通过递送BMP编码RNA诱导骨生成的制作方法

as a bmp
‑
2delivery vehicle.biomaterials,2014)。然而，利用bmp 蛋白(特别是利用重组bmp
‑
2)治疗骨缺损是昂贵的，并且需要超生理学浓度，其具有引起严重副作用如炎症和结构异常骨形成的风险(zara,tissue engineering:part a 17(9&10), 2011,1389
‑
1399)。
6.目前，数位科学家以治疗目的探索了基因转移到骨组织的可能性。已经证明了基因递送优于蛋白质递送的一些优点。它们包括根据需要局部地和局灶性地表达蛋白质，或以散播方式表达蛋白质的灵活性。此外，蛋白质在细胞内生产。因此，这有助于治疗途径发生。与其重组等价物不同，经由基因转移递送的蛋白质将通过可变百分比的不正确折叠且可能的抗原性分子而是新生和未被污染的(evans,adv drug deliv rev 64(12),2012,1331
‑
1340)。此外，蛋白质可以长时间表达，并且可以调控转基因表达的水平。因此，治疗期间使用的治疗性蛋白质的剂量减少(evans，2012，同上)。特别地，使用编码bmp
‑
2的质粒dna的基因转移显示具有一些骨愈合和再生的潜力(lu,j biomater sci polym ed 23(1
‑
4),2012, 509
‑
526；chang,neurosurgery 65,2009,75
‑
81；park,gene ther 10(13),2003,1089
–
1098)。
7.然而，尽管有一些优点，但是目前用于基因递送的病毒载体与安全性忧虑相关联，其包括强免疫原性和插入诱变。非病毒载体被低基因转移效率限制(evans，2012，同上)。后者主要归因于质粒dna转运入细胞核的不足。
8.基于dna的基因疗法的替代方案是信使rna(mrna)递送。最近，使用mrna的转录物疗法作为基因和重组蛋白疗法的更安全的替代品已经赢得了极大的兴趣。mrna既不具有免疫原性的风险，也不具有潜在的致突变性——其分别伴随重组蛋白和基因疗法。进一步的技术优点是mrna仅需要到达细胞质就变得有活性，而dna需要到达细胞核 (yamamoto,european journal of pharmaceutics and biopharmaceutics 71,2009,484
‑
489； tavernier,journal of controlled release 150,2011,238
‑
247)。相应地，mrna在各种各样的医学适应症中作为先锋治疗法出现(yamamoto,european journal of pharmaceutics andbiopharmaceutics 71,2009,484
‑
4891；tavernier,journal of controlled release 150,2011, 238
‑
247；kormann,nature biotechnology 29,2011,154
‑
157；esteller,nature review genetics12,2011,861
‑
874)。具体而言，mrna最近已经作为非病毒基因疗法的替代方案出现。由于mrna在细胞质中发挥其功能，克服了与穿过核膜的转运相关的限制，所以它们与基于 mrna的转录物疗法无关。
9.尽管mrna清楚地代表了许多治疗法的潜在工具，但是由于免疫原性强和常规mrna 的稳定性有限，临床应用迄今仍然受到限制(例如癌症疫苗接种)(van tendeloo,curr opinmol ther 9(5),2007,423
‑
431)。
10.holtkamp证明通过加入长度为120个核苷酸的聚腺苷酸尾mrna稳定性增加(blood108(13),2006,4009
‑
4017)。进一步，holtkamp还已经报告了关于优化utr以实现稳定性和翻译效率的研究(holtkamp同上)。此外，报道了mrna的化学修饰，其导致了先天免疫系统的增加的稳定性和降低的活化。具体而言，已经报道编码治疗性小鼠促红细胞生成素(epo)和表面活性蛋白b(sp
‑
b)的化学修饰的mrna(cmrna)的产生和治疗潜力，分别诱导血细胞生成和具有治疗致死性先天性肺病的潜力(kormann,nat biotechnol 29(2),2011, 154
‑
157)。此外，胶原海绵已经被用作加载dna或cmrna的3d基质，并且还将细胞接种在其上
(chevallay,medical and biological engineering and computing 38,2000,211
‑
218； reckhenrich,biomaterials 32,2011,1996
‑
2003；scherer,the journal of gene medicine 4,2002, 634
‑
643；elangovan,journal of controlled release 218,2015,22
‑
28；wo 01/00708)。最近的研究已经显示，与基于
‘
培养皿’的2d细胞培养物相比，在3d支架内培养细胞更接近类似于关于细胞形状、细胞信号传导和细胞性状的体内情况，其可以影响细胞中的基因表达 (mueller
‑
klieser,american journal of pysiology
‑
cell physiology,273,1997,c1109
‑
c1123)。胶原海绵是可以改变细胞的迁移、附着、粘附以及在某些情况下分化的3d基质之一(chevallay, medical and biological engineering and computing 38,2000,211
‑
218)。此外，mays已经提出了通过编码t全转录因子foxp3的cmrna治疗过敏性哮喘(j clin invest 123(3),2013, 1216
‑
1228)。作为用于与缺损或缺陷基因或蛋白质相关的疾病的改进的治疗工具的cmrna 也在wo 2011/012316中公开。一般来说，使用cmrna的转录物疗法正作为基因和重组蛋白疗法的更安全而有希望的替代品出现。然而，由于与dna相比，cmrna的瞬时翻译和相对低的稳定性，它们的应用受到限制。此外，例如在采用epo cmrna的情况下，对于成功的治疗，呈现出需要重复施加/施用(需要恒定地适应血细胞比容)。
11.基因疗法中更先进的方法是使用基因修饰的自体组织移植物来修复缺损组织。该治疗策略追求通过递送基因穿过包含祖细胞并具有空间填充、感应或传导支架的特性的最小限度操纵的自体组织来刺激愈合过程(evans,eur cell mater 18,2009,96
‑
111；evans,tissueeng 13(8),2007,1987
‑
1993)。例如，已知脂肪组织具有骨祖细胞；它具有作为天然支架材料的能力，而且可以很容易地收获(evans，2009，同上；dragoo,plast reconstr surg 115(6), 2005,1665
‑
1673)。evans(2009，同上)使用转导有携带人bmp
‑
2cdna的腺病毒的脂肪和肌肉组织移植物来修复骨和软骨缺损。然而，这种方法也遭受上述缺陷的困扰。
12.多年来，持续的基因或药物递送系统已经越来越受到关注，因为它们不需要施加重复的剂量。因此，患者可以更容易地使用他们的药物，并且这可以导致更好地接受治疗方法 (bartus,science 281,1998,1161)。在rna疗法的情况下，当长期蛋白质表达旨在用于例如骨疾病时，这样的延迟递送系统会是特别合适的。然而，到目前为止，缺乏持续递送rna 的有效方法。
13.因此，本发明的技术问题是提供与骨相关的医疗介入的改进手段和方法。
14.该技术问题通过提供在权利要求书中表征的实施方式得以解决。
15.相应地，本发明涉及药物组合物，其包含具有编码骨形态发生蛋白(bmp)的序列的多核糖核苷酸(rna)，用途在于在患者中
16.(i)治疗或预防骨疾病、骨紊乱或骨损伤；和/或
17.(ii)诱导或增强成骨分化、骨生成、骨化、骨再生和/或骨形态发生。
18.本发明还涉及一种方法，其(在需要其的患者中)
19.(i)治疗或预防骨疾病、骨紊乱或骨损伤；和/或
20.(ii)诱导或增强成骨分化、骨生成、骨化、骨再生和/或骨形态发生，
21.所述方法包括向需要其的患者施用药学有效量的具有编码骨bmp的序列的rna(包含其的药物组合物)的步骤。
22.本发明解决了上述确定的技术问题，因为如下文和所附实施例中所记录的，令人
惊讶地发现编码bmp(一种或多种)的rna，特别是编码人bmp
‑
2的cmrna(seq id no：3，由seq id no：1编码；hbmp
‑
2cmrna)或人bmp
‑
7的cmrna(seq id no：4，由seqid no：2编码；hbmp
‑
7cmrna)诱导/增强骨生成。因此，在本发明的上下文中，获得如下理论证据：编码bmp(一种或多种)的rna可以成功地分别用于骨再生的转录物疗法和用于治疗或预防骨相关疾病、紊乱或损伤。
23.此外，在本发明的上下文中，提供了如下证据：使用bmp
‑
编码rna(bmp rna)的单次治疗足以对骨相关疾病、紊乱或损伤进行彻底/完全治疗(或预防)。因此，本发明手段和方法的一个优点是仅需要施用bmp rna一次。
24.本发明的手段和方法的另一个优点是可以应用基于dna的基因疗法和常规转录物疗法的替代方案，而不受各自的限制，例如病毒和非病毒载体的限制，并且不存在安全问题和/或有限的稳定性/表现度的缺点。
25.使用根据本发明的rna的另一个优点是(例如，与使用dna载体相反)，治疗的持续时间是可调整的。例如，在诱导干细胞的情况下，期望的规则是：转录因子仅仅是瞬时活性的，以便将体细胞重编程为干细胞。通过按剂量施用(dosed administration)相关的编码 bmp(一种或多种)的rna，活性随时间可控。与此相反，先前已知的方法具有整合施用的基因的风险，这可能导致并发症，例如肿瘤发生，并且此外，可能使得不可能控制持续时间。
26.本发明特别地基于所附实施例中描述的实验。
27.这些实施例尤其显示用bmp rna(例如hbmp
‑
2或
‑
7cmrna)转染的细胞(例如msc，如bmsc和amsc)分泌了升高水平的生物活性bmp(例如bmp
‑
2或bmp
‑
7)，特别是在长期的基础下(如持续超过7天)。这些水平的分泌蛋白有效诱导成骨分化(在体外实验中)。这通过成骨标志物的表达来指示，特别是通过测定在转染细胞中揭示的升高的碱性磷酸酶 (alp)水平，以及通过runx2、alp、osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白和i型胶原的增强的表达(通过定量rt
‑
pcr检测)来指示。此外，这通过(体外)矿化(沉积的矿化基质)来指示。通过阳性茜素红染色显示矿化，其在转染后2周实现(具有各自cmrna的msc)。用各自的 bmp rna(离体)转染的人脂肪组织也证明了bmp rna(如hbmp
‑
2和
‑
7cmrna)的成骨潜能。人脂肪组织也产生成骨反应(体外)，如hbmp
‑
2、runx2、alp和i型胶原的表达所指示。
28.在本发明的上下文中也证明了转染条件可以被优化以获得更高的转染效率，甚至具有最小的细胞毒性。在这种情况下，首先通过使用数种转染试剂和不同的报告cmrna(荧光蛋白)来研究用cmrna转染msc。实现了高转染效率，这导致持续的蛋白质表达(多至5 天)。通常在转染后24到48小时之间观察到表达峰值。
29.此外，进行了细胞毒性筛选以测试用于转染msc的复合物的生物相容性。从表达和细胞存活的结果中选择最佳转染方案以进一步利用bmp rna(例如hbmp
‑
2或
‑
7cmrna) 转染细胞(msc)。具体地，通过使用长腹水蚤(metridia)荧光素酶作为报告系统显示 dreamfect gold(df
‑
gold)是一种非常适合的将(cm)rna递送入细胞的非病毒性脂质增强剂。df
‑
gold/(cm)rna复合物在(cm)rna转染中是高效的，但对细胞却非常温和。
30.出于转染目的，在本发明和所附实施例的上下文中采用了脂转染和磁转染程序。因此，使用各种(cm)rna，特别是在两种不同的原代细胞类型amsc和bmsc中获得了转染效率的稳健增强。特别地，显示通过脂转染和磁转染两者将bmp rna(例如hbmp
‑
2或
‑
7 cmrna)转移入细胞(例如msc，如bmsc和amsc)支持体外骨生成。
31.最高的转染效率是利用磁转染实现的，特别是在将磁转染应用于msc(例如bmsc或 amsc)时。
32.bmsc尤其被认为难以转染(lakshmipathy,stem cells 22(4),2004,531
‑
543)。然而，在本发明的上下文中显示，即使用bmsc，经由使用egfp cmrna磁性阳性脂质体(lipoplex) 可以实现高效转染，在24小时后产生80％的阳性细胞。类似地，当使用hbmp
‑
2cmrna 时，在amsc中测量到磁转染优势指数(mai)的6倍增加。特别地，与未转染的细胞相比，在7天以上的时间，hbmp
‑
2转染的amsc能够分泌相当更高量的hbmp
‑
2。在这种情况下，在24和72小时之间观察到了蛋白质表达的平台。此效果对于根据本发明的hbmp
‑
2 cmrna(或另一种bmp rna)的治疗作用也是有益的。实际上，由于转染细胞恒定生产 hbmp
‑
2(或另一种bmp)，成骨基因表达和矿化也得到增强。
33.此外，经由磁转染进行转染的amsc展现更高的转录因子runx2、骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达以及更高的矿物质沉积。不受理论所约束，runx2的表达反映了转录因子 runx2在控制成骨分化进程中的作用。经由磁转染用hbmp
‑
2cmrna转染的amsc显示 runx2的最高和持续的表达，其又与在那些样品中体外观察到的更明显的骨生成良好相关。
34.原则上，上面关于bmp
‑
2所述的在本发明的上下文中关于bmp
‑
7也同样显示。特别地，与未转染的细胞相比，在3天以上的时间，hbmp
‑
7转染的amsc能够分泌相当更高量的hbmp
‑
7。在这种情况下，在转染后24小时观察到最大的蛋白质表达。测试了两种不同的hbmp
‑
7cmrna剂量，即20和32pg/细胞。当与32pg/细胞剂量相比时，用20pg/ 细胞转染的细胞导致了显著更高的hbmp
‑
7分泌。转染的amsc能够沉积矿化的基质，这表明那些样品中体外增强的骨生成。
35.如上所述，在本发明的上下文中进一步证明，用hbmp
‑
2cmrna(或另一种bmp rna) 转染的脂肪组织活组织检查表达了增强的hbmp
‑
2水平(或另一种bmp的水平)，其又上调了数种成骨标志物的表达——当体外培养长达7天时。基于这些结果，可以得出结论：转染hbmp
‑
2的脂肪植入物(或用其它bmp转染的脂肪植入物)可以作为hbmp
‑
2(或另一种 bmp)和各自的祖细胞的有效来源用于自体组织修复。因此，在本发明的上下文中实现的体外结果显示bmp rna——特别是hbmp
‑
2和
‑
7cmrna——代表了在将自体组织移植技术应用于骨再生中的进步。它避免了病毒载体的使用及其相关缺陷(安全忧虑等，见上文)。
36.本文提供的所附实施例和公开内容进一步为解决临床相关动物模型中骨形成的研究提供了可靠基础。因此，本领域技术人员可以容易地进行这些研究。
37.作为各自的非限制性实例，将hbmp
‑
2cmrna移植到骨植入材料上并且体内施用到大鼠股骨中非临界尺寸的骨缺损。获得的微计算机断层照相(μct)结果支持hbmp
‑
2 cmrna在骨愈合中的治疗作用。在用hbmp
‑
2cmrna处理的那些动物中，观察到了体内骨生成的刺激。相比之下，在用非特异性cmrna(例如，编码萤火虫萤光素酶(ffl)的 cmrna))处理的动物中，没有观察到骨生成。这证明hbmp
‑
2cmrna介导体内hbmp
‑
2 在骨缺损部位的治疗性表达，引起骨生成发生。
38.在本发明的上下文中进一步证明，当加载rna，特别是bmp
‑
编码rna时，以及当待转染细胞已经接种在其上时，载体/载体主体(例如胶原海绵或纤维蛋白凝块)可以是高效转染系统的一部分。因此，载体/载体主体可以在骨再生中作为3d基质起作用。另外，在本发明的上下文中提供了证据：载体/载体主体(例如胶原海绵或纤维蛋白凝块)不仅可以用作用
于接种细胞的3d支架，而且还可以用作用于持续递送rna(特别是bmp
‑
编码rna，例如cmrna或甚至非化学修饰的bmp
‑
编码rna)的贮库(depot)。
39.特别地，且如所附实施例证明的，首先将胶原海绵用含有(m)rna的阳性脂质体预加载并且真空干燥。然后将干燥的加载的海绵用作细胞接种的3d基质。因此，本发明还涉及将细胞接种和(m)rna转染步骤组合并简化为一个单一步骤的递送系统。另外地，加载 (m)rna的胶原海绵显示延迟的递送性质。因此，它们可以克服经典的2d mrna转染后蛋白质的快速和瞬时产生。作为临床应用的一个例子，使用hbmp2(m)rna
‑
加载的胶原海绵，体外和体内研究骨再生。此外，为了研究真空干燥的(m)rna
‑
加载的胶原海绵作为即用型生物产品的潜力，其保质期在成功的长期稳定性测试中进行估测。因此，本发明进一步提供了持续的(m)rna递送贮库。这在临床方法中为基因疗法的方便而安全的替代品打开了新途径。
40.令人惊奇地是，在本发明的上下文中甚至可能证明未修饰的(m)rna也可以成功地用于基因疗法目的，特别是当作为本文所公开的持续递送系统/贮库的一部分时以及当通过该系统/贮库施用时。
41.本发明的另一个优点是高细胞转染效率(接近100％)和低细胞毒性。如上所述的，考虑到稳定性问题，真空干燥的rna——特别是当加载在胶原海绵上时——是长期稳定的(例如在室温下持续至少6个月)。进一步，在本发明的上下文中，使用hbmp2 rna的体外骨再生(利用mc3t3
‑
e1细胞和msc)和体内骨再生(在大鼠股骨缺损中)证实了该系统在临床前应用中的能力。
42.总而言之，本发明尤其提供了rna
‑
加载(真空干燥)的载体(胶原海绵)作为用于延长蛋白质表达的稳定和有效的rna递送系统，从而使转录物疗法更进一步接近临床方法。特别地，本发明揭示了rna
‑
加载的真空干燥的胶原海绵作为即用型生物产品的安全性、有效性和稳定性。各自的无病毒和无基因技术提供了rna持续递送系统，其独立于rna修饰、细胞类型和细胞密度。当延长的蛋白质递送满足治疗目的时，利用这种技术研究体外和体内的骨骼分化证实了rna
‑
加载的真空干燥的胶原海绵用于临床应用的能力。这项研究为信使rna的更简便又有希望的应用打开了新的途径，其在安全方面超越了基于dna 的基因疗法。
43.本发明还涉及以下条目：
44.1.一种药物组合物，其包含具有编码骨形态发生蛋白(bmp)的序列的多核糖核苷酸 (rna)，用途在于在患者中：
45.(i)治疗或预防骨疾病、骨紊乱或骨损伤；和/或
46.(ii)诱导或增强成骨分化、骨生成、骨化、骨再生和/或骨形态发生。
47.2.条目1的药物组合物，其中所述bmp是bmp
‑
2或bmp
‑
7。
48.3.条目1或2的药物组合物，其中所述rna是被包封的。
49.4.条目1
‑
3中任一项所述的药物组合物，其中所述rna通过脂转染进行转染。
50.5.条目1
‑
4中任一项所述的药物组合物，其中所述rna通过磁转染进行转染。
51.6.条目5的药物组合物，进一步包含磁性纳米颗粒(mnp)。
52.7.条目4
‑
6中任一项所述的药物组合物，进一步包含脂质体转染试剂(ltr)。
53.8.条目7的药物组合物，其中所述ltr与所述rna的w/w比为每微克所述rna 2 至20μg所述ltr。
54.9.条目7或8的药物组合物，其中所述mnp与所述ltr与所述rna的比率分别为约0.5
(铁重量)∶约2至5或4至7(重量)∶约1(重量)。
55.10.条目1
‑
9中任一项所述的药物组合物，其中所述rna将被体内递送。
56.11.条目10的药物组合物，其中所述rna将被直接施用于所述患者的骨或骨组织。
57.12.条目1
‑
9中任一项所述的药物组合物，其中所述rna被离体递送至将引入所述患者的细胞。
58.13.条目12的药物组合物，其中所述rna被离体递送至所述患者的细胞，并且其中所述rna已经递送至的所述细胞将被重新引入所述患者。
59.14.条目12或13的药物组合物，其中所述细胞是骨祖细胞。
60.15.条目12
‑
14中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞为间充质干细胞(msc)。
61.16.条目15的药物组合物，其中所述msc是脂肪来源的间充质干细胞(amsc)或骨髓来源的msc(bmsc)。
