累斯顿工业大学guck课题组提出基于流体诱导变形的微流控器件，利用鞘液的作用力使细胞发生变形，避免了细胞与流道壁粘附作用对变形性的影响，采用变形量表征细胞的机械特性并实现分选。为保证高通量，这些方法需要使用复杂昂贵的高速成像系统得到细胞的动态受力变形过程，且需要对应的图像处理算法与高算力实现对细胞变形量的提取，因此只能实时得到对算力要求很低的变形量或通过时间等现象学参数来定性地表征单细胞，无法解算出细胞的机械特性本征参数(杨氏模量、流度)，导致测量结果高度依赖于测量平台，并且无法在不同平台之间进行比较。
5.在高通量测量场景下，只能以现象学参数(如通过时间、变形量和松弛指数)来定性地表征单个细胞，使得测量结果高度依赖于测量平台，并且无法在不同平台之间进行比较。对单细胞机械本征参数的测量则往往需要使用昂贵的高速成像装置和复杂的图像处理
算法来捕捉毫秒级的细胞受力变形动态过程，产生的大量图像数据，耗费大量算力，只能离线分析，难以实现实时细胞检测。为了摒弃单细胞机械本征参数测量传统方法中必须使用的复杂庞大的高速成像装置，从而降低系统和处理算法的复杂性，为了提高高通量场景下对单细胞机械特性表征的能力，本发明利用阻抗测量的高时间分辨率特性，采用流道结构与电极形状耦合的框架，提出基于阻抗脉冲提取脉冲宽度和形状的方法，无需传统的高速相机，即能求解细胞动态空间位置与形变，实现对单细胞机械本征参数的高通量实时测量。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提出一种基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统和方法。其特征在于，所述基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统，包括微流控系统、多频阻抗测量系统和实时处理算法系统串联组成：
7.所述微流控系统主要由微流控器件和进样驱动装置组成，负责完成驱动大量单细胞聚束列队高速通过测量区域；
8.所述阻抗测量系统主要由直接数字频率合成(dds)信号发生模块、锁定放大器模块和信号采集模块组成，负责测量并采集单细胞的阻抗值；
9.所述实时处理算法系统主要由数字滤波、事件检测与有效信号提取算法组成，负责实现对阻抗信号进行滤波、单细胞事件检测与细胞有效形变区域信号提取以及实时获取待测单细胞杨氏模量等机械本征参数；
10.所述微流控芯片结构采用收缩流道的尺寸设计，测量电极部署在收缩流道的入口与出口处，以使单细胞挤压通过；当细胞挤压通过收缩流道时，测量的阻抗幅度将与细胞的挤压伸长长度l
p
成正比；因此，细胞进入收缩流道的形变过程能够通过阻抗信号来描述。
11.所述微流控芯片结构，考虑到制造和光学观察的便利性，微流控器件芯片设计为两层。
12.所述阻抗测量系统测量并采集单细胞的阻抗值是利用流道结构和电极位置的空间耦合，以及电阻抗测量电信号的高时间分辨率特性，得到单细胞的时空形态信息，通过拟合单细胞力学模型实现对单细胞的高通量实时本征机械参数测量。
13.所述收缩流道的尺寸设计为10μm宽和20μm长以使单细胞挤压通过，测量电极设计为30μm长，20μm宽和20μm间距。
14.一种基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统的测量方法，其特征在于，该方法是一种结合微流控技术和阻抗检测技术的高通量实时机械参数测量方法；利用阻抗流式芯片设计中测量电极与收缩流道结构的空间耦合，使得测量的阻抗信号中包含空间信息，从而得到细胞通过收缩流道的挤压变形动态信息，并利用电阻抗测量信号的高时间分辨率特性来实现对单细胞的高通量单细胞机械本征参数测量，降低测量系统的复杂程度；具体包括如下步骤：