62.17.具有编码bmp
‑
2或bmp
‑
7的序列的rna，其中所述rna的25％的胞苷是5
‑ꢀ
甲基胞苷(m5c)，所述rna的25％的尿苷是2
‑
硫尿苷(s2u)。
63.18.条目1
‑
16中任一项所述的药物组合物，其中所述rna为条目17的rna。
64.原则上，本发明的药物组合物用于治疗或预防与骨相关、与骨相联系、与骨生理上相关联或影响骨的任何疾病、紊乱、缺陷或损伤(本文也简称骨疾病)。在本文中，根据本发明的rna可以用于治疗或预防，使得在待引入rna的细胞或组织中，可以形成不能以所期望程度天然表达或根本不天然表达的bmp(一种或多种)。rna可以用于两种情况：(i) 当由于基因缺陷而且还由于疾病而不能形成bmp时，或(ii)在引入bmp有利于身体的情况下。该rna也可以用于补充没有以足够程度表达的bmp。
65.具体地，根据本发明治疗或预防的骨疾病与一种或多种bmp(的功能)相关、相联系或生理上相关联，所述bmp例如bmp
‑
1、bmp
‑
2、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、bmp
‑
6、bmp
‑
7、 bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10和/或bmp
‑
15，优选地bmp
‑
7，更优选地bmp
‑
2。更具体地，根据本发明治疗的骨疾病是可以通过递送、诱导和/或增加一种或多种bmp(的功能)来治疗、预防或改善(其症状)的骨疾病。
66.本发明的药物组合物还可以用于诱导或增强成骨分化(例如将msc分化为成骨细胞)、骨生成、骨化、骨再生、骨形态发生、骨形成、骨生长、矿化和/或钙化，具体地是在患者中；更具体地是在本发明的上下文中治疗或预防骨疾病的背景下。
67.许多种类的骨疾病是本领域已知的，并且例如在evans(2012，同上)中描述的，特别是在其表1中描述的。在本发明的上下文中待治疗或预防的骨疾病的实例是成骨不全(单基因的显性阴性的遗传疾病)、(退行性)骨质疏松症、(骨质疏松性)骨折、不结合、骨缺损、部分缺损、骨囊肿、脊柱融合、缺血性坏死、骨肿瘤(例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤)、骨质溶解(例如癌症诱导的骨质溶解、无菌性松动)。
68.根据本发明可以使用bmp rna的一个具体领域是骨相关的再生医学领域。在疾病过程或衰老的背景下，出现了可以通过引入bmp(一种或多种)来治疗、缓和、预防或甚至治愈的退行性骨疾病，特别是如果由于疾病或老化过程产生的bmp(一种或多种)太少或者根本不产生bmp的话。通过引入编码bmp(一种或多种)的相关bmp rna，可以停止退行性过程，或甚至可以开始再生。因此，一方面，根据本发明治疗或预防的骨疾病是退行性骨疾病。退行性骨疾病的实例是退行性骨质疏松症、佩吉特氏病、椎关节强硬症(也称为进行性退行性
关节炎)、骨软化症和佝偻病等等。
69.一方面，本发明的药物组合物用于骨愈合。例如，在该上下文中，(骨质疏松性)骨折、不结合、部分缺损、骨囊肿、脊柱融合、缺血性坏死将治愈。
70.具体地，根据本发明，设想治疗、预防和/或治愈不结合、部分缺损和骨折，更具体地骨质疏松性骨折。
71.根据本发明采用的rna也可以对骨疾病的过程有影响。实例是如下骨疾病：其不直接归因于基因缺陷，但是其中疾病过程可以凭借bmp rna表达被积极地影响。实例是作为“组织工程”的因子的用于骨愈合的bmp。
72.根据本发明的rna编码的bmp可以是bmp
‑
1、bmp
‑
2、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、 bmp
‑
6、bmp
‑
7、bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10和/或bmp
‑
15，优选地bmp
‑
7，更优选地 bmp
‑
2。根据本发明采用的优选的bmp是人bmp(hbmp)。bmp是本领域熟知的，并且例如在(bessa,j tissue eng regen med 2(2
‑
3)，同上；bessa,j tissue eng regen med 2(1)，同上；urist，同上)中描述的。(h)bmp的核苷酸和氨基酸序列可以经由本领域已知的数据库获得(例如，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/下的ncbi)。下面的表5列出了各自的数据库条目的实例。
73.hbmp
‑
2的具体核苷酸序列在seq id no：1中描绘。hbmp
‑
7的具体核苷酸序列在 seq id no：2中描绘。hbmp
‑
2的具体氨基酸序列在seq id no：3中描绘。hbmp
‑
7的具体氨基酸序列在seq id no：4中描绘。
74.在本发明的上下文中设想术语“bmp”(或“bmp rna”)也包括各自的bmp(或各自的bmp rna)的功能片段和变体。
75.除了bmp rna本身，根据本发明也可以采用bmp rna的变体。bmp rna的变体可以在结构上不同于bmp rna本身，但仍然以与bmp rna本身相同的方式在功能上有活性。特别地，bmp rna的变体旨在编码能够起各自的bmp本身的作用的蛋白质，即能够展现骨形态发生活性。更具体地，bmp rna的变体旨在编码能够调控骨生成的蛋白质。在这种情况下，骨生成可以在两个不同的水平下进行调控：(i)骨骼祖细胞的定型；和/或(ii) 成骨细胞在生后发育中的成熟。因此，bmp rna的变体旨在编码能够诱导或增强成骨分化、骨生成、骨化、骨再生和/或骨形态发生的蛋白质。本领域技术人员以其位置能够容易地确定bmp rna的给定变体是否起各自的bmp rna本身的作用，例如编码能够展现骨形态发生活性的蛋白质。出于该目的，本领域技术人员可以依靠现有技术(例如，在 yamaguchi同上中所公开的)及在所附实施例中提供的各自的手段和方法。例如，技术人员可以确定bmp rna的给定变体是否诱导体外、离体和/或体内骨生成(例如，分别在所附的实施例5或7中所确定的)。
76.原则上，bmp rna的变体与各自的bmp rna本身越相似，则该变体越优选。
77.根据本发明的具体bmp rna或bmp rna的变体可以是选自如下的rna：
78.(a)编码bmp
‑
1、bmp
‑
2(特别优选)、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、bmp
‑
6、bmp
‑
7(优选)、bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10或bmp
‑
15的氨基酸序列——例如编码seq id no：3 或seq id no：4所描绘的氨基酸序列——的rna；
79.(b)编码具有一个或多个被置换、插入和/或缺失的氨基酸残基的bmp
‑
1、bmp
‑
2(特别优选)、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、bmp
‑
6、bmp
‑
7(优选)、bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10 或bmp
‑
15的氨基酸序列——例如编码具有一个或多个被置换、插入和/或缺失的氨基酸残基的seq id no：3或seq id no：4所描绘的氨基酸序列——的rna(其中所述rna编码能够展现骨形态发
生活性的蛋白质)；
80.(c)与编码bmp
‑
1、bmp
‑
2(特别优选)、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、bmp
‑
6、bmp
‑
7(优选)、bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10或bmp
‑
15的氨基酸序列——例如编码seqidno：3或seqidno：4所描绘的氨基酸序列——的核苷酸序列的互补链杂交的rna(由核苷酸序列编码)(其中所述rna编码能够展现骨形态发生活性的蛋白质)；以及
81.(d)编码氨基酸序列的rna，该氨基酸序列与bmp
‑
1、bmp
‑
2(特别优选)、bmp
‑
3、bmp
‑
4、bmp
‑
5、bmp
‑
6、bmp
‑
7(优选)、bmp
‑
8a、bmp
‑
8b、bmp
‑
10或bmp
‑
15的(全长)氨基酸序列——例如与seqidno：3或seqidno：4所描绘的(全长)氨基酸序列——具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性(其中所述rna编码能够展示骨形态发生活性的蛋白质)。
82.在本发明的上下文中，“具有一个或多个被置换、插入和/或缺失的氨基酸残基”具体是指具有至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多50、至多30、至多20、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或1个被置换、插入和/或缺失的氨基酸残基。在一个具体方面，该术语是指一个或多个氨基酸交换，优选地保守氨基酸交换，例如至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多50、至多30、至多20、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或1个(保守)氨基酸交换。
83.在本发明的上下文中，“杂交”是指杂交可以在一个核酸分子与另一个(互补的)核酸分子之间发生。两个核酸分子的杂交通常在常规杂交条件下发生。在本发明的上下文中，优选严格的杂交条件。杂交条件例如在sambrookandrussell(2001),molecularcloning:alaboratorymanual,cshpress,coldspringharbor,ny,usa中所描述。在具体实施方式中，“杂交”是指在下列(严格)杂交条件下发生杂交：
84.杂交缓冲液：2
×
ssc，优选地1
×
ssc；10
×
denhardt溶液(fikoll400 peg bsa；比率为1∶1∶1)；0.1％sds；5mmedta；50mmna2hpo4；250μg/ml鲱鱼精子dna；50μg/ml的trna；或0.25m的磷酸钠缓冲液，ph7.2；1mmedta7％sds
85.杂交温度t60℃，优选地65℃
86.洗涤缓冲液：2
×
ssc，优选地1
×
ssc，更优选地0.1
×
ssc；0.1％sds
87.洗涤温度t60℃，优选地65℃。
88.如上所述，根据本发明也可以采用编码bmp的功能片段的rna。在这种情况下，“功能的”是指该片段以与各自的全长bmprna相同的方式在功能上有活性。特别地，bmp的功能活性片段是仍然能够展现骨形态发生活性的bmp的片段。经过必要的修改，本文上面关于bmprna的变体的功能活性所述的也适用于bmp的功能片段。
89.bmp的具体(功能)片段可以是各自的bmp的至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少500或至少700个(连续)氨基酸残基的氨基酸片段。
90.编码由本文所描述的任何bmprna的变体编码的蛋白质的功能片段的bmprna也可在本发明的上下文中采用。同样，这类bmprna特别旨在编码能够起各自的bmp的作用的蛋白质，即能够展现骨形态发生活性。经过必要的修改，本文上面关于bmprna和bmp片段的变体的功能活性所述的也适用于这类bmprna。
91.原则上，本文所用术语“bmprna”的含义包括以下所有：(i)本文描述的分别编码
bmp本身和全长bmp的rna，(ii)本文描述的编码bmp变体的变体rna，和(iii)本文描述的编码bmp的功能片段(变体)的rna。
92.根据本发明采用的bmp rna/bmp rna构建体的示例性核苷酸序列在seq id no： 29或30(两种hbmp
‑
2(cm)rna)和seq id no：29(hbmp
‑
7(cm)rna)中描绘。
93.在本发明的上下文中，rna应理解为是指任何多核糖核苷酸分子：如果进入细胞，其适用于表达蛋白质或其功能片段，或可翻译成蛋白质或其功能片段。术语“蛋白质”在此处包括任何种类的氨基酸序列，即两个或更多个氨基酸残基的链，其每个经由肽键连接；并且还包括肽和融合蛋白。
94.在特别优选的方面，根据本发明采用的rna，例如包含在本发明的药物组合物中的 rna，是信使rna(mrna)。这意味着根据该方面，任何本文所定义的rna可以是以mrna 的形式。
95.采用的rna可以是双链rna(例如由于分子间或分子内杂交)，或者优选地单链rna (然而，由于分子内杂交，其可以包含至少一个双链部分；例如发夹结构(一个或多个))。
96.在一个方面，根据本发明采用的rna是非天然存在的rna，特别是非天然存在的 mrna。
97.根据本发明采用的rna可以是化学修饰的rna(cmrna)。原则上，这是优选的。 cmrna在本领域中是已知的，并且例如在kormann(同上)、mays(同上)和wo 2011/012316 中描述。具体地，采用的cmrna可以是如wo 2011/012316所述的cmrna。
98.优选地，根据本发明采用的是rna特别是cmrna具有增加的稳定性和/或降低的免疫原性。具体地，设想rna以及特别是cmrna消除了rna与toll样受体和/或与类视黄醇诱导型基因i(rig
‑
i)的相互作用。原则上，这适用于本文定义的任何(cm)rna。
99.免疫原性和稳定性可以以本身已知的方式进行测定。
100.为了测定rna的免疫原性，可以使用本领域技术人员熟知的各种方法。一种非常合适的方法是测定细胞中的炎性标志物作为对施用rna的反应。正常测量与炎症相关的细胞因子，例如tnf
‑
α、ifn
‑
α、ifn
‑
β、il
‑
8、il
‑
6、il
‑
12或本领域技术人员已知的其它细胞因子。dc活化标志物的表达也可用于估测免疫原性。免疫反应的进一步指示是检测与 toll样受体tlr
‑
3、tlr
‑
7和tlr
‑
8的结合以及与解旋酶rig
‑
1的结合。
101.免疫原性通常是与对照相比较来确定的。在常规方法中，将根据本发明采用的rna 施用于细胞，并且测量在确定的时间间隔内炎性标志物的分泌作为对施用rna的反应。作为用于比较的标准品，可以使用已知引起很少免疫应答或没有引起免疫应答的rna，则在这种情况下，对根据本发明采用的rna的免疫应答应该在相同的范围内，而不是升高。利用根据本发明采用的rna，例如预期将免疫应答降低至少30％，通常为至少50％或甚至75％，或甚至完全防止免疫应答。
102.免疫原性可以通过测量前述因子——特别是通过测量tnf
‑
α和il
‑
8水平和对tlr
‑
3、 tlr
‑
7、tlr
‑
8和解旋酶rig
‑
1的结合能力——来确定。从而，为了确定(m)rna是否具有期望的低免疫原性，可以测量在施用相关的多核糖核苷酸之后的前述因子的一个或多个的量。因此，例如，可以经由尾静脉或i.p.向小鼠施用一定量的待检测的(m)rna，然后可以在预定时间段之后例如在7或14天之后测量血液中前述因子的一种或多种。因子的量然后与未处理动物血液中存在的因子的量相关联。为了确定免疫原性，已经发现测定对 tlr
‑
3、
tlr
‑
7、tlr
‑
8和/或解旋酶rig
‑
1的结合能力是非常有价值的。tnf
‑
α水平和il
‑
8 水平也提供了非常好的指示。利用根据本发明采用的(m)rna，与未修饰的rna相比，例如可能将其与tlr
‑
3、tlr
‑
7、tlr
‑
8和rig
‑
1的结合能力降低至少50％。通常，将所述因子的结合降低至少75％或者甚至80％是可能的。在优选的实施方式中，对于根据本发明采用的(m)rna和不施用mrna的动物，与tlr
‑
3、tlr
‑
7、tlr
‑
8和rig
‑
1的结合能力落在相同的范围中。换句话说，在一个具体方面，设想根据本发明采用的(m)rna实际上几乎不引起炎性或免疫反应。
103.特别地，设想根据本发明采用的rna具有如此低的免疫原性，以至于患者的总体状况不受影响。只要总体状况不会因此恶化，则前述因子的轻微增加是可以允许的。
104.根据本发明采用的(m)rna的进一步性质是其效率和稳定性。为此，转录效率、转染效率、翻译效率和蛋白质表达的持续时间是重要的，并且可以通过本身已知的方法来测定。
105.转录效率表明rna可以如何有效地从dna产生。这里，问题可能源于使用高含量的修饰的核苷酸。根据本发明修饰的rna可以以高转录效率产生。
106.根据本发明采用的具体rna是具有(化学)修饰的胞苷核苷酸和/或(化学)修饰的尿苷核苷酸的rna。这类rna在例如wo 2011/012316中描述。
107.合适的(化学)修饰的实例列于表4中。优选的修饰的胞苷是5
‑
甲基胞苷(m5c)。优选的修饰的尿苷是2
‑
硫尿苷(s2u)。
108.具体地，根据本发明采用的cmrna可以是具有5至50％修饰的胞苷核苷酸和/或5至 50％修饰的尿苷核苷酸，以及50至95％未修饰的胞苷核苷酸和/或50至95％的未修饰的尿苷核苷酸的rna。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，但是它们优选地以未修饰的形式存在。优选地，7.5至35％的胞苷和/或尿苷核苷酸被修饰，并且更优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量在15％至25％的范围内和/或修饰的尿苷核苷酸的含量在15％至 25％的范围内。
109.根据本发明采用的cmrna的一个非限制性实例是rna，其中所述rna的约25％的胞苷是修饰的胞苷(例如5
‑
甲基胞苷(m5c))和/或所述rna的约25％的尿苷是修饰的尿苷 (例如2
‑
硫尿苷(s2u))(m5c
(0.25)
s2u
(0.25)
rna)。各自的腺苷和鸟苷核苷酸优选地以未修饰的形式存在。
110.然而，在另一方面，根据本发明采用的rna也可以不是cmrna，即rna可以是非化学修饰的rna。关于这一方面，非化学修饰的rna可以是非天然存在的或优选地天然存在的rna。具体地设想在本发明的上下文中采用的非化学修饰的rna仅包含非修饰的，即天然存在的核苷残基，即天然存在的腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷。原则上，也可以包含其它天然存在的核苷(例如，肌苷、胸苷等)。具体地，rna可能不是如上所述的cmrna，例如，可能不是如wo 2011/012316中描述的cmrna。然而，甚至根据本发明采用的非化学修饰的rna可以具有降低的免疫原性，并且例如可以消除(m)rna与toll样受体和与类视黄醇诱导型基因i(rig
‑
i)的相互作用。特别地，当加载到根据本发明并如本文别处描述的基质或支架即载体上时，非化学修饰的rna可以被有利地使用。因此，同样地，非化学修饰的rna也显示例如延长的寿命。这使得各自的非化学修饰的rna
‑
加载的载体成为用于持续/延迟的rna递送的期望贮库。非化学修饰的rna的另一个优点是不需要化学修饰待使用的rna的步骤。
111.因此，在本发明的上下文中也设想用于本文公开的药物组合物的用途、基质或支架即载体、和药物组合物被配制用于rna——特别是根据本发明采用的非化学修饰的
rna——的持续和/或延迟的递送。更具体地，该药物组合物或基质/支架可以配制成用于持续和/ 或延迟递送rna的系统，例如贮库。如下文更详细描述的，关于这一方面，也优选的是： rna是根据本发明的复合物的形式，基质/支架是可以被真空和/或冷冻干燥并已加载了 rna的胶原海绵。
112.原则上，根据本发明采用的(m)rna可以因此直接地使用。然而，还有(进一步)修饰 mrna的可能性，例如为了引入(进一步)有益的性质。首先，可以通过将其它编码或非编码序列附连到编码链来修饰mrna。其次，还可以通过将进一步的分子与在修饰的核苷酸中提供的官能团结合来进行修饰。
113.在该情况中，根据本发明采用的rna可以具有进一步的功能区和/或3’或5’非编码区。 3’和/或5’非编码区可以是天然侧翼于编码蛋白(bmp)的区域，或者是有助于rna稳定化的人工序列。本领域技术人员可以通过常规实验发现在每种情况下适合于此的序列。
114.在优选的实施方式中，rna在3’端含有m7gpppg帽、内部核糖体进入位点(ires)和 /或聚腺苷酸尾，特别是为了改善翻译。rna可以具有促进翻译的进一步的区域。