15.1)流道修饰，为了减少细胞与流道表面、侧壁粘附，在进样之前，将微流道用1wt％的pluronic f
‑
127表面活性剂预处理15分钟；
16.2)细胞进给，使用注射泵驱动细胞液，将细胞液样品以1μl/min的流速通入微流道中；
17.3)细胞收缩挤压，单细胞在流道中列队挤压通过收缩流道测量区域，
18.4)其弹性形变由阻抗测量系统采集；
19.5)实时求解本征参数，电阻抗信号实时解算，进而由机械模型得到单细胞机械本征参数。
20.所述利用电阻抗测量信号的高时间分辨率特性来实现对单细胞的高通量单细胞机械本征参数测量，该单细胞机械本征参数测量广泛使用的单细胞幂律流变模型，单细胞的挤压伸长长度l
p
定义为细胞前沿与收缩入口的距离，当细胞挤压通过收缩流道时存在三个阶段：i阶段，细胞刚进入收缩区，l
p
快速非线性增加；ⅱ阶段，细胞开始收缩进入收缩流道并发生弹性变形，导致细胞进入收缩流道的速度降低并呈幂律变化，从而该阶段的l
p
变化将能够反映细胞的机械特性；ⅲ阶段，细胞完全变形并进入收缩流道并快速向前移动，该阶段的移动速度主要与细胞和流道的摩擦力有关。
21.所述由机械模型得到单细胞机械本征参数，在流道中产生细胞的受力变形，通过细胞变形过程和力学模型求取机械特性参数；为获得单细胞的机械本征参数，利用电阻抗测量的高时间分辨率特性，通过流道结构与电极形状的耦合实现对单细胞的形状与机械特性的测量，其关键在于电信号能够关联机械形变；对应于流道壁接触式挤压变形结构，将测量电极部署在收缩流道的入口，当细胞挤压变形进入收缩流道时将等体积置换测量区域内的溶液；此时细胞
‑
培养基混合体系的阻抗可由下式计算
[0022][0023]
其中c
dl
为双电层电容，为挤压细胞的阻抗，为溶液阻抗，ω为激励信号的角频率。由于寄生电容c
s
的存在，测量系统的整体阻抗为：
[0024][0025]
由于c
s
的值一般在0.1
‑
0.5pf之间，在激励信号频率为1mhz时，ω*c
s
≈0，因此而由电阻计算公式可知：
[0026][0027]
其中ρ为电阻率，l为长度，s为流道横截面，又由于l
cell
l
med
＝l
channel
，可得：
[0028][0029]
由于l
channel
为设计常量，因此r
overall
的大小与细胞的挤压伸长长度l
cell
呈正相关，也就是细胞通过收缩流道过程中的挤压变形与阻抗大小形成关联。
[0030]
所述计算求解细胞的机械本征参数，需要提取细胞挤压通过收缩流道的ⅱ阶段l
p
动态变化，在ⅱ阶段中，细胞的剪切蠕变j(t)由下式
[0031]
[0032]
其中r
p
是流道的有效直径，可由计算，φ
p
是一个常数，在矩形截面的微流道中通常取值为2.1，l
p
(t)是细胞在t时刻的挤压伸长量，δp为施加压强；
[0033]
根据幂律流变模型，瞬时剪切蠕变j(t)也可表示为：
[0034][0035]
其中a
j
是反映细胞变形能力的剪切柔量常数，α是幂律指数也称为流度，t0一般取t0＝1s；
[0036]
细胞的杨氏模量a
g
可由下式计算：
[0037][0038]
其中γ为伽马函数，因此由公式(5)
‑
(7)可得
[0039][0040]
因此，细胞的机械本征参数a
g
和α可以通过最小化细胞的测量挤压伸长长度l
cell
(t)及其模型估计值l
p
(t)之间的方差来获得
[0041][0042]