115.所必需是可以提供将使用(m)rna治疗、减轻或预防骨疾病的bmp或其功能片段的功能。
116.在一个实施方式中，待采用的(m)rna可以和与对靶细胞特异性的表面受体结合的靶向配体组合，使得靶细胞的受体介导的转染成为可能。为此目的，首先适用于将(m)rna 引入细胞的媒介或者(m)rna本身可以用配体修饰。用于将(m)rna引入细胞的合适的媒介的实例是阳离子试剂。这些包括阳离子脂质、阳离子聚合物或还包括纳米颗粒、纳米胶囊、磁性纳米颗粒和纳米乳液。合适的媒介是本领域技术人员已知的并且在专业文献中描述。合适的配体也是本领域技术人员熟知的并且在文献中描述而且是可获得的。可以使用例如转铁蛋白、乳铁蛋白、克伦特罗(clenbuterol)、糖、糖醛酸、抗体、适配体等作为配体。这类媒介和配体的实例也在本文中的其它地方描述。
117.如上所述，(m)rna本身可以用配体修饰。为此目的，优选的是具有在核糖的2’位置上带有伯氨基或叠氮基的修饰的核苷的(m)rna。实例可以见表4。这类修饰是特别优选的，因为它们有助于生物活性。经由这些修饰，配体可以容易地通过酰胺形成或“点击”化学例如通过生物缀合技术引入。
118.在具体实施方式中，可以在(m)rna的5’端引入可以结合蛋白质例如受体(适配体)的 rna序列。该程序的优点是可以将配体以dna水平直接引入基质，并且通过例如体外翻译(ivt)克隆并引入(m)rna。因此，随后用配体修饰(m)rna不再是必需的。
119.在进一步实施方式中，通过用惰性聚合物例如聚乙二醇(peg)进一步改性来修饰 (m)rna。这方面的方法是本领域技术人员公知的，并且可以使用诸如已知用于配体的方法。因此，例如，可以在用于(m)rna的修饰的核苷酸的小部分中提供转录后结合peg的聚乙二醇的结合位点。聚乙二醇用于(m)rna的细胞外稳定化，即其保护多核糖核苷酸分子直至其到达细胞。在进入细胞时，peg被切断。因此，优选地设计peg和rna之间的键，使得促进进入细胞时的切割。为此，例如可以提供ph依赖性地切断的官能团。稳定 rna的其它分子也可以经由修饰的核苷酸上的适当活性位点提供。以这种方式，可以通过空间稳定保护(m)rna防止酶降解，并且防止与生物流体组分的相互作用。如此修饰的 (m)rna可以称为“隐形(stealth)”(m)rna。
120.用于rna的保护和稳定化的优选方法在ep 11 98 489中描述，对其内容在此明确地进行参考。根据本发明采用的rna可以通过在ep 11 98 489中描述的方法进行保护。已经发现，首先，rna也可以通过该方法来有利地稳定和保护，其次，如此处理的rna的活性不受限制或不被显著地限制。因此，在本发明的优选实施方式中，根据ep 11 98 489处理 rna。
121.在一个实施方式中，根据本发明采用的rna(mrna、cmrna等)可以被包封，即包含在胶囊中。例如，胶囊可以是纳米胶囊。合适的胶囊是本领域已知的，并且也在本文中的其它地方描述。
122.在一个实施方式中，本发明的药物组合物进一步包含用于将rna递送和/或引入靶细胞或靶组织的一种或多种药剂或一种或多种试剂。具体地，设想该/这些药剂(一种或多种) 或试剂(一种或多种)支持将rna递送和/或引入细胞或组织。该/这些药剂(一种或多种)或试剂(一种或多种)可以与rna一起施用。待递送/引入的rna还可以与该/这些药剂(一种或多种)或试剂(一种或多种)偶联(例如共价结合或复合)或未偶联(例如仅与其混合)。各自的药剂或试剂是本领域已知的(例如，tavernier,j control release 150(3)(2011),238
‑
47)，并且例如选自：脂质和脂质体、胶束、聚合物和树状聚体等。各自的药剂或试剂的具体实例是 dotap(1,2
‑
二油基
‑3‑
三甲基铵丙烷)、dodap(1,2
‑
二油基
‑3‑
二甲基铵丙烷)、dotma(1,2
‑ꢀ
二
‑0‑
十八碳烯基
‑3‑
三甲基铵丙烷)、xtc(2,2
‑
二亚油基
‑4‑
二甲基氨基乙基
‑
[1,3]
‑
二氧戊环) 和mc3(((6z,9z,28z,31z)
‑
三十七
‑
6,9,28,31
‑
四烯
‑
19
‑
基4
‑
(二甲基氨基)丁酸酯)、alny
‑
100 ((3ar,5s,6as)
‑
n,n
‑
二甲基
‑
2,2
‑
二((9z,12z)
‑
十八
‑
9,12
‑
二烯)四氢
‑
3ah
‑
环戊二烯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯
‑5‑
胺))、nc98
‑
5(4,7,13
‑
三(3
‑
氧
‑3‑
(十一烷基胺)丙基)
‑
n1,n16
‑
双十一基
ꢀ‑
4,7,10,13
‑
四氮杂十六烷
‑
1,16
‑
二酰胺)、c12
‑
200、dlin
‑
kc2
‑
dma、dodap、1,2
‑
二硬脂酰氧基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
氨基丙烷或“dsdma”、1,2
‑
二油氧基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
氨基丙烷或“dodma”、1,2
‑
二亚油氧基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
氨基丙烷或“dlindma”、1,2
‑
二亚麻烯氧基 (dilinolenyloxy)
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
氨基丙烷或“dlendma”、n
‑
二油基
‑
n,n
‑
二甲基氯化铵或“dodac”、n,n
‑
二硬脂酰
‑
n,n
‑
二甲基溴化铵或“ddab”、n
‑
(1,2
‑
二肉豆蔻氧基丙
‑3‑ꢀ
基)
‑
n,n
‑
二甲基
‑
n
‑
羟乙溴化铵或“dmrie”、3
‑
二甲基氨基
‑2‑
(胆甾
‑5‑
烯
‑3‑
β
‑
氧基丁
‑4‑
氧基)
‑1‑
(顺式,顺式
‑
9,12
‑
十八碳二烯氧基)丙烷或“clindma”、2
‑
[5
’‑
(胆甾
‑5‑
烯
‑3‑
β
‑
氧基)
‑3’‑ꢀ
氧代戊氧基)
‑3‑
二甲基
‑1‑
(顺式,顺式
‑9’
,1
‑2’‑
十八碳二烯氧基)丙烷或“cplindma”、n,n
‑ꢀ
二甲基
‑
3,4
‑
二油氧基苄胺或“dmoba”、1,2
‑
n,n
’‑
二油基氨基甲酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷或“docarbdap”、2,3
‑
二亚油酰氧基
‑
n,n
‑
二甲基丙胺或“dlindap”、1,2
‑
n,n
’‑
二亚油基氨基甲酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷或“dlincarbdap”、1,2
‑
二亚油酰基氨基甲酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷或“dlincdap”、2,2
‑
二亚油基
‑4‑
二甲基氨基甲基
‑
[1,3]
‑
二氧戊环或“dlin
‑
k
‑
dma”、 2,2
‑
二亚油基
‑4‑
二甲基氨基乙基
‑
[1,3]
‑
二氧戊环或“dlin
‑
k
‑
xtc2
‑
dma”、或其混合物 (heyes,j controlled release 107(2005),276
‑
287；morrissey,nat.biotechnol.23(8)(2005), 1003
‑
1007；wo2005/121348)。进一步的实例是dc
‑
chol(n,n
‑
二甲基
‑
n
‑
乙基甲酰胺胆固醇)、1,4
‑
双(3
‑
n
‑
油基氨基
‑
丙基)哌嗪(gao,biochem.biophys.res.comm.179(1991),280； wolf等biotechniques 23(1997),139；u.s.pat.no.5,744,335)。进一步的实例是 lipofectin(dotma∶dope)(invitrogen,carlsbad,calif)、lipofectamine(dospa∶ dope)(invitrogen)、lipofectamine2000.(invitrogen)、fugene、transfectam (dogs)和
effectene。进一步的实例是改性和未改性的聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯
‑
聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、聚赖氨酸、聚精氨酸、低聚/多胺和聚亚乙基亚胺。
[0123]
药剂或试剂可以是低聚物、聚合物或类脂质(lipidoid)。它们可以包含低聚(亚烷基胺) 部分，例如pct/ep 2014/063756中描述的特征性低聚(亚烷基胺)部分。具体地，药剂或试剂可以是如pct/ep 2014/063756中描述的低聚物、聚合物或类脂质。这些具体药剂或试剂的一个主要特征是它们含有下列式(i)的共同结构实体：
[0124][0125]
这类药剂或试剂可以是(组分，其包含)选自如下的低聚(亚烷基胺)：
[0126]
a)包含多个式(ii)的基团作为侧链和/或作为末端基团的低聚物或聚合物：
[0127][0128]
其中在多个这样的基团中，式(ii)的每个基团的变量a、b、p、m、n和r2到r6独立地如下限定：
[0129]
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
[0130]
p是1或2，
[0131]
m是1或2；n为0或1，并且m n≥2；和
[0132]
r2到r5彼此独立地选自氢；基团
‑
ch2‑
ch(oh)
‑
r7、
‑
ch(r7)
‑
ch2‑
oh、
ꢀ‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
o
‑
r7、
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
nh
‑
r7或
‑
ch2‑
r7，其中r7选自c3
‑
c18烷基或具有一个c
‑
c双键的c3
‑
c18烯基；氨基保护基；和聚(乙二醇)链；
[0133]
r6选自氢；基团
‑
ch2‑
ch(oh)
‑
r7、
‑
ch(r7)
‑
ch2‑
oh、
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
o
‑
r7、
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
nh
‑
r7或
‑
ch2‑
r7，其中r7选自c3
‑
c18烷基或具有一个c
‑
c双键的 c3
‑
c18烯基；氨基保护基；
–
c(nh)
‑
nh2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
[0134]
并且其中式(ii)中指示的氮原子的一个或多个可以被质子化以提供式(ii)的阳离子基团；
[0135]
b)包含多个式(iii)的基团作为重复单元的低聚物或聚合物：
[0136][0137]
其中在多个这样的基团中，式(iii)的每个基团的变量a、b、p、m、n和r2到r5独立地如下限定：
[0138]
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
[0139]
p是1或2，
[0140]
m是1或2；n为0或1，并且m n≥2；和
[0141]
r2到r5彼此独立地选自氢；基团
‑
ch2‑
ch(oh)
‑
r7、
‑
ch(r7)
‑
ch2‑
oh、
ꢀ‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
o
‑
r7或
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
nh
‑
r7或
‑
ch2‑
r7，其中r7选自c3
‑
c18烷基或具有一个c
‑
c双键的c3
‑
c18烯基；氨基保护基；
–
c(nh)
‑
nh2；和聚(乙二醇)链；
[0142]
并且其中式(iii)中指示的氮原子的一个或多个可以被质子化以提供式(iii)的阳离子基团；以及
[0143]
c)具有式(iv)的结构的类脂质：
[0144][0145]
其中变量a、b、p、m、n和r1到r6如下限定：
[0146]
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
[0147]
p是1或2，
[0148]
m是1或2；n为0或1，并且m n≥2；和
[0149]
r1到r6彼此独立地选自氢；基团
‑
ch2‑
ch(oh)
‑
r7、
‑
ch(r7)
‑
ch2‑
oh、
ꢀ‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
o
‑
r7、
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
nh
‑
r7或
‑
ch2‑
r7，其中r7选自c3
‑
c18烷基或具有一个c
‑
c双键的c3
‑
c18烯基；氨基保护基；
–
c(nh)
‑
nh2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是r1至r6中至少有两个残基是基团
‑
ch2‑
ch(oh)
‑
r7、
‑
ch(r7)
‑
ch2‑
oh、
ꢀ‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
o
‑
r7、
‑
ch2‑
ch2‑
(c＝o)
‑
nh
‑
r7或
‑
ch2‑
r7，其中r7选自c3
‑
c18烷基或具有一个c
‑
c双键的c3
‑
c18烯基；
[0150]
并且其中式(iv)中指示的氮原子的一个或多个可以被质子化以提供式(iv)的阳离子类脂质。
[0151]
在更具体的方面，这类药剂或试剂可以是(组分，其包含)选自a)和b)的低聚(亚烷基胺)，其中：
[0152]
a)是包含多个式(iia)的基团作为侧链和/或作为末端基团的低聚物或聚合物：
[0153]
‑
nr2{ch2‑
(ch2)
a
‑
nr3‑
ch2‑
(ch2)
b
‑
nr4}
m
‑
[ch2‑
(ch2)
a
‑
nr5]
n
‑
r6(iia)，
[0154]
其中a、b、m、n和r2到r6如上述所限定，并且其中式(iia)中指示的氮原子的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；并且
[0155]
b)是包含多个式(iiia)的基团作为重复单元的低聚物或聚合物：
[0156]
‑
nr2{ch2‑
(ch2)
a
‑
nr3‑
ch2‑
(ch2)
b
‑
nr4}
m
‑
[ch2‑
(ch2)
a
‑
nr5]
n
‑
(iiia)，
[0157]
其中a、b、m、n和r2到r5如上述所限定，并且其中式(iiia)中指示的氮原子的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。
[0158]
在另一个更具体的方面，这类药剂或试剂可以是(组分，其包含)选自具有式(iva)结构的类脂质的低聚(亚烷基胺)：
[0159]
r1‑
nr2{ch2‑
(ch2)
a
‑
nr3‑
ch2‑
(ch2)
b
‑
nr4}
m
‑
[ch2‑
(ch2)
a
‑
nr5]
n
‑
r6(iva)，
[0160]
其中a、b、m、n和r1到r6如上述所限定，并且其中式(iva)中指示的氮原子的一个或多个可被质子化以提供阳离子类脂质。
[0161]
对于这类药剂或试剂，在式(ii)、(iia)、(iii)、(iiia)、(iv)或(iva)中，n可以是1；或者m可以是1并且n可以是1。
[0162]
此外，对于这类药剂或试剂，在式(ii)、(iia)、(iii)、(iiia)、(iv)或(iva)中，a可
以是1并且b可以是2；或者a可以是2并且b可以是1。
[0163]
在一个具体方面，低聚物、聚合物或类脂质可以是阳离子(例如质子化)低聚物、聚合物或类脂质。
[0164]
在本发明的上下文中采用的这类低聚物、聚合物或类脂质的一个非限制性实例是阳离子脂质，其通过将100mg n,n
’‑
双(2
‑
氨基乙基)
‑
1,3
‑
丙二胺(0.623mmol)与575.07mg 1,2
‑ꢀ
环氧十二烷(3.12mmol，(n
‑
1)当量，其中n是2
×
量的伯胺加1
×
量的仲胺/低聚(亚烷基胺)) 混合制备，并在80℃下在不断摇动下混合96小时。这类低聚物、聚合物或类脂质也称为类脂质“c12
‑
(2
‑3‑
2)”。
[0165]
根据本发明采用的药剂或试剂——特别是聚合物——可以是共聚物，特别是统计共聚物。这类共聚物可以是含有统计/随机排列的交替长度的亚烷基胺重复单元的共聚物(例如，与较不优选的聚合物相反，该较不优选的聚合物含有类似布置的非交替长度的亚烷基胺重复单元)。共聚物可以是阳离子(例如质子化)共聚物。根据本发明采用的共聚物是本领域已知的，并且例如在ep 14 19 9439.2、wo 01/00708、ep
‑
a1 198489和ca
‑
a1 2,377,207中描述。
[0166]
具体地，共聚物可以是统计共聚物，其包含多个重复单元(a)，所述重复单元(a)独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元：
[0167]
‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑ꢀꢀꢀ
(a1)
[0168]
和
[0169]
多个重复单元(b)，所述重复单元(b)独立地选自下式(b1)至(b4)的重复单元：
[0170]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑ꢀꢀꢀ
(b1)
[0171][0172]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑ꢀꢀꢀ
(b3)
[0173][0174]
其中重复单元(a)之和与重复单元(b)之和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且
[0175]
其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)的氮原子的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。
[0176]
共聚物可以是统计共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)在共聚物大分子中以统计学分布。其通常由在聚合反应期间产生重复单元(a)的单体和在聚合反应期间产生重复单元(b)的单体的混合物的共聚合获得。优选地，共聚物是无规共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)在聚合物大分子中无规分布。
[0177]
根据本发明的共聚物可以是直链、支链或树状共聚物。如本领域技术人员读者将理解的，具有两个价(即对相邻单元的开键(open bond))的式(a1)、(b1)或(b3)的重复单元导致共聚物结构以线性方式的延伸。因此，本发明的直链共聚物包含式(a1)的重复单元和一种或多种类型的式(b1)和(b3)的重复单元，但不包括式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元。如
将进一步理解的，具有三价的式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元的存在提供了共聚物结构中的分支点。因此，支链共聚物包含一种或多种类型的式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元，并且进一步可以包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。
[0178]
根据本发明的共聚物包含多个重复单元(a)——其独立地选自上面限定的式(a1)和(a2) 的重复单元——和多个重复单元(b)——其独立地选自上面限定的式(b1)至(b4)的重复单元。优选的是如此共聚物，其包含多个重复单元(a)——其独立地选自上面限定的式(a1)和 (a2)的重复单元——和多个重复单元(b)——其独立地选自上面限定的式(b1)和(b2)的重复单元。
[0179]
还优选的是，根据本发明的共聚物是包含一种或多种类型的选自重复单元(a2)、(b2) 和(b4)的重复单元的支链共聚物，并且其任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1) 和(b3)的重复单元，以及特别地是包含式(a2)的重复单元和一种或多种类型的式(b2)和(b4) 的重复单元的共聚物，并且其任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。根据上述，更优选的共聚物因此是支链共聚物，其包含式(a2)的重复单元和式(b2) 的重复单元，并且其任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)和(b1)的重复单元。
[0180]
在根据本发明的共聚物中，重复单元(a)和重复单元(b)的总数通常为20或更多，优选为50或更多，更优选为100或更多。通常，重复单元(a)和重复单元(b)的总数为10,000或更少，优选为5,000或更少，更优选为1,000或更少。
[0181]
此外，对于根据本发明的共聚物优选地是重复单元(a)和(b)占共聚物中所有重复单元的 80摩尔％或更多、更优选地90摩尔％或更多。进一步优选的是如此共聚物，其中选自(a1) 和(a2)的重复单元(a)和选自(b1)和(b2)的重复单元(b)占共聚物中所有重复单元的80摩尔％或更多、更优选地90摩尔％或更多。最优选的是，共聚物中所有重复单元是重复单元(a) 或(b)，具体地共聚物中所有重复单元为选自(a1)和(a2)的重复单元(a)或选自(b1)和(b2)的重复单元(b)。
[0182]
例如经由尺寸排阻色谱法相对于直链聚(环氧乙烷)标准品所测量的，根据本发明的共聚物的重均分子量的范围通常为1,000至500,000da，优选为2,500至250,000da，更优选为5,000
‑
50,000以下。
[0183]
根据本发明的共聚物的末端基团通常包含一种或多种类型的基团(c)，其独立地选自下式(c1)至(c3)的基团，优选地选自下式(c1)和(c2)的基团：
[0184]
‑
ch2‑
ch2‑
nh2ꢀꢀꢀ
(c1)
[0185]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh2ꢀꢀꢀ
(c2)
[0186]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh2ꢀꢀꢀ
(c3)。
[0187]
优选地，共聚物中的末端基团由一种或多种类型的基团(c)组成，所述基团(c)独立地选自下式(c1)至(c3)的基团，优选地选自式(c1)和(c2)的基团。如本领域技术人员将理解的，末端基团的数目取决于根据本发明的共聚物的结构。虽然直链共聚物仅具有两个末端，但是在支链特别是树状共聚物中含有更大数量的末端基团。如将进一步理解的，共聚物中包含的末端基团(c)的氮原子的一个或多个也可以被质子化以提供阳离子共聚物。
[0188]
在根据本发明的共聚物中，重复单元(a)之和与重复单元(b)之和的摩尔比在0.7/1.0至 1.0/0.7的范围内，并且优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内。该摩尔比可以例如经
由nmr 确定。因此，应当理解，通常对根据本发明的共聚物的多个大分子确定该比率，并且该比率通常指示多个大分子中的重复单元(a)之和与重复单元(b)之和的总比率。
[0189]
如上所述，根据本发明的共聚物的氮原子的一个或多个可以被质子化以产生阳离子形式——通常是低聚阳离子或多阳离子形式——的共聚物。应当理解，重复单元(a)或(b)中或末端基团(c)中的伯、仲或叔氨基可以作为质子受体，特别是在包括生理液体的水和水溶液中。因此，本发明的共聚物在ph低于7.5的水溶液中通常具有总的正电荷。本文所指的水溶液是其中溶剂包含50％(vol./vol.)或更多、优选地80或90％或更多和最优选地100％的水的溶液。同样地，如果根据本发明的组合物与ph低于7.5的生理液体——包括例如血液和肺液——接触，则它们通常包含其中氮原子被质子化的重复单元(a)和(b)。在根据本发明的组合物中使用的共聚物的pk
a
值可以通过使用自动pk
a
滴定仪的酸碱滴定来测定。然后，可以例如从亨德森
‑
哈塞尔巴赫(henderson
‑
hasselbach)方程计算给定ph值下的净电荷。任何电荷可能会在数个碱性中心(basic centre)中共享，并不必然归于单个点。通常，在生理ph下的溶液中，在根据本发明的组合物中使用的共聚物包含具有质子化状态的氨基的重复单元和具有非质子化状态的氨基的重复单元。
[0190]
然而，如本领域技术人员读者将理解的，根据本发明的共聚物以及根据本发明的组合物也可以以含有阳离子形式的共聚物的干燥的盐的形式提供。
[0191]
如将进一步理解的，包含共聚物和核酸——特别是rna，优选地单链rna如mrna ——的根据本发明的组合物中质子化氨基的正电荷的抗衡离子(阴离子)通常由在核酸中包含的阴离子部分提供。如果带正电荷的基团与核酸中的阴离子部分相比过量存在，则正电荷可以由其它阴离子平衡，特别是通常在生理液体中遇到的阴离子，例如cl
‑
或hco3‑
。
[0192]
根据上述，根据本发明优选的共聚物是无规共聚物，其中：
[0193]
所有重复单元的80摩尔％或更多，更优选地所有重复单元由下述形成：
[0194]
多个重复单元(a)，其独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元：
[0195]
‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑ꢀꢀꢀ
(a1)
[0196]
和
[0197]
多个重复单元(b)，其独立地选自下式(b1)和(b2)的重复单元：
[0198]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑ꢀꢀꢀ
(b1)
[0199][0200]
其中重复单元(a)之和与重复单元(b)之和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，更优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内；
[0201]
其中所述共聚物的末端基团由下述形成：
[0202]
基团(c)，其独立地选自式(c1)和(c2)的基团：
[0203]
‑
ch2‑
ch2‑
nh2ꢀꢀꢀ
(c1)
[0204]
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
nh2ꢀꢀꢀ
(c2)；并且
[0205]
其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)和/或末端基团(c)的氮原子的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。进一步优选的是，共聚物是支链共聚物，其包含单
元(a2) 和(b2)，任选地连同单元(a1)和/或(b1)。
[0206]
根据本发明的共聚物可以利用与已知用于制备聚亚烷基亚胺如支链或直链聚亚乙基亚胺(pei)的类似程序来便利地制备。应当理解，用于生产共聚物的单体必须相应地调整。在本发明的上下文中，已经发现单体可以以定量的方式便利地反应，使得可以通过相应地调整在经历聚合的单体混合物中的单体比率来调整共聚物中单元(a)和(b)的比率。聚亚乙基亚胺可以例如经由氮丙啶的开环聚合来制备，而根据本发明的共聚物可以经由包含氮丙啶、氮杂环丁烷和在适用的情况下吡咯烷——或在优选实施方式中，氮丙啶和氮杂环丁烷——或由其组成的单体混合物的开环聚合来制备。应当理解，表述“在适用的情况下”是指由吡咯烷形成的重复单元(b3)和(b4)或末端基团(c3)的存在或不存在。未取代的环胺的开环聚合通常导致支链共聚物。根据本发明的直链共聚物可以例如经由合适的n
‑
取代的氮丙啶、n
‑
取代的氮杂环丁烷和n
‑
取代的吡咯烷、或n
‑
取代的氮丙啶和n
‑
取代的氮杂环丁烷的聚合来制备，其后是例如通过水解裂解附连于所得聚亚烷基亚胺链的n
‑
取代基，例如类似于katrien f.weyts,eric j.goethals,new synthesis of linear polyethyleneimine,polymerbulletin,january 1988,volume 19,issue 1,pp 13
‑
19中公开的程序。
[0207]
对于树状聚体(或树状共聚物)的制备，可以类似地应用已知用于生产聚亚乙基亚胺或聚亚丙基胺树状聚体的合成策略。聚亚丙基亚胺树状聚体可以使用至伯胺的重复顺序的 michael加成，接着使用多相催化氢化从丙烯腈结构单元来合成(newkome and shreinerpoly(amidoamine),polypropylenimine,and related dendrimers and dendrons possessingdifferent 1
→
2branching motifs:an overview of the divergent procedures.polymer 49(2008) 1
‑
173；de brabander
‑
van den berg等large
‑
scale production of polypropylenimine dendrimers, macromolecular symposia(1994)77(1)51
–
62)。聚亚乙基亚胺树状聚体可以使用重复顺序的 michael加成乙烯基溴结构单元至伯胺，然后使用gabriel胺合成方法将烷基溴转化为胺来产生(yemul&imae,synthesis and characterization of poly(ethyleneimine)dendrimers,colloidpolym sci(2008)286:747
–
752)。因此，本领域技术人员将不仅能够生产具有例如丙烯亚胺和乙烯亚胺的严格交替层的树状聚体。类似地，可以生成具有包括式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元——优选地重复单元(a2)和(b2)——的无规组合物或由其组成的层的树状聚体生成 (generation)。
[0208]
氮丙啶和氮杂环丁烷，或氮丙啶、氮杂环丁烷和吡咯烷的开环聚合可以在溶液中进行，例如在水中进行。总单体浓度没有特别限制，典型浓度范围为10％wt/wt至80％wt/wt，优选地30％wt/wt至60％wt/wt。通常，聚合由质子引发，使得优选向反应体系中加入布朗斯台德酸，特别是无机酸如硫酸。基于单体的总浓度，少量的酸通常是足够的，如0.001至 0.01当量。反应以合适的速率进行，例如在50至150℃、特别是90至140℃的温度范围内。在这些范围内，较高分子量的共聚物通常在较高的温度下，而较低分子量的共聚物在较低的温度下。
[0209]
原则上，类脂质是根据本发明采用的优选的药剂或试剂，特别是与低聚物，更尤其是与聚合物相比。
[0210]
用于将rna递送和/或引入靶细胞或靶组织的一种或多种药剂或一种或多种试剂
的进一步实例是脂质体转染试剂(ltr’s)和磁性颗粒(mp)，如本文的其它地方所描述的。
[0211]
用于将rna递送和/或引入靶细胞或靶组织的一种具体模式是转染。因此，在一个方面，设想待采用的rna被转染(入(靶)细胞或组织)，以经由转染递送/施用，和/或被准备用于转染。用于转染rna的手段和方法在本领域中是公知的，并且例如描述于tavernier(同上)、yamamoto(eur j pharm biopharm.71(3)(2009),484
‑
9)和kormann(nat biotechnol.29(2) (2011),154
‑
7)中。
[0212]
转染的具体模式是脂转染、磁转染或磁性脂转染。在本发明的上下文中，利用这些类转染达到了良好的结果。利用磁转染，结果特别好，利用磁性脂转染，结果极其好。
[0213]
因此，在一个方面，待采用的rna可以准备用于脂转染、准备通过脂转染进行转染、经由脂转染递送/引入和/或经由脂转染施用。
[0214]
根据该方面，本发明的药物组合物可以(进一步)包含至少一种脂质或脂质体转染试剂或增强剂(ltr；脂质体转染试剂)。待采用的rna可以包含在ltr中、与ltr复合和/或由ltr递送。具体地，待采用的rna可以包含在含有rna和ltr的(各自的)脂转染复合物中和/或由包含rna和ltr的(各自的)脂转染复合物递送。本发明的药物组合物可以 (进一步)包含脂转染复合物。
[0215]
ltr是本领域已知的，并且例如由ozbiosciences,marseille,france发售。根据本发明采用的ltr可以选自用于将rna递送和/或引入靶细胞或靶组织的上述药剂或试剂。例如，这类ltr可以是脂质或类脂质，优选地阳离子脂质或阳离子类脂质，如pct/ep2014/063756 中所公开的类脂质(例如c12
‑
(2
‑3‑
2))，ep2285772中公开的脂质(例如dogtor)和ep1003711 中公开的脂多胺(例如dreamfect
tm
和dreamfect gold
tm
)。具体的ltr可以选自：
[0216]
(i)c12
‑
(2
‑3‑
2)；
[0217]
(ii)dreamfect
tm
，优选地dreamfect gold
tm
(df
tm
/df
‑
gold
tm
；ozbiosciences, marseille,france)；
[0218]
(iii)dogtor(ozbiosciences,marseille,france)；以及
[0219]
(iv)lipofectamine，例如，lipofectamine 2000(invitrogene,ca,usa)。
[0220]
原则上，dogtor是优选的，dreamfect
tm
是更优选的并且f
‑
gold
tm
和c12
‑
(2
‑3‑
2)是甚至更优选的ltr(一种或多种)。
[0221]
ltr，如dogtor，例如在ep2285772中描述。ltr，如df
tm
或df
‑
gold
tm
，例如在 ep1003711中描述。原则上，如pct/ep2014/063756中公开的低聚物、聚合物或类脂质， ep2285772中公开的具体阳离子脂质和ep1003711中公开的具体脂多胺是根据本发明的优选的ltr。ltr，如c12
‑
(2
‑3‑
2)和df
‑
gold
tm
，是最优选的。
[0222]
脂转染复合物的非限制性实例是df
‑
gold
tm
/rna阳性脂质体和c12
‑
(2
‑3‑
2)/rna阳性脂质体。
[0223]
将本文所述的用于将rna递送和/或引入靶细胞或靶组织的药剂和试剂和本文所述的 ltr可以与一种或多种(例如两种、三种或四种)进一步的脂质(如，例如胆固醇、dope和/ 或peg
‑
脂质(例如dmpe
‑
peg))结合。这些进一步的脂质可以支持药剂/试剂和ltr的期望功能(分别支持和/或增加将rna递送和/或引入细胞或组织和提高转染的效率)，并且作为各自的“辅助脂质”起作用。这类“辅助脂质”的具体实例是胆固醇、dppc、dope和/ 或peg
‑
脂质(例如dmpe
‑
peg、dmg
‑
peg(例如dmg
‑
peg2k))。进一步脂质(例如“辅助脂质”)也可以是
本文公开的复合物/颗粒的部分(一个或多个)。技术人员以其位置容易根据本发明制备复合物/颗粒。进一步脂质(例如“辅助脂质”)的实例也是本领域已知的。本领域技术人员以其位置容易选择合适的进一步脂质(例如“辅助脂质”)和药剂/试剂/ltr与进一步脂质(例如“辅助脂质”)的比率。这类比率可以是1
‑
4∶1
‑
5、3
‑
4∶4
‑
6、约4∶约5、约4∶约5.3的药剂/试剂/ltr∶进一步脂质(一种或多种)的摩尔比(更窄的范围是优选的)。例如，药剂/试剂/ltr可以与三种进一步脂质如胆固醇、dope和dmpe
‑
peg组合，其摩尔比分别为8∶5.3∶4.4∶0.9，更具体地分别为8∶5.29∶4.41∶0.88。
[0224]
在另一方面，待采用的rna可以准备用于磁转染、准备通过磁转染进行转染、经由磁转染递送/引入、和/或经由磁转染施用。磁转染原理是本领域已知的，并且例如在wo02/00870中描述。
[0225]
根据该方面，本发明的药物组合物可以(进一步)包含至少一种磁性颗粒(mp)，特别是至少一种磁性纳米颗粒(mnp)。待采用的rna可以包含在mp中、与mp复合和/或由mp 递送。具体地，待采用的rna可以包含在含有rna和mp的(各自的)磁转染复合物中和/ 或由其递送。本发明的药物组合物可以(进一步)包含磁转染复合物。
[0226]
待使用的mp(或mnp)可以是核
‑
壳mp、氧化铁二氧化硅mp和/或(支链的)pei装饰的mp。具体的mp(或mnp)可以是具有siox/膦酸盐
‑
pei涂层的mp(或mnp)，其进一步称为so
‑
mag6
‑
115 mp(或mnp)。mp(或mnp)可以根据所附实施例产生，并且例如根据 mykhaylyk(liposomal magnetofection.in:weissig v(ed.)liposomes,methods in molecularbiology,vol.605.humana press
‑
springer,new york 2010,487
‑
525；pharm res 29(5),2012, 1344
‑
1365)产生。
[0227]
磁转染复合物的一个非限制性实例是so
‑
mag6
‑
115 mp(或mnp)/rna磁转染复合物。 wo 02/00870中描述了进一步的mp(或mnp)和各自的磁转染复合物。
[0228]
在更具体的方面，磁转染复合体可以包括第三组分，并且因此可以是磁性三联体的形式。第三组分可以是ltr(例如如上文中所限定的)。然后可以将磁性三联体命名为磁性脂转染复合物，并且可以命名为例如下文限定的磁性脂转染复合物。
[0229]
在另一个更具体的方面，待采用的rna可以准备用于磁性脂转染、准备用于通过磁性脂转染进行转染、经由磁性脂转染递送/引入、和/或经由磁性脂转染施用。
[0230]
原则上，磁性脂转染结合了脂转染和磁转染，并且特别是两种转染方法的优点。因此，原则上，经过必要的修改，上文关于脂转染和磁转染所述的也适用于磁性脂转染。
[0231]
根据磁性脂转染的方面，本发明的药物组合物可以(进一步)包含至少一种磁性脂转染复合物(也称为磁性阳性脂质体)。待采用的rna可以包含在这种复合物中、与这种复合物复合、和/或由这种复合物递送。磁性脂转染复合物可以是磁性三联体，并且可以例如包含 rna、至少一种mp(如上文所限定的)和至少一种ltr(如上文所限定的)。
[0232]
磁性脂转染复合物的一个非限制性实例是so
‑
mag6
‑
115 mp(或mnp)/df
‑
gold/rna 磁性脂转染复合物。
[0233]
原则上，技术人员可以容易地确定根据本发明采用的转染复合物的组分(例如rna、 ltr、mp)之间的合适比率。各自的指导在例如kormann(同上)、mays(同上)、wo 02/00870 和所附实施例中提供。
[0234]
然而，如上所述，在本发明的上下文中发现，特定比率是非常有用的，例如导致高
度有效和/或有效率的转染。
[0235]
这类特定的比率是ltr与rna的w/w比的范围为约1至40μg、5至35μg、10至30 μg、15至25μg、17至23μg、18至22μg、19至21μg、1至20μg、2至20μg、3至20μg、 1至15μg、2至15μg、3至15μg、1至10μg、2至10μg、3至10μg、4至10μg、5至 10μg、4至12μg、5至11μg、6至10μg或7至9μg的所述ltr/μg所述rna。同样地，特别是，如果将ltr制备成ltr溶液(例如在所附实施例中)，则这类比率是ltr溶液与 rna的v/w比的范围为0.5至15μl、0.5至10μl、0.5至8μl、1至15μl、1至10μl、1 至8μl、1至6μl、1.5至5.5μl、2至5μl、3至4μl、1至3μl、4至6μl、1.5至2.5μl、 4.5至5.5μl、1.7至2.3μl或4.7至5.3μl所述ltr溶液/μg所述rna。原则上，更窄的范围是优选的。在这种情况下，优选的ltr是dreamfect
tm
，或更优选的df
‑
gold
tm
或 c12
‑
(2
‑3‑