其中i表示连续的时间点，l
cell
(t)为测量值，由公式(4)获得；l
p
(t)为模型估计值，基于网格搜索与最小二乘拟合方法，从参数网格中搜索a
g
和α代入公式(8)中获得。
[0043]
本发明的有益效果是本发明在单细胞阻抗流式分析技术的基础上，利用流道结构和电极位置的空间耦合，以及电阻抗测量电信号的高时间分辨率特性，得到单细胞的时空形态信息，通过拟合单细胞力学模型实现对单细胞的高通量实时本征机械参数测量。
附图说明
[0044]
图1为单细胞机械本征参数实时测量系统示意框图。
[0045]
图2为单细胞测量系统示意图；其中，(a)微流控芯片结构示意图；(b)微流控器件加工示意图；(c)一种微流控器件实例图；(d)测量区域显微结构图。
[0046]
图3为单细胞阻抗测量示意图；其中，(a)单细胞阻抗测量等效电路模型；(b)细胞进入过程中的阻抗信号序列。
[0047]
图4为测量电路示意图。
[0048]
图5为单细胞性能测试，其中(a)细胞弹性形变过程中的有效阻抗及其导数信号图；(b)细胞幂律流变模型拟合结果图。
[0049]
图6为细胞事件的阻抗特性，其中，(a)连续细胞事件的阻抗信号序列；(b)挤压细胞的阻抗与对应的伸长长度；(c)细胞通过收缩流道的连续显微图像，其中椭圆框标示了细胞的位置与挤压时的前端。
[0050]
图7为单细胞机械本征参数测量流程框图。
具体实施方式
[0051]
本发明的目的是提出一种基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统和方法。下面结合附图对本发明予以说明。
[0052]
所述基于电阻抗信号的单细胞机械本征参数测量系统，
[0053]
如图1所示的单细胞机械本征参数实时测量系统示意框图，其包括三个子系统：微流控系统、多频阻抗测量系统和实时处理算法系统串联组成：其中微流控系统主要由微流控器件和进样驱动装置组成，负责完成驱动大量单细胞聚束列队高速通过测量区域；阻抗测量系统主要由直接数字频率合成(dds)信号发生模块、锁定放大器模块和信号采集模块组成，负责测量并采集单细胞的阻抗值；实时处理算法系统主要由数字滤波、事件检测与有效信号提取算法组成，负责实现对阻抗信号进行滤波、单细胞事件检测与细胞有效形变区域信号提取以及实时获取待测单细胞杨氏模量等机械本征参数。
[0054]
如图2所示为单细胞测量系统示意图；其图2中，(a)微流控芯片结构示意图；(b)微流控器件加工示意图；(c)一种微流控器件实例图；(d)测量区域显微结构图。
[0055]
在(a)所示微流控芯片结构示意图中，以直径为15
‑
20μm的单细胞为实例，检测区域流道入口的尺寸设计为20μm以使单细胞聚束列队依次通过检测区域，检测区域收缩流道的尺寸设计为宽10μm、长20μm，以使单细胞挤压通过，测量电极设计为长30μm、宽20μm、间距20μm；部署在收缩流道的入口与出口处。当细胞挤压通过收缩流道时，测量的阻抗幅度将与细胞的挤压伸长长度l
p
成正比，因此，细胞进入收缩流道的形变过程可以通过阻抗信号来描述。考虑到制造和光学观察的便利性，微流控器件芯片设计为两层，其中一个为，底层以玻璃作为基底并配置有一对平面电极以进行阻抗检测，顶层则配置有聚二甲基硅氧烷(pdms)微流道。对应于这个设计，微流控器件的制造过程如图2(b)所示，微流道层通过软光刻技术制作，利用pdms倒模形成，电极层通过lift
‑