2)。优选的rna是bmp
‑
7rna，更优选的bmp
‑
2rna。
[0236]
ltr与rna的进一步特定的比率为约4
‑
12、优选地约6
‑
10、优选地约9
‑
11、和更优选地约8的n/p比，其中n/p代表ltr的氨基与rna的磷酸基团的摩尔比。
[0237]
特别地，如果细胞，如脂肪来源的间充质干细胞(amsc)，要被转染，则这样的特定比率是ltr与rna的w/w比的范围为约5至35μg、10至30μg、15至25μg、17至23μg、 18至22μg或19至21μg所述ltr/μg所述rna。同样地，特别是，如果将ltr制备成 ltr溶液(例如在所附实施例中)，则这样的特定比率是ltr溶液与rna的v/w比的范围为4至6μl、4.5至5.5μl或4.7至5.3μl所述ltr溶液/μg所述rna。原则上，更窄的范围是优选的。最优选的比率(导致amsc的高度有效和有效率的转染)是ltr与rna的w/w 比为每μg所述rna约20μg所述ltr，和/或ltr溶液与rna的v/w比为每μg所述rna 约5μl所述ltr溶液。经过必要的修改，上面关于优选的ltr和/或rna所述的也适用于这里。
[0238]
特别是，如果细胞，如骨髓来源的msc(bmsc)，要被转染，则这类特定比率是ltr 与rna的w/w比的范围为约4至12μg、5至11μg、6至10μg或7至9μg所述ltr每μg所述rna。同样地，特别是，如果将ltr制备成ltr溶液(例如在所附实施例中)，则这样的特定比率是ltr溶液与rna的v/w比的范围为1至3μl、1.5至2.5μl或1.7至2.3 μl所述ltr溶液/μg所述rna。原则上，更窄的范围是优选的。最优选的比率(导致bmsc 的高度有效和有效率的转染)是ltr与rna的w/w比为每μg所述rna约8μg所述ltr，和/或ltr溶液与rna的v/w比为每μg所述rna约2μl所述ltr溶液。经过必要的修改，上面关于优选的ltr和/或rna所述的也适用于这里。
[0239]
进一步，这类特定的比率是mp与rna的铁w/w比的范围为0.05至5μg、0.05至3μg、 0.05至1μg、0.07至5μg、0.1至5μg、0.1至1μg、0.2至0.8μg、0.3至0.7μg或0.4至 0.6μg(铁重量)所述mp/μg所述rna。原则上，更窄的范围是优选的。最优选的比率是 mp与rna的铁w/w比为每μg所述rna约0.5μg所述mp。在上下文中，优选的mp是 so
‑
mag6
‑
115mp(或更优选的是mnp)。优选的rna是bmp
‑
7或更优选bmp
‑
2rna。
[0240]
进一步的这类特定的比率是mp与ltr的铁w/w比的范围为约0.05至5μg、0.05至 3μg、0.05至1μg、0.07至5μg、0.1至5μg、0.1至1μg、0.2至约0.8μg、0.3至0.7μg 或0.4至0.6μg(铁重量)的所述mp/约12至20μg(优选地约16μg)的所述ltr。同样地，特别是，如果将ltr制备成ltr溶液(例如在所附实施例中)，则这些比率是mp与ltr 溶液的铁w/v比的范围为0.05至5μg、0.05至3μg、0.05至1μg、0.07至5μg、0.1至5μg、 0.1至1μg、0.2至0.8μg、0.3至0.7μg或0.4至0.6μg(铁重量)的所述mp/4μl所述ltr 溶液。原则上，更窄的范围是优选的。最优选的比率是mp与ltr的铁w/w比为约0.5μg 所述mp/约12至20μg(优选地约16μg)的所述ltr，
获取相应的样品，并且可以检测活性化合物(bmp和/或合适的标志物)，并且可以在所述样品中例如通过hplc测定其相应的浓度。
[0247]
活性化合物浓度的测定可以在人患者、健康(人)个体以及动物如实验室动物、非人转基因动物(例如转基因小鼠，大鼠、猪等)中获得。设想，在例如骨中的活性化合物浓度的测定，可以例如在(健康)志愿者中推导出，并且可以建立(人)患者的相应施用方案。例如，可以通过本领域已知的标准方法来确定剂量依赖性(例如，施用的剂量对比在骨的各个区域中检测的浓度/剂量)。进一步方法包括但不限于体内标记肽的检测(例如通过相应的标记技术，如放射性标记，荧光标记等)或生理/生物化学测定。因此，可以推测为了获得在骨的某一部分中活性化合物的期望浓度而施用的活性化合物的剂量。推导这些浓度的这些和其它方法也是本领域已知的。
[0248]
具体地，技术人员可以容易地测定根据本发明转染的rna的合适剂量(例如每个细胞的μg rna)。在例如kormann(同上)、mays(同上)、wo 02/00870和所附实施例中提供了各自的指导。
[0249]
在每种情况中使用的剂量可以取决于bmp rna必须满足的功能。如上所述，也可以故意调整rna的作用持续时间。治疗的剂量和/或持续时间也可以取决于具体的适应症。例如，如果将rna用于由于缺陷的bmp基因造成的骨疾病的慢性治疗，则作用的持续时间将尽可能长，而对于其它适应症，可以有意地调整到合适的时间窗。各自的剂量可以被相应地设定。
[0250]
然而，如上所述，在本发明的上下文中发现特定的剂量是非常有用的，特别是因为它们导致高度有效和/或有效率的转染。
[0251]
待转染的rna的这种特定剂量的范围为每个细胞(待转染的)0.5
‑
100pg、0.5
‑
70pg、 0.5
‑
40pg、5
‑
100pg、10
‑
100pg、1
‑
50pg、5
‑
40pg、10
‑
30或15至25pg rna。原则上，较窄的范围是优选的。最优选的剂量是每个细胞(待转染的)约20pg rna的剂量。如果要将rna离体或体外递送(到细胞或组织)，则上述(范围的)剂量是特别有用的。
[0252]
一方面，本发明的药物组合物包含基质或支架；其在本文其它部分和本领域中也被称为“载体”。根据该方面具体设想，待使用的rna已经被添加到载体或已经被加载到载体内/上。更具体地，设想本发明的药物组合物包含载体和本文所述的复合物的组合，所述复合物含有待采用的rna，并且其同样可以加入到载体或已被加载到其内/上。换句话说，设想将rna以该复合物的形式加载到载体内/上或已经加入到载体。经过适当的修改，本文其它地方关于复合物和rna所述的也适用于这里。
[0253]
在本发明的上下文中，载体是可以在体内、离体或在体外与待转化/转染的细胞或组织接触的物体或物质。设想载体携带根据本发明使用的rna，并且任选地接种待转化/转染的细胞。具体设想，因此rna包含在如本文所述的复合物中。根据本发明使用的载体是本领域已知的，并且例如在wo 01/00708和[10
‑
12]中描述。除了rna之外，也可以将化合物如小分子和/或细胞因子加载到载体内/上。例如，这可以增强待接种的细胞的迁移(进入载体)和/或提高转染功效。
[0254]
载体可以是以连贯方式连接的材料，即固体物质，特别优选是塑料或可变形固体物质，如凝胶、海绵、箔、粉末、颗粒或绷带(fascia)。载体可以由生物不可吸收，或优选地生物可再吸收材料组成。
[0255]
载体也可以是通过交联根据本发明的(共)聚合物——优选在rna的存在下——产生的载体。因此，例如，存在这样的可能性：在根据本发明的交联聚合物中引入未化学修饰或化学修饰的已知基因载体(裸)rna、阳性脂质体、复合体(polyplex)等。为此目的，通过在水性溶剂或有机溶剂中加入引发交联的试剂，在基因载体、寡核苷酸等的存在下进行例如原位交联。交联剂的性质取决于共聚物的结构。因此，例如聚合物主链(例如，如wo01/00708的图2中所示的)可以通过加入二硫醇例如半胱氨酰
‑
半胱氨酸(cyteinyl
‑
cysteine) 或非氨基酸类二硫醇进行交联。包含羧酸的(共)聚合物的交联可以通过在羧酸活化期间添加任何二胺进行(例如羧酸与活化的酯原位反应)(nathan等，macromolecules 25(1992), 4476
‑
4484)。具有伯胺或仲胺的聚合物主链可以例如通过加入活化的二羧酸来进行。交联后，可以将制品干燥直到形成膜。
[0256]
生物不可吸收材料的实例是硅(例如用于导管)。然而，也能够使用不同的生物不可吸收材料，其可以作为植入物引入体内和/或已经被使用，例如在整形外科中。其实例是ptfe (例如用于血管置换)、聚氨酯(例如用于导管)、金属材料(例如用于内用假体(endoprostheses) 的药用钢、钛合金；用作血管支撑(支架)的金属网)。
[0257]
优选地，载体是生物可再吸收材料。其实例是纤维蛋白胶或纤维蛋白凝块(例如由凝血酶或纤维蛋白原产生的)、几丁质、氧化纤维素、明胶、聚乙二醇碳酸酯、脂肪族聚酯——例如聚乳酸、聚乙醇酸——和由其衍生的氨基酸化合物，例如聚酰胺和聚氨酯或聚醚和相应的混合聚合产物。此外，任何其它生物可降解聚合物可以用作载体，特别是基于水凝胶的所谓的自固化粘合剂。特别地，可以在体内和/或通过水解过程酶促降解的任何材料都适合作为生物可再吸收材料。其实例也是生物可再吸收的化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚酐、由纯化蛋白质或部分纯化的细胞外基质制成的载体。载体胶原是特别优选的，特别优选地，由软骨和皮肤胶原产生的胶原基质，例如由sigma或collagencorporation发售的。例如，在美国专利4,394,370和4,975,527中描述了生产胶原基质的实例。载体可以是纤维蛋白，特别是纤维蛋白凝块。
[0258]
载体非常优选来自胶原，并且特别优选为胶原海绵。胶原海绵是本领域已知的(例如 wo 01/00708和lee,biomaterials 32,2011,744
‑
752；meinel,biomaterials 27,2006, 4993
‑
5002；kempen,biomaterials 30,2009,2816
‑
2825)，并且可以例如作为“kollagenresorb
tm”自resorba(n
ü
renburg,germany)购买。
[0259]
通常，带负电荷的多糖例如葡糖胺聚糖经由离子相互作用与胶原结合。结合可以在胶原原纤维中的带正电荷的氨基酸(赖氨酸、羟赖氨酸和精氨酸)或甚至由二价阳离子如钙介导的带负电荷的氨基酸上发生。此外，胶原的离子结合性能可以有目的地被酸或碱溶液的预处理和随后的冷冻干燥所影响。通过胶原化学中已知的这些技术，可能使用根据本发明的rna的悬浮液(例如以本文所述的复合物)浸泡胶原材料，以在分别根据本发明采用的作为载体材料的胶原与rna和rna复合物之间产生离子结合。
[0260]
在胶原中，带正电荷的氨基酸不会集中在短的阳离子部分中。然而，载体的这种结构特征对于rna的有效结合是有益的。为了实现与载体材料的更紧密的结合，可以进一步用结合rna的阳离子物质例如肽(plank等，human gene therapy 10(1999),319
‑
333)或聚亚乙基亚胺(pei)衍生化。为此目的，胶原海绵被改性，例如用双官能偶联剂琥珀酰亚胺基
ꢀ‑
吡啶基
‑
二硫代丙酸酯(spdp)。聚亚乙基亚胺利用亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)衍生
化，其导致引入硫醇基团。待偶联的阳离子肽在c
‑
末端携带半胱氨酸。硫醇基团通过形成二硫键与spdp衍生化的胶原海绵反应。以这种方式获得的海绵衍生物应紧密结合rna，预期 rna的释放以期望的长时间延迟发生。
[0261]
为了生产加载根据本发明使用的rna的基质/支架，即载体，例如，可以将干(胶原) 材料与rna/(聚合物)复合物一起孵育，例如在约5％，优选地约2％的葡萄糖的冻干保护剂溶液中。然后可以将加载的载体例如海绵冷冻干燥和/或真空干燥。
[0262]
通常，根据本发明的rna
‑
加载的载体可以通过使相应的载体与rna——特别是包含在本文所述的复合物中的——接触产生，使得载体吸收rna或各自的复合物，或以这样的方式与其结合：其可以再次释放，优选地以延迟的方式释放。相应的方法是本领域技术人员已知的(bonadio等(1999),nat.med.5(7):753
‑
759；shea,l.d等(1999),nat. biotechnol.17(6):551
‑
554)。例如，本文描述了生产作为载体的胶原海绵或纤维蛋白凝块和rna/ltr复合物的组合。
[0263]
原则上，根据本发明采用的rna可以通过任何合适的递送/施用的途径或方式递送/ 施用。
[0264]
根据本发明采用的rna可以以本身已知的方式施用于需要由rna编码的蛋白质或蛋白质片段的患者，例如因为他们患有由于缺陷基因而造成的疾病。为此，rna可以配制成具有常见的药学上可接受的添加剂的药物制剂。制剂的形式取决于施用的位置和性质。因为在一个方面，根据本发明采用的rna的特征在于特别高的稳定性，其可以以许多方式配制，这取决于其使用的位置和形式。例如，rna可以被冷冻干燥，以此形式加工，例如粉碎或研磨并储存，然后可以在需要时重构并保留其生物学活性。
[0265]
一方面，本发明的药物组合物(或其中包含的rna)将经由基因疗法递送/施用或准备用于基因疗法。特别地，基因疗法被设想为转录物疗法，更具体地，转录物补充疗法。
[0266]
例如当将rna(例如以复合物的形式)加载到载体上时，可以体内或离体递送/施用 rna。适合的递送/施用途径或模式是本领域已知的，并且例如在mitragotri(nat rev drugdiscov 13(9)(2014),55
‑
72)、tavernier g(同上)和yin(nat rev genet 15(8)(2014),541
‑
55) 中描述。例如，rna例如当其(例如以复合物的形式)加载到载体上时，可以体外、体内和离体地转移入细胞，优选地转移入高等真核生物的细胞，优选地脊椎动物特别是哺乳动物的细胞。根据本发明已经证明，所提供的手段和方法在体内和离体递送/施用方法的上下文中是特别有用的。
[0267]
在一个方面，可以在体内递送/施用rna。根据该方面，可以准备rna(或包含它的药物组合物)用于体内递送/施用，和/或rna将在体内递送/施用。
[0268]
关于体内应用，例如以下是可能的：例如当将rna加载到载体(例如以复合物的形式) 上时，rna直接作为植入物——例如以海绵或凝块的形式——引入，或作为涂层例如在关节置换术上引入或作为内用假体引入(例如用于改善组织整合)。此外，加工涂层材料以粉末的形式是可能的，其借助常见的组织胶系统(例如纤维蛋白胶)被有目的地引入和固定在生物体中，并且以贮库(转染)的形式变得有效。
[0269]
具体地，设想将rna递送/施用入患者的组织或与其紧邻，特别是期望诱导骨生长、骨再生、骨形成、骨生成、骨化等的组织。这类组织可以例如是骨组织本身。因此，rna 可以被直接递送/施用入患者的骨或骨组织。例如，可以将rna直接施加入骨缺损或紧邻骨缺损。
该组织也可以是其它组织，例如肌肉组织。在这种情况下，异位骨形成可以例如由rna诱导。为了这些目的，以及体内递送/施用的其它目的，可以将例如本文所述的复合物形式的rna加入或加载入基质或支架，即如上文所述的载体(例如胶原/胶原海绵、纤维蛋白/纤维蛋白凝块、钛膜、肝素
‑
壳聚糖基质、羟基磷灰石)。具体设想，这在植入之前发生。然而，rna也可以在没有基质或支架的情况下递送/施用。原则上，(直接)施加rna 以治疗(预防或治愈)骨疾病(例如骨缺损或骨折)可以遵循与对于(直接)施用重组蛋白例如重组hbmp
‑
2和重组hbmp
‑
7所描述的相同的程序(参见例如katanec,coll antropol 38(1) (2014),325
‑
30；cicci
ù
,open dent j 6(2012),51
‑
5；docherty skogh,plast reconstr surg 123(6) (2009),192e
‑
3e；baltzer,orthop rev(pavia)4(1)(2012),e4；heliotis m,int j oral maxillofacsurg 35(3)(2006),265
‑
9；van den bergh jp,j clin periodontol 27(9)(2000),627
‑
36)。rna也可以添加到骨水泥或骨填充材料。在这种情况下，可以生产糊状产品。这可以被进一步应用于骨缺损。原则上，rna也可以直接注入骨，例如在不具有基质或支架的情况下。然而，具有基质或支架的情况下直接注入在原则上也是可能的。
[0270]
另一方面，可以离体递送/施用rna。根据该方面，可以准备rna(或包含它的药物组合物)用于离体递送/施用，和/或将要被离体递送/施用。例如，可以离体递送/施用rna 进入将被引入患者的细胞(例如骨细胞)，即细胞可以以转染(基因修饰)形式被引入患者。在一个具体实施方式中，离体递送/施用rna进入患者的细胞(例如骨细胞)并且将已经递送/ 施用所述rna的所述细胞重新引入所述患者，即同一患者，即细胞可以以转染(基因修饰) 形式被重新引入所述患者。因此，一个优选的实施方式是细胞正好源自待治疗的患者。
[0271]
待(再次)引入患者的细胞可以是适合于此目的的任何细胞。细胞例如可以是骨祖细胞。它们可以是间充质干细胞(msc)，例如肌肉来源的间充质干细胞(mmsc)，或优选地脂肪来源的间充质干细胞(amsc)或骨髓来源的msc(bmsc)。
[0272]
在离体递送/施用的更具体的实施方式中，rna(或包含其的药物组合物)可以准备用于经由自体组织移植物的递送/施用，和/或将要经由自体组织移植物递送/施用。具体设想，根据本文所述的手段和方法，将自体组织移植物，特别是包含在其中的细胞转染，并因此进行基因修饰，即，作为离体递送/施用根据本发明的rna(或包含它的药物组合物)的结果表达一种或多种本文描述的bmp。更具体地，设想，自体组织移植物，特别是其中包含的细胞根据本发明——即通过一种或多种本文描述的bmp rna和各自的转染手段和方法——转染或将要转染。经过必要的修改，本文其它地方关于这些手段和方法所述的也适用于这里。
[0273]
根据本发明采用的自体组织移植物可以包含祖细胞。具体设想包含骨祖细胞。自体组织移植物可以包括肌肉细胞或脂肪细胞(如amsc)。自体组织移植物可以包括骨骼细胞，例如成骨细胞、破骨细胞和/或骨细胞。在具体方面，自体组织移植物是骨组织髓(bone
‑
tissuepulp)或包含骨组织髓。骨组织髓可以包含任何本文定义的(骨)细胞，特别是任何将被或已经根据本发明转染，即将要或已经根据本发明基因修饰以表达bmp的本文定义的(骨)细胞。
[0274]
原则上，用于离体递送/转染bmp rna的适合的手段和方法是本领域已知的，并且从所附实施例也是显而易见的。然而，在本发明的一个具体实施方式的上下文中，设想bmprna将在opti
‑
mem培养基(gibco
tm
,invitrogen,ca,usa)中递送/转染。如上所述，利用这种递送/转染培养基已经实现了极好的递送/转染效率。
[0275]
同样为了离体递送/施用的目的，可以将例如复合物形式的rna加入或加载到基质或支架——即如上文所述的载体(例如胶原/胶原海绵、纤维蛋白/纤维蛋白凝块、钛膜、肝素
‑ꢀ
壳聚糖基质、羟基磷灰石)——内/上。
[0276]
在本文中，具体设想载体/载体主体在第一步中预先加载rna或优选地rna复合物，任选地干燥(例如真空和/或冷冻干燥)，和作为第二步，接种待递送/施用(如转染)rna的细胞。
[0277]
为了干燥目的，可以以合适的浓度(例如约1％至约6％，优选地约2％至约5％，或特别是约5％，约3％，或最优选地约2％的浓度)向rna/rna复合物加入冻干保护剂(例如蔗糖)。
[0278]
可以监测rna
‑
加载的载体上的转染效力和/或细胞存活(例如，如所附实施例中所述的)。可以分选出在这方面性能较差的载体。
[0279]
rna
‑
加载的载体，特别是如果它展现良好的性能，可以施用给患者。原则上，在本文公开的离体目的的上下文中已经用rna转染的细胞可以以与本文上面关于体内目的描述的相同方式递送/施用，优选地与rna已经加载至其内/上的基质/支架一起递送/施用。例如，其可以被施用入患者的组织或者非常接近患者的组织，特别是期望诱导骨生长、骨再生、骨形成、骨生成、骨化等的组织。此外，这种组织可以是骨组织本身，也可以是其它组织如肌肉组织。在一个具体方面，其可以直接放置/植入骨缺损处或在骨缺损旁的位置。
[0280]
上述的rna
‑
加载的载体以及其递送/施用和生产的手段和方法在自体组织移植中特别有用，特别是在本文所述的自体组织移植中。经过必要的修改，就这一点在本文其它地方所述的也适用于这里。特别地，载体可以接种各自的祖细胞例如骨祖细胞，或骨骼细胞例如成骨细胞、破骨细胞和/或骨细胞(osteocyte)，msc如mmsc或amsc等。
[0281]
如本文所述的rna
‑