off技术图案化到玻璃基底上。在用氧等离子体处理并烘烤之后，将电极层和微流道层对准牢固地键合在一起。最终，为了方便施加激励信号和采集测量信号，电极与其图案匹配的定制印刷电路板通过焊锡焊接在一起。图2(c)与图2(d)分别为微流控器件的实例图与器件的显微结构图，其中虚线方框内为测量区域，细胞悬浮液进口出口通过塑料软管与微流泵相连，通过微流泵将细胞悬浮液推注入微流道中。
[0056]
如图3所示为单细胞阻抗测量示意图；其中，(a)单细胞阻抗测量等效电路模型；(b)细胞进入过程中的阻抗信号序列。
[0057]
单细胞阻抗测量中机械特性表征的基本原理是在流道中产生细胞的受力变形，通过细胞变形过程和力学模型求取机械特性参数。为获得单细胞的机械本征参数，利用电阻抗测量的高时间分辨率特性，通过流道结构与电极形状的耦合实现对单细胞的形状与机械特性的测量，其关键在于电信号能够关联机械形变。对应于流道壁接触式挤压变形结构，本发明将测量电极部署在收缩流道的入口，当细胞挤压变形进入收缩流道时将等体积置换测量区域内的溶液，此时电学等效模型如图3中(a)所示，细胞
‑
培养基混合体系的阻抗可由下式计算
[0058]
[0059]
其中c
dl
为双电层电容，为挤压细胞的阻抗，为溶液阻抗，ω为激励信号的角频率。由于寄生电容c
s
的存在，测量系统的整体阻抗为：
[0060][0061]
由于c
s
的值一般在0.1
‑
0.5pf之间，在激励信号频率为1mhz时，ω*c
s
≈0，因此而由电阻计算公式可知：
[0062][0063]
其中ρ为电阻率，l为长度，s为流道横截面，又由于l
cell
l
med
＝l
channel
，可得：
[0064][0065]
由于l
channel
为设计常量，因此r
overall
的大小与细胞的挤压伸长长度l
cell
呈正相关，也就是细胞通过收缩流道过程中的挤压变形与阻抗大小形成关联。
[0066]
本发明中的机械本征参数测量原理是基于广泛使用的单细胞幂律流变模型，如图2中(a)与图3中(b)所示，细胞的挤压伸长长度l
p
定义为细胞前沿与收缩入口的距离，当细胞挤压通过收缩流道时存在三个阶段：i阶段，细胞刚进入收缩区，l
p
快速非线性增加；ⅱ阶段，细胞开始收缩进入收缩流道并发生弹性变形，导致细胞进入收缩流道的速度降低并呈幂律变化，从而该阶段的l
p
变化将能够反映细胞的机械特性；ⅲ阶段，细胞完全变形并进入收缩流道并快速向前移动，该阶段的移动速度主要与细胞和流道的摩擦力有关。因此，为了计算求解细胞的机械本征参数，需要提取细胞挤压通过收缩流道的ⅱ阶段l
p
动态变化。在ⅱ阶段中，细胞的剪切蠕变j(t)由下式给出：
[0067][0068]
其中r
p
是流道的有效直径，可由计算，φ
p
是一个常数，在矩形截面的微流道中通常取值为2.1，l
p
(t)是细胞在t时刻的挤压伸长量，δp为施加压强。
[0069]
根据幂律流变模型，瞬时剪切蠕变j(t)也可表示为：
[0070][0071]
其中a
j
是反映细胞变形能力的剪切柔量常数，α是幂律指数也称为流度，t0一般取t0＝1s。
[0072]
细胞的杨氏模量a
g
可由式(7)表示，
[0073][0074]
其中γ为伽马函数，因此由式(5)
‑
(7)可得
[0075][0076]
因此，细胞的机械本征参数a
g
和α可以通过最小化细胞的测量挤压伸长长度l
cell
(t)及其模型估计值l
p
(t)之间的方差来获得
[0077][0078]
其中i表示连续的时间点，l
cell
(t)为测量值，由公式(4)获得；l
p
(t)为模型估计值，基于网格搜索与最小二乘拟合方法，从参数网格中搜索a
g
和α代入公式(8)中获得。
[0079]
如图4所示的阻抗测量的基本原理，将电流信号通过跨阻放大器(tia)转换为电压信号，并通过锁相放大器(lia)检测所得的微弱响应信号。一个简单的实例为，信号发生器基于dds芯片ad9958(adi，美国)搭建，tia基于高增益带宽、低偏置电流运算放大器芯片opa657(ti，美国)搭建，解调器基于宽带四象限电压输出乘法器ad835芯片(adi，美国)搭建和具有5khz截止频率的低通滤波器和放大器由高精度，低噪声运算放大器opa227(ti，美国)搭建。最终输出的直流信号由计算机通过数据采集卡(ni，pci
‑
6289)以100khz的采样率进行采样获取，并在计算机上由软件系统进行后续处理。
[0080]
如图5所示，其中(a)细胞弹性形变过程中的有效阻抗及其导数信号图；(b)细胞幂律流变模型拟合结果图；是对图4所示的阻抗测量系统采集的阻抗信号的实时处理，首先基于事件检测原理提取细胞通过收缩流道的有效阻抗信号，随后计算阻抗信号一阶导数，当细胞挤压通过收缩流道分为三个阶段：第i阶段，细胞进入收缩流道区域，细胞的前沿以较快的速度进入收缩流道测量区，其范围从导数的第一个零点到峰值点；在第ⅱ阶段，由于细胞剪切蠕变特性，细胞挤压通过的速度降低，细胞发生弹性变形挤压通过收缩流道，并呈幂律变化，从而该阶段的l
p
变化将能够反映细胞的机械特性；从峰值点到第二个零点；在第ⅲ阶段，细胞完全挤入收缩区并开始挤出，该范围从第二个零点到第三个零点。因此，根据单细胞的机械模型，该算法利用寻峰原理定位峰值点及峰值点后的第一个零点，并从有效阻抗信号中提取ⅱ阶段的弹性变形相关信号用于拟合幂律流变模型，拟合结果如图5中(b)所示的细胞幂律流变模型拟合结果图。该算法经验证，在普通pc机上能够在100ms级时间里完成单细胞的机械本征参数杨氏模量a
g
和流度α的计算，从而实现>100cells/min的高通量单细胞检测。
[0081]
为了验证该测量系统和方法，将k562细胞系通入上述系统，图6中(a)显示了包含252个细胞事件的阻抗信号序列，图6中(b)放大显示了一个细胞经历挤压全过程的阻抗信号。为了确认阻抗信号对应于机械变形；图6中(c)所示基于高速相机同步记录了此细胞的连续显微图像(显示了具有代表性的8帧)，其中图像帧1中的圆圈标示出了收缩流道之前的整个细胞，图像帧2
‑
7中的椭圆标示了细胞挤压通过收缩流道的细胞前端，图像帧8中的椭圆标示出了细胞最后离开收缩流道的细胞尾端，可以看到，连续图像帧1
‑
7提取的细胞挤压伸长量l
p
与阻抗匹配得很好，证明了建立的模型能够很好地描述细胞挤压通过收缩流道的动态变化，验证了基于阻抗信号的测量策略能够适用于单细胞机械本征参数求解。
[0082]
如图7所示的单细胞机械本征参数测量系统；搭建的锁定放大器系统的输入与输出分别与微流控器件的测量电极相连，用于施加激励信号和读出响应信号。及描述了阻抗检测技术的高通量实时机械参数测量方法；利用阻抗流式芯片设计中测量电极与收缩流道
结构的空间耦合，使得测量的阻抗信号中包含空间信息，从而得到细胞通过收缩流道的挤压变形动态信息，并利用电阻抗测量信号的高时间分辨率特性来实现对单细胞的高通量单细胞机械本征参数测量，降低测量系统的复杂程度；为了减少细胞与流道表面的相互作用如侧壁粘附，在进样之前，将微流道用1wt％(1x pbs)的pluronic f
‑
127表面活性剂预处理15分钟。随后使用合适的细胞液驱动方式如注射泵将样品以合适的流速(如1μl/min)通入微流道中，单细胞在流道中列队挤压通过收缩流道测量区域，其弹性形变由阻抗测量系统采集电阻抗信号实时解算，进而由机械模型得到单细胞机械本征参数。