加载的载体特别可用于持续和/或延迟的rna递送，例如分别作为用于rna递送——特别是持续和/或延迟的rna递送——的贮库，和作为(持续和/或延迟的)rna递送系统。原则上，这适用于体内、体外和离体递送/施用，但特别地，适用于本文所述的体内递送/施用目的。
[0282]
持续/延迟递送的含义是本领域已知的，并且在本发明的上下文中分别应用。例如，持续/延迟的rna递送可以是rna递送，特别是在至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月的时期内递送药物活性量的rna。原则上，较长的时期是优选的。
[0283]
技术人员能够容易地产生根据本发明适合的rna
‑
加载的载体/载体主体。为此目的，技术人员可以依赖本领域已知的各自的手段和方法(chevally,medical and biologicalengineering and computing 38,2000,211
‑
218)以及在本文和所附实例中描述的手段和方法。例如，本领域技术人员可以应用上述方法步骤。例如，当rna
‑
加载的载体将被产生用于本文所描述的体内递送/施用的目的时，可以省略细胞接种步骤(以及可能与其相关的步骤)。本发明还涉及用于生产rna
‑
加载的载体的各自的手段和方法。
[0284]
例如，根据本发明的rna或在载体/载体主体上加载的rna的量可以在每个载体/载体主体约0.1μg至约10μg，优选地约0.5μg至约8μg，优选地约1μg至约6μg，优选地约1.5μg至约5μg，以及最优选地约2至约3.5μg的范围内。接种到载体/载体主体内/上的细胞的量可以例如为每个载体/载体主体约5,000至约50,000，优选地约7,500至约 40,000，优选地约10,
000至约30,000。具体的实例是每个载体主体约10,000、约20,000和约30,000。
[0285]
作为非限制性实例，上述值特别适用于如本发明上下文中举例说明的载体主体(即：直径为5至7mm，厚度为约1至2mm，体积粗略约为50mm3)。根据本发明采用的载体主体可以例如是直径约1mm至数厘米(例如约5cm直径)和厚度约2mm至2cm的盘，这取决于例如待治愈的骨碎片(bone fraction)的形式以及直径。这粗略估计体积为数mm3到cm3。原则上，载体主体的形状(例如盘)可以例如适应于骨碎片的形状，或者否则可以是适当的形状。例如，它可能是不规则的而不是圆形的。
[0286]
通常，载体主体(例如(胶原)海绵)可以适应于其具体用途。例如，其形状可以适应于待治疗的骨碎片、骨病变、骨腔(例如由骨碎片，由骨损伤，由(牙)囊肿等引起的)、骨损伤等。在一个方面，设想载体主体的形状适合骨碎片/骨腔。换句话说，载体主体可以具有与骨碎片/骨腔相同的形状。特别地，设想载体主体一旦植入骨的受伤部位(例如骨碎片/骨损伤) 或与其附近，载体主体与骨的剩余部分一起类似骨原来的形状。
[0287]
典型的载体主体可以是可挤压的(例如(胶原)海绵)。因此，与待治疗的骨碎片、骨腔等相比，载体主体的初始形状可以稍微扩大，但是可以被挤压入骨碎片、骨腔等，以在植入后类似骨的原始形状。
[0288]
对于这些方面，载体主体可以是例如胶原海绵或纤维蛋白凝块(例如如本文所述的)。技术人员/主治医师可以容易地改变例如待加载到某个载体主体内/上的rna和/或细胞的量的值。
[0289]
在进一步实施方式中，将rna在延迟释放聚合物——例如作为用于植入物涂层的载体——中提供。为此目的，rna可以原样使用或作为例如用涂层聚合物和/或聚合物复合物保护的rna使用。
[0290]
此外，植入物是施用rna的进一步选择。在各自的植入物的表面上，可以存在包含编码bmp(一种或多种)的rna的延迟释放聚合物的涂层，例如作为用于植入物向内生长的有益因子(一种或多种)。根据本发明，设想包含编码仅一种因子(bmp)的(m)rna的涂层和包含编码数种因子(bmp)的(m)rna的涂层二者。各种因子(bmp)也可以以使得它们以交错间隔释放的形式提供。
[0291]
表述“编码一种或多种因子(bmp)的rna”应被理解为意指以下两者：编码多于一种蛋白质——以单数形式或作为融合蛋白——的rna序列，和编码不同(bmp)蛋白质的不同 rna序列的混合物，其中每种rna序列编码一种蛋白质。
[0292]
根据本发明采用的(m)rna可以被有利地使用，以便促进植入的假体的向内生长。如果在待插入的假体——例如牙植入物、髋关节内用假体、膝盖内用假体或椎体融合体——的表面上可用，则根据本发明采用的(m)rna可以释放bmp(一种或多种)，其可以促进新插入的假体所需的向内生长和其它功能。因此，例如，植入假体的背景下或其后，可以根据本发明施加施用生物活性物质如生长因子如bmp
‑
2或bmp
‑
7。在该实施方式中，根据本发明采用的编码bmp(一种或多种)的rna可以以释放rna的涂层形式(以可测量的方式)施加到植入物上，然后从其中逐渐释放(以可测量的方式)，例如使得植入物附近的细胞可以连续地或间歇地产生并且如果必要的话释放期望的因子。(m)rna的全身施用也是可能的。可能存在这样的情况：在不受基因缺陷影响的细胞中的(m)rna翻译是不期望，例如由于产生不期望的副作用。为了使(m)rna仅在需要编码的蛋白质的细胞中——例如在存在基因缺陷的
细胞中——选择性翻译，相应的载体可以由能够处理受影响组织的序列补充，例如经由配体。在进一步实施方式中，可将内源微rna结合的序列——其在靶细胞中不表达——加入含有该(m)rna的载体，使得(m)rna在含有相关的内源微rna的所有细胞中降解，而它们保留在靶细胞中。因此，可以使副作用最小化。
[0293]
当rna被全身施用时，其通常配制成具有常规添加剂例如调节张度的试剂和稳定剂的可注射液体，优选地作为单位剂型。作为稳定剂，使用通常已知的那些，例如脂质、聚合物和纳米系统或脂质体。在优选的实施方式中，提供适用于肠胃外施用的组合物。
[0294]
众所周知普通的载体通常是生物相容的——即药学上可接受的——合成的、天然的或混合的天然
‑
合成的聚合物，其释放特性可以被具体地调整，因此在此不再赘述。例如，使用聚丙交酯或聚丙交酯/乙交酯聚合物。以这种方式，例如，可能选择性地在更长或更短的时间内和在期望的位置处持续地、间歇地释放期望的因子。
[0295]
根据本发明采用的rna可以具体地提供高稳定性，其导致长期持续的蛋白质表达。例如，当rna意图用于治疗或预防由于基因缺陷引起的骨疾病时，其在细胞中保留越长，其可能越有价值。rna降解越快，蛋白质表达结束越快，而且在某些情况下，必须更频繁地施用rna。相反，使用长时间在细胞中保持稳定的rna，可以大大地降低给药频率。已经发现，根据本发明采用的rna(特别是cmrna)稳定表达长达4周。因此，必要时可以使用非常长效的rna。因此，可以持续长达4周的rna表达理想地适用于治疗慢性骨疾病。各自的rna只需很少次数的给予(例如每4周)甚至只给予一次。
[0296]
在该内容中，本文提供了用bmp rna的单次治疗足以对骨相关疾病、紊乱或损伤彻底和甚至完全的治疗(或预防)。因此，在具体实施方式中，制备本发明的药物组合物用于单次施用/治疗和/或将仅一次/作为单次治疗施用。根据该具体实施方式，不需要随后的第二次施用/治疗(或甚至进一步的后续施用/处理)。
[0297]
对于其它实施方式，例如当rna仅意图用于瞬时表达时，蛋白质表达的持续时间可以通过影响稳定性来调节。待采用的rna的进一步有价值的性质是可以经由稳定性选择性地调节作用持续时间，使得可以调整蛋白质表达的持续时间，使得其在期望的时间窗中发生(参见上文)。
[0298]
根据本发明采用的mrna的稳定性可以通过本身已知的方法测定。特别合适的是测定与不含该rna的细胞相比含有该rna的细胞的存活的方法。编码蛋白(bmp)随时间的产生也可以被监测。这里，rna的稳定性被理解为指当rna已经被引入细胞时，可以表达期望蛋白质或可翻译成该蛋白质或其功能片段的rna能够在较长时期内表达，不会立即降解并且不会被灭活。
[0299]
因此，用于测试在细胞中rna的稳定性和存活时间的方法在于确定由rna编码的蛋白质多久在细胞中可检测到或执行其功能。用于其的方法在实施例中描述。因此，例如，具有编码报告分子的序列的(m)rna可以任选地与编码期望蛋白质的rna一起引入细胞，并且在预定时间段之后，报告分子以及任选地编码蛋白质的存在然后可以被确定。合适的报告分子在现有技术中是众所周知的，并且这里也可以使用常用的报告分子。在优选的实施方式中，使用rfp——红色荧光蛋白——作为报告分子。
[0300]
将本发明的药物组合物施用于患者，优选施用于人患者/人。然而，也可以在非人动物对象/患者——例如宠物(例如狗、猫、兔、大鼠和小鼠)、家畜(例如奶牛、猪、绵羊)、马
或矮种马或鸟(例如小鸡、火鸡、鹦鹉)——中治疗或预防本文所描述的骨疾病(和相关病症)。
[0301]
本发明的任何药物组合物可以与说明书手册或单页说明书一起提供。说明手册/单页可以包括技术人员/主治医师如何根据本发明所述的治疗或预防疾病或紊乱(骨疾病)的指导。具体地，说明手册/单页可以分别包括分别关于本文所述的递送/施用模式和递送/施用方案的指导(例如递送/施用途径、剂量方案、递送/施用时间、递送/施用频率)。具体地，说明手册/单页可以包括准备药物组合物用于单次施用/治疗和/或将要仅一次/作为单次治疗施用的说明。说明手册/单页可以进一步包括不需要随后的第二次施用/治疗(或甚至进一步的后续施用/治疗)的说明。原则上，本文其它地方分别关于递送/施用模式和递送/施用方案所述的，例如关于离体或体内递送/施用，mp、ltr和/或rna的比率和剂量所述的，可以作为各自的说明被包括在说明手册/单页中。
[0302]
本发明进一步涉及本文所述和限定的bmp(cm)rna。经过必须的修改，在本文中其它地方关于bmp和rna所说的也适用于这里。
[0303]
本发明的(cm)bmp rna的一个非限制性但优选的实例是具有编码bmp(例如bmp
‑
2 或bmp
‑
7)或bmp的功能片段的序列的rna，其中所述rna的5至50％，7.5至30％， 15至25或优选地约25％的胞苷是化学修饰的胞苷(例如5
‑
甲基胞苷；m5c)和/或所述rna 的5至50％，7.5至30％，15至25或优选地约25％的尿苷是化学修饰的尿苷(例如2
‑
硫尿苷；s2u)。
[0304]
一方面，本发明涉及药物组合物，特别是本文所述的药物组合物，其包含bmp编码 rna，特别是上述bmp编码rna，优选地以本文所述的复合物的形式，更优选地，以本文所述的rna
‑
加载的载体的形式。
[0305]
本发明还涉及如本文所述和限定的复合物，即包含本文所述的(cm)rna或与其复合的复合物。特别地，本发明涉及如本文所述和限定的转染复合物(例如脂转染、磁转染和磁性脂转染复合物)。原则上，经过必要的修改，本文其它地方关于bmp、rna、ltr、mp以及复合物的其它必需物所述的也适用于这里。
[0306]
本发明的复合物的一个非限制性但优选的实例是包括具有编码bmp(例如bmp
‑
2或 bmp
‑
7)或bmp的功能片段的序列或与其复合的rna，其中所述rna的5至50％，7.5 至30％，15至25或优选地约25％的胞苷是化学修饰的胞苷(例如5
‑
甲基胞苷；m5c)和/或所述rna的5至50％，7.5至30％，15至25或优选地约25％的尿苷是化学修饰的尿苷(例如2
‑
硫尿苷；s2u)。更具体地，这类复合物可以包含本文中描述和限定的一种或多种ltr (例如lipofectamine 2000、dogtor、dreamfect
tm
或优选地df
‑
gold
tm
或c12
‑
(2
‑3‑
2))和/或 mp(例如核
‑
壳mp、氧化铁二氧化硅mp和/或(支链的)pei装饰的mp，如具有siox/膦酸盐
‑
pei涂层的mp(例如so
‑
mag6
‑
115mp))。甚至更具体地，mp、ltr和/或rna可以以如上所述的各自的比率包含在这种复合物(或本发明的其它复合物中)。具体地，这些比率可以是：
[0307]
ltr与rna的w/w比为每μg所述rna约8μg或约20μg所述ltr，
[0308]
ltr溶液与rna的v/w比为每μg所述rna约2μl或约5μl所述ltr溶液，
[0309]
mp与rna的铁w/w比为每μg所述rna约0.5μg所述mp，
[0310]
mp与ltr的铁w/w比为每约12至20μg(优选地约16μg)所述ltr约0.5μg所述 mp，
[0311]
mp与ltr溶液的铁w/v比为每4μl所述ltr溶液约0.5μg所述mp，
[0312]
如本文其它地方所述的铁w/w/w比，例如铁w/v/w比为约0.5μg所述mp∶约12至 20μ
g(优选地约16μg)所述ltr∶约1μg所述rna，和/或
[0313]
如本文其它地方所述的铁w/v/w比，例如铁w/v/w比为约0.5μg所述mp∶约4μl所述ltr溶液∶约1μg所述rna。
[0314]
这样的复合物(或本发明的其它复合物)还可以包含一种或多种进一步脂质(例如“辅助脂质(一种或多种)”)。经过必要的修改，上文关于进一步脂质(一种或多种)(例如“辅助脂质(一种或多种)”)所述的也适用于这里。
[0315]
同样地，上述rna或复合物旨在根据本发明的手段和方法使用。在该情况中，rna 或复合物旨在包含在本发明的药物组合物中。本发明还涉及包含bmp(cm)rna或本文所述和限定的复合物的药物组合物。
[0316]
可以根据本领域已知的手段和方法以及根据本文和所附实施例中描述的手段和方法容易地制备bmp rna和各自的复合物。例如，bmp rna可以通过体外转录系统制备，并且因此可以是体外转录的bmp rna(ivt bmp rna)。在该情况中，例如根据本发明采用的bmp rna从atp、ctp、gtp和utp的混合物通过转录体外产生的方法是合适的。执行该体外转录所需的材料是本领域技术人员已知的，并且是可商购的，特别是缓冲液、酶和核苷酸混合物。用于生产根据本发明采用的rna的dna的性质也不是关键的。通常，其可以是克隆的dna。
[0317]
在另一方面，本发明涉及本文所述的基质或支架/载体/载体主体，即涉及加载有根据本发明采用的rna的基质/支架/载体/载体主体，例如以本文所述的复合物的形式，并且如本文所述的，任选地进一步接种细胞。
[0318]
在另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含本文限定的rna
‑
加载的基质/支架/ 载体/载体主体。
[0319]
本发明还涉及本文描述的rna
‑
加载的载体作为即用型生物产品，特别是用于骨再生和/或本文所述的骨疾病。
[0320]
本发明进一步涉及配制分别用于持续和/或延迟递送以及作为持续递送系统/贮库的基质/支架/载体/载体主体、药物组合物或生物制品的用途。
[0321]
通过参考下列非限制性附图和实施例进一步描述本发明。
[0322]
附图如下：
[0323]
图1使用天然琼脂糖凝胶电泳测定修饰的mrna的完整性和大小。将cmrna和高范围riboruler rna比对物(ladder)与含有加样染料的riboruler甲酰胺混合，并在70℃下孵育10分钟。随后，将样品在冰上冷却并施加到琼脂糖凝胶。通过溴化乙锭染色和在intas 凝胶成像系统上可视化进行检测。
[0324]
图2(a)在使用lipofectamine2000(lf)、dogtor、df
‑
gold或bpei作为增强剂形成的 metluc cmrna复合物——在20pg/细胞的cmrna剂量下——转染的amsc中的长腹水蚤萤光素酶表达的动力学和(b)转染后5和24小时细胞的存活。未转染对照(100％细胞存活)和转染细胞之间的显著差异用(*)指示。(c)在均编码metluc的pdna或cmrna的 df
‑
gold阳性脂质体转染后，amsc中报告基因表达的时间曲线的比较。“pdna”和“cmrna”曲线下的面积，auc
pdna
和auc
cmrdna
，通过对在0到120小时的时间点之间的数据进行积分来计算。pdna和cmrna数据之间的显著差异用(*)指示。
[0325]
图3用df
‑
gold/cmrna阳性脂质体和df
‑
gold/so
‑
mag6
‑
115/cmrna磁性三联体转染后，在amsc和bmsc中tomato、egfp和metluc报告基因的表达。所施加的cmrna 剂量为20pg/
细胞。用以下复合物：(a)tomato n1 cmrna和(b)egfp cmrna转染后24 小时，拍摄细胞的荧光显微镜图像。比例尺表示250μm。(c)用egfp cmrna复合物转染后24小时，表达egfp的细胞百分比的facs结果。未转染和脂转染(*)或磁转染细胞(**) 之间以及脂转染和磁转染之间的显著差异如图所指示。(d)示出用metluc cmrna复合物转染的两种细胞类型的长腹水蚤萤光素酶表达的时间过程。amsc和bmsc的磁转染和脂转染之间的显著差异分别由(*)和(**)指示。为了计算mai，对于bmsc和amsc二者，将“磁转染”曲线下的面积auc
mf
归一化为“脂转染”曲线下的面积auc
lf
。
[0326]
图4在df
‑
gold/cmrna阳性脂质体和df
‑
gold/so
‑
mag6
‑
115/cmrna磁性三联体转染后的不同时间点，在amsc中产生hbmp
‑
2。将所产生的hbmp
‑
2归一化为施加的hbmp
‑
2 cmrna剂量(20pg/细胞)。(a)转染时使用的培养基(成骨培养基对比opti
‑
mem)对上清液中测量的分泌的hbmp
‑
2的含量的影响；(*)指示比较组之间的显著差异。(b)转染后第1、 2和3天在上清液(分泌的hbmp
‑
2)和在细胞溶胞产物(细胞内hbmp
‑
2)中测量的内源性 hbmp
‑
2(cmrna(
‑
))和由转染细胞产生的hbmp
‑
2(cmrna( ))的含量。(*)表明未处理细胞和转染细胞之间分泌的hbmp
‑
2的显著差异。(**)表明在给定的观察时间处，转染细胞分泌的hbmp
‑
2和细胞内hbmp
‑
2之间的显著差异。(#)表明脂转染和磁转染之间分泌的 hbmp
‑
2的显著差异。(c)转染细胞中总的(分泌的 细胞内)hbmp
‑
2含量的时间过程。为了计算mai＝6.0，在减去显示内源性hbmp
‑
2的水平的“未处理细胞”曲线下的面积auc
ref
之后，将“磁转染”曲线下的面积auc
mf
归一化为“脂转染”曲线下的面积auc
lf
。
[0327]
图5用df
‑
gold/cmrna阳性脂质体转染的细胞的碱性磷酸酶(alp)活性。(a)转染后 12天的alp染色。(b)转染后3、7和12天的alp活性。(*)表明未转染细胞和转染细胞之间的显著差异和(**)表明转染后3和12天之间的显著差异。在施加的20pg/细胞的 cmrna剂量下，用hbmp
‑
2cmrna复合物脂转染和磁转染amsc后，骨相关基因的表达增加。转染后3、7、14和21天时，(c)runx2、(d)osx、(e)alp、(f)coll i、(g)opn 和(h)ocn的表达成倍增加。灰色条代表df
‑
gold/cmrna复合物的脂转染，而虚线条象征so
‑
mag6
‑
115/df
‑
gold/cmrna三联体的磁转染。(*)表明对于同一观察时间，脂转染和磁转染组之间的显著差异。(**)表明当比较转染后的不同时间脂转染和磁转染组时的显著差异。
[0328]
图6脂转染和磁转染后amsc的矿化。转染后21天茜素红染色：(a)未转染的细胞， (b)磁转染后的细胞和(c)脂转染后的细胞。(d)转染后14和21天茜素红染色的量化。未转染细胞和转染细胞之间的显著差异由(*)指示，并且指示在不同转染细胞之间的比较。
[0329]
图7在为4的增强剂与cmrna的v/w的比率和5μg hbmp
‑2‑
或tomato n1
‑
cmrna/ 盘的剂量下，用df
‑
gold/cmrna阳性脂质体转染3mm脂肪盘。(a)用tomato n1 cmrna 复合物转染后24小时拍摄脂肪盘的荧光显微镜图像。比例尺表示500μm。用 df
‑
gold/hbmp
‑
2cmrna复合物脂转染脂肪盘后诱导骨相关基因表达。(b)hbmp
‑
2、(c) runx2、(d)alp和(e)coll i的表达成倍增加。提取总rna，并且在转染后3和7天进行 rt
‑
pcr。表达被报告为与未转染的对照相比的加倍诱导(fold induction)。所有值被归一化为β
‑
微管蛋白。(*)表明对于alp和coll i表达，在转染后3和7天之间的显著差异。
[0330]
图8在用df
‑
gold/cmrna阳性脂质体和df
‑
gold/so
‑
mag6
‑
115/cmrna磁性三联体转染后的不同时间点，amsc中产生的hbmp
‑
7。将所产生的hbmp
‑
7归一化为施加的 hbmp
‑
7cmrna剂量(20和32pg/细胞)。
[0331]
图9用df
‑
gold/hbmp
‑
7cmrna阳性脂质体脂转染后的amsc和用 so
‑
mag6
‑
115/df
‑
gold/hbmp
‑
7cmrna三联体的磁转染后的amsc的矿化。所用cmrna 的剂量为20和32pg/细胞。转染后21天茜素红染色：(a)未转染的细胞，(b
‑
c)脂转染后的细胞，和(c
‑
d)磁转染后的细胞。
[0332]
图10用df
‑
gold/metluc mrna阳性脂质体转染amsc后不同时间点的metluc表达。在施加的2.5、5、10和20pg/细胞的mrna剂量下，测试的df
‑
gold比mrna的v/w 比在0.5至5μl的df
‑
gold比μg mrna的范围内。
[0333]
图11用df
‑
gold/metluc mrna阳性脂质体转染bmsc后不同时间点的metluc表达。在施加的2.5、5、10和20pg/细胞的mrna剂量下，测试的df
‑
gold比mrna的v/w比在0.5至5μl的df
‑
gold比μg mrna的范围内。
[0334]
图12用为4的df
‑
gold比mrna的v/w比下的df
‑
gold/egfp mrna阳性脂质体(脂转染)和为0.5的fe比mrna的w/w比下的df
‑
gold/so
‑
mag6
‑
115/egfp mrna磁性三联体(磁转染)转染后24小时，(a)amsc和(b)bmsc的流式细胞术直方图。
[0335]
图13 bmp
‑
2rna接枝到骨植入材料上——μ
‑
ct结果——整个骨。在治疗2周后，对所有组获得的μct 3d重建和纵向截面。(a)纤维蛋白，(b)c12
‑
(2
‑3‑
2)/fflcmrna，和(c) c12
‑
(2
‑3‑
2)/hbmp
‑
2cmrna。通过对所有样品在imagej软件中设置相同的阈值 (2500
‑
4500)，突出显示愈伤组织形成的区域。(d)由imagej量化的愈伤组织形成的量。
[0336]
图14胶原海绵上的复合物加载和细胞接种。(a)未加载和加载了luc snim rna阳性脂质体的真空干燥的胶原海绵的扫描电子显微镜检查(阳性脂质体的平均流体动力学直径： 65.8nm)。(b)在加载有tdtomato mrna的胶原海绵上接种后30小时，nih3t3细胞的荧光显微镜检查，其中10％tdtomato mrna为fitc标记的。(c)在胶原海绵上接种后7天， nih3t3细胞的苏木精染色。用苏木精将细胞核染成深蓝色。比例尺显示100μm。上图的左边缘代表胶原海绵的表面。
[0337]
图15在加载有egfp mrna
‑
复合物的胶原海绵上接种nih3t3细胞后48小时的转染功效和细胞存活。(a)4
×
放大倍数的荧光显微镜检查(july
tm
)：nih3t3细胞中egfp mrna 的表达。(b)facs分析：与未转染的细胞相比，用100pg/细胞egfp mrna转染的nih3t3 细胞中平均荧光强度的明显移位。(c)facs分析：mrna剂量与转染效率的相关性。(d) 和(e)pi染色和wst测定的facs分析分别表明60
‑
70％左右的细胞存活。所有数据显示为三次重复值的平均值
±
sd。
[0338]
图16使用nih3t3细胞的2d对3d培养中的长腹水蚤萤光素酶mrna的表达动力学。转染后每24h收集上清液，并且立即测量met luc的表达。所有数据显示为三次重复值的平均值
±
sd。y轴为对数刻度。
[0339]
图17使用不同细胞密度的msc，在胶原海绵中长腹水蚤萤光素酶表达的动力学。本实验中使用的mrna阳性脂质体的量为50pg/细胞。转染后每24h收集上清液，并保存在
ꢀ‑
20℃下。8天后，测量所有时间点的长腹水蚤萤光素酶的表达。数据显示为三次重复值的平均值
±
sd。y轴为对数刻度。
[0340]
图18体内骨再生的免疫组织化学分析。(a)矿化骨组织染色。红色矩形显示海绵放置在股骨缺损处的位置。黑色区域为高度矿化的。(b)骨膜区中愈伤组织形成。(c)纤维组织形成的比例。(d)类骨质形成的比例。使用t
‑
检验(n＝9)比较值。
[0341]
图19在hbmp2 mrna
‑
加载的胶原海绵上接种的msc的hbmp2表达。测试了三种不同的剂量。数据显示为三次重复值的平均值
±
sd。
[0342]
图20体外骨分化。rt
‑
qpcr结果：在hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵上接种细胞后 7天和14天，成骨细胞标志物的表达成倍增加。值是三次重复的平均值
±
sd。(a) mc3t3
‑
e1细胞：将值归一化为gapdh的表达。在3d中，数据表示为未转染细胞的倍数增加。(b)msc：将值归一化为β
‑
微管蛋白的表达。在2d中，数据表示为未转染细胞的倍数增加，并使用多次t
‑
检验进行比较。
[0343]
图21体内骨再生。(a)植入后2周的大鼠股骨的μ
‑
ct图像。红色部分代表新形成的骨。(b)用于评估植入后2周的骨形成面积的μ
‑
ct分析。使用t
‑
检验(n＝9)比较值。
[0344]
图22真空干燥的胶原海绵上的mrna阳性脂质体的稳定性。将metluc mrna
‑
加载的胶原海绵真空干燥2小时，然后真空密封并保持在室温下。在真空干燥后的不同时间点中，打开平板，并将nih3t3细胞接种在海绵上。细胞接种后24h，测量met luc的表达。所有数据显示为三次重复值的平均值
±
sd。y轴为对数刻度。
[0345]
图23来自真空干燥之前和之后的胶原海绵的sem照片。比例尺显示200μm。
[0346]
图24在胶原海绵上的nih3t3细胞中，用snim metluc或未修饰的metluc mrna转染之后的metluc表达的动力学。转染后每24h收集上清液，并保存在
‑
20℃下。10天后，测量所有时间点的长腹水蚤萤光素酶的表达。显示的数据是三次重复的平均值
±
sd。y 轴为对数刻度。
[0347]
图25海绵的真空干燥对胶原海绵上nih3t3细胞中metluc表达动力学的影响。转染后每24h收集上清液，并保存在
‑
20℃下。5天后，测量所有时间点的长腹水蚤萤光素酶的表达。显示的数据是三次重复的平均值
±
sd。y轴为对数刻度。
[0348]
图26 facs分析：研究从大鼠脂肪组织分离后的msc的阳性(cd90和cd29)和阴性(cd45、cd106和cd31)标志物。已经使用igm、k
‑
fitc、igg1、k
‑
fitc和igg1、k
‑
pe 作为对照。
[0349]
图27在分化期间，宏观变化是海绵的形态。在海绵上接种msc后7天，从96孔板拍摄照片。
[0350]
图28在骨的不同部分中，加载有hbmp2 cmrna阳性脂质体的胶原海绵的体内成骨作用。使用t
‑
检验比较值。
[0351]
图29μ
‑
ct：术后两周，用于体内骨再生的hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵的作用。黄色部分是新形成的骨。
[0352]
图30(a)在大鼠股骨髓质中加载有hbmp
‑
2编码cmrna的植入物，组织的矿化显著增加。(b)作为植入加载有hbmp
‑
2编码cmrna的胶原海绵的结果，骨膜(periostal)组织形成显著增加。(c)在用加载有hbmp
‑
2的cmrna的胶原海绵处理后，纤维组织/总体积 (fb.v/tv)显著增加。(d)用加载有编码hbmp
‑
2的cmrna的胶原海绵处理后，类骨质的形成/总体积(ov/tv)增加。(e)作为植入加载有编码hbmp
‑
2的cmrna的胶原海绵的结果，较少的骨吸收被反对。
[0353]
在本说明书中，引用了包括专利申请在内的许多文件。这些文件的公开内容虽然不被认为与本发明的专利性相关，但是也通过引用将其全部内容并入本文。更具体地，所有参考的文件通过引用并入，其程度如同将每个单独的文件具体并单独地指明通过引用并入。
[0354]
现在将通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的而不被解释为对本发明范围的限制。
实施例1
[0355]
材料与方法(尤其与实施例1至7相关)。
[0356]
材料。杜氏改良伊氏培养基(dmem)、不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)、胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素(p/s)和细胞消化液(accutase)溶液购自paa laboratories gmbh (pasching,austria)。opti
‑
mem培养基和ii型胶原酶获自gibco
tm
(invitrogen,ca,usa)。 ficoll
‑
paque
tm
购自ge healthcare ltd.(ct,usa)。原硅酸四乙酯(teos)、3
‑
(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯(thpmp)和支链聚亚乙基亚胺(bpei)获取自sigma
‑
aldrich(mo,usa)。其它试剂和材料均从sigma
‑
aldrich获得，除非另有说明。使用24孔磁性板(ozbiosciences, marseille,france)进行磁转染实验。
[0357]
动物。雌性sd大鼠(250
‑
300g)购自charles river laboratories(sulzfeld,germany)，并且用于脂肪和骨髓间充质干细胞分离。就在组织收集之前，动物被二氧化碳窒息安乐死。使用的程序由当地道德委员会批准，并根据德国动物保护法进行。
[0358]
大鼠来源的间充质干细胞的分离与培养。骨髓间充质干细胞(bmsc)用前述方案分离 (balmayor,biores open access 2(5),2013,346
‑
355)。简言之，从所有周围组织中清除股骨和胫骨，在两骨骺上切割，并在含有2.5mg/ml ii型胶原酶的无菌dmem中在37℃和5％co2下孵育2h。一旦用完全dmem(即补充10％fbs和1％p/s)将骨髓冲洗出来，则将细胞沉淀并重悬于新鲜的完全dmem中。随后，使用ficoll
‑
paque
tm
(500g，30min)通过密度梯度离心收集单核细胞级分，洗涤并重悬于完全dmem中。细胞以3000个细胞/cm2平板接种。培养24小时后，更换培养基以去除非贴壁细胞。
[0359]
为了分离脂肪间充质干细胞(amsc)，将从腹部区域收集的脂肪组织切割成小毫米尺寸的块并且转移到含有无菌dpbs的falcon管。在用dpbs进行数次洗涤步骤后，将脂肪块在37℃下在0.5mg/ml ii型胶原酶溶液中孵育30分钟。接下来，加入完全dmem培养基以停止胶原酶作用，并且将混合物以600g离心10分钟。将获得的细胞沉淀重新悬浮在完全dmem培养基中，并且通过40μm细胞过滤器(bd falcon,nj,usa)过滤，并以3000 个细胞/cm2平板接种。
[0360]
两种细胞类型bmsc和amsc均通过使用完全dmem在37℃和5％co2下扩增和培养。对于转染和分化实验，使用上至第6代的细胞。在培养期间，培养基每三天更换一次，细胞维持在37℃和5％co2下。通过按照balmayor(2013，同上)公布的所述方案进行分离的两种msc的表征。
[0361]
离体人脂肪组织培养。新鲜人皮下脂肪组织从正在进行整复外科的健康患者那里获得，由其出具了书面的患者知情同意书并由technical university of munich,germany的 university hospital“klinikum rechts der isar”的当地伦理委员会批准。
[0362]
在无菌条件下从皮肤和血管中解剖出人脂肪组织。随后，将组织小心地切成约1mm 厚的切片。接下来，按照evans(2009，同上)描述的方案，使用皮肤活检穿孔(3mm)冲出均匀的3mm
×
1mm圆形外植体。所得的组织外植体用无菌dpbs洗涤三次，并置于35mm 直径的培养皿中。随后，将它们在37℃和5％co2下在完全dmem中培养长达7天。首先在2小时后，然后每
培养24小时，进行培养基替换，以确保充分充氧的条件(puri,j lipidres 48(2),2007,465
‑
471)。
[0363]
氧化铁二氧化硅磁性纳米颗粒的合成。如前所述合成氧化铁二氧化硅核
‑
壳磁性纳米颗粒(mykhaylyk,liposomal magnetofection.in:weissig v(ed.)liposomes,methods inmolecular biology,vol.605.humana press
‑
springer,new york 2010,487
‑
525；mykhaylyk, pharm res 29(5),2012,1344
‑
1365)。首先，进行从铁盐的水溶液中沉淀出氢氧化 fe(ii)/fe(iii)，并转化成磁铁“核”纳米颗粒。随后，借助原硅酸四乙酯(teos)和3
‑
(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯(thpmp)的共缩合来稳定该纳米颗粒的表面，得到具有表面膦酸基团的氧化硅涂层。最后，以11.5％的pei比铁w/w比施加ph 7.0的25
‑
kd支链聚亚乙基亚胺水溶液，以装饰颗粒表面。得到的具有siox/膦酸盐
‑
pei涂层的磁性纳米颗粒将被进一步称为so
‑
mag6
‑
115 mnp或mnp。这些纳米颗粒的详细物理化学特性已经由 mykhaylyk(同上)报道。简言之，如使用malvern instruments zetasizer nano zs(herrenberg, germany)通过动态光散射(dls)所测定的，当悬浮在水中时，颗粒具有平均水合直径dh＝ 97
±
14(pdi＝0.32
±
0.03)和电动电位ζ＝ 34.1
±
2.7。
[0364]
生成编码metluc、egfp、tomato和人bmp
‑
2的化学修饰的信使rna。长腹水蚤萤光素酶(细长长腹水蚤)和人bmp
‑
2mrna的含有密码子优化的开放阅读框的质粒载体被合成并通过geneart(life technologies,ca,usa)克隆入pvaxa120的bamhi
‑
ecori位点。使用noti
‑
hindiii从pegfp
‑
n1(clontech,ca,usa)切断egfp并经由半平端连接(semi
‑
bluntligation)克隆入pvaxa120的ecori
‑
hindiii。tomato的编码序列从ptd tomato
‑
n1(clonetech, ca,usa)用noti
‑
kpni切断并经由半平端连接将其连接入pvaxa120的ecori
‑
kpni位点。先前已经描述了载体pvaxa120(kormann,nat biotechnol 29(2),2011,154
‑
157)，并且通过克隆pvax1(invitrogen,ca,usa)的psti
‑
noti位点之间的120a的一段来构建。
[0365]
为了生成用于体外转录(ivt)的模板，上述质粒dna(pdna)(即pvaxa120
‑
metluc、 pvaxa120
‑
egfp、pvaxa120
‑
tomato或pvaxa120
‑
hbmp
‑
2)用noti通过限制性酶切线性化。通过氯仿乙醇沉淀进一步纯化模板pdna。ivt利用ribomax
tm
大规模rna生产系统
‑
t7(promega,wi,usa)进行。为了合成加帽的mrna，使用抗反向帽类似物(arca, m
7,3
’‑
o gpppg,jena biosciences,jena,germany)确保仅在所需取向上并入帽。为了生成修饰的mrna，将25％的胞苷
‑5’‑
三磷酸和尿苷
‑5’‑
三磷酸用5
‑
甲基胞苷
‑5’‑
三磷酸和2
‑
硫尿苷
ꢀ‑5’‑
三磷酸(jena biosciences,jena,germany)代替。通过乙酸铵沉淀进行所得修饰的mrna 的纯化。通过天然琼脂糖凝胶电泳证实产生的修饰的mrna的完整性和大小。
[0366]
转染复合物的形成和表征。总是通过混合选择的脂质转染试剂，例如 lipofectamine2000(invitrogene,ca,usa)、dreamfect gold(df
‑
gold)和dogtor (ozbiosciences,marseille,france)或bpei与各自的cmrna新鲜制备阳性脂质体和复合体。根据制造商的说明书(即每μg mrna分别为2μl lipofectamine2000或4μl df
‑
gold或4μldogtor)选择使用的脂质体转染试剂对cmrna的体积重量比。在bpei的情况下，制备10 mg/ml水溶液，并在使用前将ph调节至7.0。通过在n/p＝8下混合bpei和cmrna溶液，然后在室温下孵育20分钟以允许复合物组装来形成复合物。为了制备磁性阳性脂质体，混合等体积的so
‑
mag6
‑
115 mnp水悬浮液(0.1μg fe/μl)和df
‑
gold稀释液(用水稀释80μldfgold至
100μl)。随后，加入等体积的cmrna稀释液(0.2μg/μl水或150mm nacl或未补充的opti
‑
mem)，仔细混合，并且将混合物在室温下保持20分钟。 so
‑
mag6
‑
115/df
‑
gold/cmrna复合物中组分的所得比率为0.5∶4∶1(铁重量/体积/重量)。使用dls方法(表1)表征复合物的平均流体动力学直径(dh)、多分散指数(pdi)和ζ电位(ζ) 方面的特征。
[0367]
amsc和bmsc中的转染方案。为了转染，将amsc和bmsc以1.25
×
104个细胞 /cm2接种在24孔板中。孵育24小时后，用新鲜的未补充的opti
‑
mem替换细胞培养基。如上所述制备100μl含有20pg/细胞cmrna(即metluc、egfp或tomato cmrna)的阳性脂质体或bpei
‑
复合物，并加入到细胞中。转染后5小时，用完全dmem替换培养基。将细胞在标准条件下进一步培养长达10天，直到结果评价。为了进一步提高转染功效，如上所述，so
‑
mag6
‑
115 mnp与脂质转染试剂和cmrna相关联成为磁性so
‑
mag6
‑
115颗粒/df
‑
gold/cmrna阳性脂质体，其中铁重量/体积/重量比为0.5∶4∶1。为了转染，将100 μl含有20pg cmrna/细胞(即metluc、egfp或tomato cmrna)的磁性阳性脂质体加入培养物中的amsc或bmsc，并通过将细胞培养板置于24孔磁性板之上30分钟施加磁场。接下来，除去磁性板，并且使转染继续。整个研究的所有转染都一式三份进行。为了定量表征磁转染对转染功效的影响，mai如下计算：
[0368][0369]
其中auc表示分别磁转染(mf)和脂转染(lf)后靶蛋白(metluc和hbmp
‑
2)表达的动力学曲线值下的面积。
[0370]
研究的目的之一是在转染效率方面比较amsc和bmsc。因此，根据制造商的说明书选择使用的体积重量比的脂质体转染试剂比mrna，来使对两种细胞类型均等。然而，对于两种细胞，使用0.5
‑
5μl转染试剂/μg核酸——在2.5、5、10和20pg/细胞的剂量下——的df
‑
gold比cmrna的比率，进一步进行转染方案的优化。参见图10至12以及各自的实例部分的细节。
[0371]
转染细胞中长腹水蚤萤光素酶活性的评价。长腹水蚤萤光素酶催化腔肠素(水母素吖嗪，coelenterazine)氧化产生水母素胺(coelenteramide)、co2和光(λ
max 480nm)。基于这一反应，腔肠素可用作检测许多分泌的荧光素酶的底物(inouye,protein expr purif 88(1),2013, 150
‑
156)。在该研究中，使用天然腔肠素(synchem ohg,felsberg,germany)测定metluc活性。简言之，将等体积的每50μl上清液(转染后第5小时、第1、2、3、5和7天从转染细胞收集)和腔肠素溶液(ph 7.0，50μm在脱气的磷酸钠缓冲液中)在白色不透明的96孔板中混合。使用perkinelmer wallac victor 1420多标签计数器(ma,usa)在室温下，以光单位/ 单位时间或相对光单位(rlu)测量发光强度。对所有样品一式三份测量。以使用以下等式计算的归一化的相对光单位表示metluc活性：
[0372][0373]
其中rlu是从设备获得的值，v1对应于收集进行测量的上清液的体积并且v2是以 ml为单位的总上清液体积。
[0374]
增强型绿色荧光蛋白(egfp)阳性细胞。为了以egfp阳性细胞的百分比来评价转染效率，通过流式细胞术分析具有egfp cmrna的转染细胞。为此，转染后24小时，将细胞用
dpbs洗涤两次，并且通过使用100μl细胞消化液/24孔板的每个孔来分离。随后，将细胞培养板以500g离心10分钟，并将细胞重新悬浮于dpbs(2％fbs)中。在macsquant 分析仪(miltenyi biotech,bergisch gladbach,germany)上进行流式细胞术分析，每个样品收集至少5,000次事件。
[0375]
增强型绿色荧光蛋白(egfp)和tomato表达细胞。在荧光显微镜(biorevo bz9000, keyence,osaka,japan)下，在转染后24小时，将用egfp和tomato cmrna转染的amsc 和bmsc成像。
[0376]
化学修饰的mrna的复合物的细胞毒性筛选。通过如下进行细胞毒性筛选：使用不同的metluc cmrna复合物转染amsc，然后根据制造商的说明书(celltiter 96,promega, wi,usa)使用一式三份进行的标准mts测定在转染后5和24小时分析细胞呼吸活性(存活)。对于实验细节，请参见本文的其它地方。
[0377]
通过转染细胞的bmp
‑
2产生。上述的脂转染和磁转染方案用于将hbmp
‑
2cmrna递送入amsc。使用20或32pg hbmp
‑
2cmrna/细胞进行转染。在限定的时间点，根据制造商的说明书，通过酶联免疫吸附测定(elisa,quantikine,r&d systems,mn,usa)，分别在上清液和细胞溶胞产物中测定分泌的和细胞相关的人bmp
‑
2的水平。在perkinelmerwallac victor 1420多标记计数器(ma,usa)中测量在450nm处的吸光度。波长校正设定在 570nm。实验一式三份进行，并且使用标准曲线(范围：0
‑
4000pg/ml hbmp
‑
2)测定蛋白质含量。
[0378]
此外，还在成骨培养基(即2％fbs、10mmβ
‑
甘油磷酸、200μm抗坏血酸)的存在下转染细胞。在没有地塞米松的情况下，制备成骨培养基。因此，在进一步的实验中，可以获得与细胞释放的hbmp
‑
2的成骨能力相关的相关信息。
[0379]
将hbmp
‑
2 cmrna转染入原代人组织。外植体转染按照先前由evans(2009，同上) 描述的方案进行，稍作修改。简言之，将洗涤后的人脂肪组织盘放入48孔板，并且利用5 μg hbmp
‑
2 cmrna或tomato cmrna——使用df
‑
gold阳性脂质体(4μl df
‑
gold/1μgcmrna)——转染。将含有复合物的80μl悬浮液直接注入组织盘。将平板返回培养箱1小时。然后，将500μl新鲜的未补充的opti
‑
mem加入到含有转染的外植体的每个孔中，并且继续孵育又5小时。然后将培养基改变为成骨培养基，并且将外植体如前所述进一步培养3天和7天。组织外植体的所有转染在新鲜收集的组织上且无菌条件下进行。
[0380]
在荧光显微镜(biorevo bz9000,keyence,osaka,japan)下，在转染后24小时，将用 tomato cmrna转染的脂肪组织盘成像。
[0381]
体外骨生成。在成骨刺激下培养hbmp
‑
2cmrna转染的amsc以评价hbmp
‑
2 cmrna诱导体外骨生成的能力。使用脂转染和磁转染两种方法将hbmp
‑
2cmrna转移入细胞，如前所述。转染后5小时，将培养基用不含地塞米松的成骨培养基交换。将转染的细胞在成骨培养基下保持长达21天，并且每3天部分地更换培养基(即用新鲜成骨培养基替换一半的体积)。在相同条件下培养的未转染细胞用作对照。体外骨生成后，评价骨相关基因的表达和矿化的发生。
[0382]
碱性磷酸酶(alp)活性。在转染后第3、7和12天评估碱性磷酸酶活性。为此目的，按照制造商的说明书使用碱性磷酸酶比色测定(abcam,cambridge,uk)。
[0383]
该测定基于磷酸对硝基苯酯(pnpp)作为磷酸酶底物的用途。pnpp在alp存在下脱磷酸化。结果，形成了黄色对硝基苯酚(pnp)化合物，其由405nm处的最大吸光度表征。基于
制造商的方案进行alp测定。简言之，将转染的细胞用dpbs洗涤两次，随后在室温下与测定缓冲液一起孵育20分钟。在细胞单层的良好均化之后，将样品离心以去除不溶物质。将pnpp溶液加入样品和对照样品，并且在室温下孵育60分钟并保护其免受光照。如上面已经描述的，通过使用多标记计数器测量405nm处的吸光度来确定pnp产生。基于标准曲线计算pnp含量值。在所有情况下，一式三份进行评价。
[0384]
此外，通过与固蓝b盐和萘酚as
‑
mx磷酸盐(cox，j histochem cytochem 47(11),1999, 1443
‑
1456)的染色混合物在37℃下一起孵育30分钟，在固定的细胞中染色alp。用dpbs 洗掉染色溶液，并且在显微镜下分析细胞。染色为紫色的区域被认为是阳性的。
[0385]
定量实时pcr。在hbmp
‑
2cmrna转染后3、7、14和21天，细胞用dpbs洗涤两次，随后用trizol(life technology,ca,usa)裂解。基于酚/氯仿法分离总rna。使用光度适应计和紫外分光光度计(eppendorf ag,hamburg,germany)分光光度法测定rna浓度和纯度。根据制造商的说明书，通过使用first strand cdnasynthesis kit(第一链cdna合成试剂盒)(thermo scientific,ma,usa)从总rna逆转录第一链cdna。借助实时定量逆转录聚合酶链反应(rt
‑
pcr)测定骨相关基因的表达。扩增引物在表2中列出。使用ssofast evagreen supermix(bio
‑
rad laboratories inc.,ca,usa)，并且在bio
‑
rad cfx96热循环仪 (bio
‑
rad laboratories inc.,ca,usa)上进行实时pcr。
[0386]
在转染的脂肪组织的情况下，转染后3和7天提取总rna。根据制造商的方案，将洗涤的组织收集在rnalater试剂(qiagen gmbh,hilden,germany)中。在rna提取之前，通过使用手持式均浆器(pt1200e polytron,kinematica gmbh,eschbach,germany)将组织在 trizol中匀浆。使用与上述细胞相同的方案进行rna提取、cdna合成和rt
‑
pcr。分析 hbmp
‑
2、runx2、alp和coll i的表达水平。扩增引物在表3中列出。
[0387]
总之，选择β
‑
微管蛋白作为参照基因。数据表示为相对于对照——即分别是未转染的细胞和组织——的加倍诱导。
[0388]
茜素红染色和定量。转染后14天和21天，进行茜素红染色以评价用hbmp2 cmrna 复合物转染的细胞中的钙沉积物。这些钙沉积物将是amsc成骨分化的指标。简言之，将乙醇固定的细胞与茜素红溶液(dpbs中5mg/ml)一起在室温下孵育15分钟。染色细胞被彻底地洗涤以去除非特异性染色和/或可能的沉淀物。矿化结节和钙沉积物被染色为红斑点，指示骨生成。随后用100mm十六烷基氯化吡啶在室温下萃取茜素红染料3小时。然后在570nm处测量吸光度。实验一式三份进行，并且报导与未转染的对照细胞相比较的结果。
[0389]
统计分析。所有获得的值报导为平均值
±
标准偏差。使用graphpad prism版本6.00 (graphpad software,ca,usa)进行统计分析。通过应用shapiro
‑
wilk检验分析数据的正态分布。进行单向anova法，然后进行tukey多重比较测试，以分析经由不同转染试剂的转染细胞的metluc表达(图2a)和流式细胞术结果(图3c)。此外，在分析两个独立样品的情况下，使用学生t检验。所有统计分析均按照所使用软件的推荐进行。p<0.05的概率被认为是显著的。曲线下面积(auc)的值通过使用origin pro 9g软件(microcal1 software； originlab corp,ma,usa)计算。
[0390]
化学修饰的mrna的产生。使用公开的方案(kormann，同上)产生编码egfp、tomato、 metluc和人bmp
‑
2的cmrna。通过琼脂糖凝胶电泳分析产生的cmrna的分子大小和质量(图1)。所有cmrna都具有预期的大小，并且未检测到降解(不存拖尾)或额外的副产物(非期望
大小的额外条带)。
[0391]
mts测定。细胞单层用200μl/孔的mts试剂溶液(不含酚红的无血清mem中5∶1 比率)处理，并且在标准培养条件下孵育3小时，进行光防护。将来自每个孔的100μl培养基转移入96孔板，并且在perkinelmer wallac victor 1420多标记计数器(ma,usa)中测定 490nm下的吸光度。乳胶橡胶用于诱导细胞死亡(阳性对照)(balmayor,2013，同上)。未处理的细胞用作阴性对照(即100％细胞存活)。
[0392]
用于体内测试的cmrna制剂。
[0393]
c12
‑
(2
‑3‑
2)/cmrna脂类制剂。通过将100mg n,n
’‑
双(2
‑
氨基乙基)
‑
1,3
‑
丙二胺(0.623 mmol)与575.07mg 1,2
‑
环氧十二烷(3.12mmol，(n
‑
1)当量，其中n是2
×
量的伯胺加1
×
量仲胺/低聚(亚烷基胺))混合，并且在80℃下在不断摇动下混合96小时，制备阳离子脂质(又称为“c12
‑
(2
‑3‑
2)”)。使用阳离子脂质c12
‑
(2
‑3‑
2)、辅助脂质dope和胆固醇和peg
‑
脂质dmpe
‑
peg 2k以摩尔比8∶5.29∶4.41∶0.88配制脂类颗粒。简言之，将恰当体积的每种脂质原液在无水乙醇中合并以分别达到50、20、20和20mg/ml的浓度。将最终体积调整至200μl。通过快速溶剂交换实现脂质体形成。随后，将200μl脂质体混合物与柠檬酸盐缓冲液中的800μl cmrna(即hbmp
‑
2cmrna或ffl cmrna)混合。将最终cmrna浓度固定为200μg/ml，n/p比为17。在室温下孵育30分钟后，将阳性脂质体对水透析过夜。
[0394]
体内测试含有c12
‑
(2
‑3‑
2)/cmrna脂类的纤维蛋白凝块。就在植入前制备含有 c12
‑
(2
‑3‑
2)/cmrna复合物的纤维蛋白凝块。因此，将都含有2.5μg cmrna的 c12
‑
(2
‑3‑
2)/hbmp
‑
2cmrna和c12
‑
(2
‑3‑
2)/ffl cmrna复合物独立地与50μl纤维蛋白原 (3000kiu/ml,tissucol,baxter,unterschleiβheim,germany)混合并冻干。在开始外科手术前 30分钟，用无菌水将纤维蛋白原
‑
cmrna粉末再水化。完全均化后，将纤维蛋白原
ꢀ‑
c12
‑
(2
‑3‑
2)/cmrna与50μl凝血酶(4u/ml,tissucol,baxter,unterschleiβheim,germany) 混合并使其凝块2分钟。作为对照，在完全不存在cmrna的情况下，按照上述相同的程序获得纤维蛋白凝块。
[0395]
非临界尺寸缺陷：hbmp
‑
2 cmrna应用——用于体内测试。在无菌条件下产生经皮质的3mm非临界尺寸的骨缺损。在18只雄性sd大鼠(charles river laboratories,sulzfeld, germany)的股骨骨干中间双侧生成骨缺损。将体重650和750g之间的大鼠随机分为3组(每组n＝6)：纤维蛋白(即对照组)；纤维蛋白 2.5μg ffl cmrna和纤维蛋白 2.5μghbmp
‑
2cmrna。
[0396]
通过肌内注射110mg/kg氯胺酮(ketanest s,25mg/ml,pfizer,karlsruhe,germany)和12 mg/kg的赛拉嗪(xylazin)(rompun,20mg/ml,bayer,leverkusen,germany)的混合物诱导麻醉。在股骨轴中间产生3mm钻孔，并且用0.9％氯化钠溶液(b
‑
braun,melsungen,germany) 冲洗。根据这些组，缺损处用就在植入前产生的100μl纤维蛋白凝块填充。因此，使用镊子从eppendorf管转移凝块，并且将其置于骨缺损中，确保完全闭合。
[0397]
大鼠每天一次接受卡洛芬(力莫敌(rimadyl),pfizer,karlsruhe,germany)(4mg/kg)，持续四天作为镇痛治疗。
[0398]
手术后两周，通过心脏内注射过量剂量的戊巴比妥(120mg/kg,eutha77,essex pharma, hamburg,germany)在全身麻醉下处死大鼠。收获股骨并储存在福尔马林溶液(中性缓冲液，10％，sigma
‑
aldrich,mo,usa)中24小时。随后，将样品转移至80％乙醇中直到进
一步处理。
[0399]
微计算机断层照相(μct)分析——用于体内测试。将所有外植股骨进行微计算机断层照相分析(μct)(μct 40；scanco medical ag,bassersdorf,switzerland)。用于测量的设置如下描述。增量设置为157μm，角度为0
°
。图像的体素大小设置为8000μm，切片总数为665。因此，在纵向上以5.32mm的总间隔研究每个样品。光束的积分时间设置为最大值300ms，并且已经检测每个测量点的三个数据集(其平均值被用于后续计算)。μct设备每周用羟基磷灰石体模校准一次。
[0400]
通过3d分割算法，使用软件imagej(national institutes of health,md,usa)分析矿化骨和骨小梁愈伤组织结构。μct数据集被转移到由称为khk_microct的插件设定的3d 层，该插件由karl heinz kunzelmann教授(department of operative/restorative dentistry, ludwig
‑
maximilians
‑
university of munich,germany)提供。为了分开矿化骨和愈伤组织的密度水平，引入了一个灰度阈值，并且对已经研究的两个密度间隔，设置在2500
‑
4500的值之间。另一个称为的插件随后用于愈伤组织结构的3d成像和量化。已经考虑的唯一数值是用于比较每个样本的新形成的愈伤组织的量的骨体积(bv)。该量由上述的 khk_microct插件自动转入公制值。通过称为“3d查看器”的内置插件获得愈伤组织结构的详细3d图像。
[0401]
实施例2.在amsc和bmsc中转染的df
‑
gold比mrna的比率的优化。
[0402]
为了进一步优化使用含有df
‑
gold的mrna阳性脂质体对amsc和bmsc的转染方案，考虑了不同的参数。研究了2.5、5、10和20pg/细胞的剂量下，从0.5至5μl增强剂/μg 核酸的df
‑
gold比mrna的v/w比。结果示于图10和11。对于这两种细胞类型，发现 20pg mrna/细胞的剂量都是最佳的。另外，amsc中的5μl df
‑
gold/μg mrna和bmsc 中的2μl df
‑
gold/μg mrna被发现为使用的增强剂的最佳量。
[0403]
实施例3.通过脂转染和磁转染的cmrna至干细胞的有效递送。
[0404]
首先，研究不同试剂对使用cmrna转染脂肪来源的干细胞(amsc)的效率。图2a显示了长腹水蚤萤光素酶转染后长达120小时的表达动力学。对于所有测试的试剂，在转染后24小时获得最大表达。bpei是所有试剂中效率最低的试剂，并且利用bpei对于任何测量时间点均未观察到显著表达(p>0.05)。基于不同脂质的试剂在得到的metluc表达动力学上是不同的。尽管利用lipofectamine2000在24小时后观察到最高表达(p<0.0001)，但是在48小时或更晚的时间点，其寿命最短，具有低metluc活性。另一方面，dreamfect gold (df
‑
gold)和dogtor虽然与lipofectamine2000相比在24小时时间点效率较低，但是metluc 表达维持长达120小时。除了转染效率，还测试了不同转染试剂在amsc中的细胞毒性。在lipofectamine2000的情况下，metluc cmrna复合物最具毒性，细胞存活在5小时内降至小于75％(图2b)。df
‑
gold和bpei复合物在两者测量的时间点都产生轻度细胞毒性，有超过80％的细胞存活。在转染后24小时，df
‑
gold转染细胞的细胞存活与未转染对照之间无统计学显著差异(p＝0.06)。
[0405]
基于更长的转基因表达(转染后长达120小时)和低细胞毒性的期望特征，选择df
‑
gold 来用cmrna转染间充质干细胞(amsc和bmsc)。每个细胞的cmrna的剂量针对两种细胞类型进行优化。结果显示20pg/细胞作为转染的最佳剂量。数据在图10和11中呈现。将df
‑
gold比cmrna的v/w比固定为4(制造商的说明书)，以在amsc和bmsc之间更准确地比较。然
而，对于两种细胞类型，该比率也被改善。结果表明amsc的v/w比为5， bmsc的v/w比为2(图10和图11)。
[0406]
由于质粒dna(pdna)是基因转移的常用非病毒载体，所以在用metluc cmrna或其质粒对应物(pvaxa120
‑
metluc)转染后，比较metluc表达。尽管靶蛋白似乎在细胞pdna 脂转染后24小时表达较高，但从48小时开始直至120小时的观察时间结束，与急剧降低的pdna相比，cmrna表达在该情况下保持较高的水平。不受理论的束缚，持续表达可能是更好的mrna保护免受降解的证据，并且是cmrna稳定化的指示，例如由于根据本发明使用的各自的阳性脂质体(例如df
‑
gold
tm
/cmrna)。
[0407]
比较了都编码metluc的pdna和cmrna脂转染后的靶蛋白表达的功效(图2c)。转染后24小时，pdna转染的amsc的转染效率几乎两倍高(p＝0.005)。然而，在转染后 48小时至120小时之间，对于用cmrna转染的细胞，metluc表达水平显著更高(p＝ 0.0002)，并且转染后长达120小时仍保持显著更高(p＝0.007)。“pdna”和“cmrna”曲线下的面积，auc
pdna
＝1.71
·
108(归一化的rlu
·
h)和auc
cmrdna
＝1.68
·
108(归一化的 rlu
·
h)，通过积分0和120小时时间点之间的数据计算，显示cmrna递送可以导致靶蛋白的“生物利用度”类似于在pdna递送之后所实现的。
[0408]
为了进一步增加cmrna转染的效率，采用了磁转染。为此目的，使用pei装饰的氧化铁芯
‑
二氧化硅壳磁性纳米颗粒(即so
‑
mag6
‑
115)。so
‑
mag6
‑
115纳米颗粒的特征在于：约为96
±
14nm的流体动力学直径，34
±
3mv的高的正ζ电位。磁性纳米颗粒在水性悬浮液中看起来在视觉上是稳定的。在水中、150mm nacl或细胞培养基中没有观察到沉淀。此外，纳米颗粒对外部施加的磁场有明确的响应。
[0409]
在磁转染实验中，bmsc被转染，与amsc进行并排比较。与脂转染相比，磁转染导致两种细胞类型的转染效率的显著增加(图3)。在转染后24小时，egfp转染细胞的流式细胞术分析揭示59.7％(amsc)和73.2％(bmsc)阳性细胞(图3c)。相比之下，只有37.5％ (amsc)和38.9％(bmsc)细胞在进行脂转染时(即df
‑
gold作为转染试剂)导致对egfp阳性。代表性的直方图如图12所示。该流式细胞术数据与荧光显微镜检查和metluc测定的数据一致(图3a、b和d)。图3a清楚地显示出，当使用磁转染将tomato cmrna转移入细胞时，表达tomato蛋白的转染的bmsc的百分比更高。在递送编码egfp的cmrna后观察到相似的模式，在图3b中显示表达egfp的amsc和bmsc的荧光显微镜照片。类似地，通过经由利用metluc cmrna的磁转染进行转染的amsc和bmsc，图3d显示在转染后24小时二者的metluc的显著增高的表达(p<0.0001)。
[0410]
获得了磁转染对bmsc的显然更显著的影响。两种细胞类型的mai在图3d中给出。对于bmsc和amsc，分别测定metluc活性的4.4倍和2.4倍增加(mai)。这些数据给出了当使用磁转染时在两种msc类型中的蛋白表达显著增强的证据。
[0411]
实施例4.通过转染的干细胞增强的hbmp
‑
2的分泌。
[0412]
由于在即将到来的实验中成骨条件的重要性，在opti
‑
mem培养基中以及在成骨培养基存在下进行了hbmp
‑
2cmrna的转染。有趣的是，在opti
‑
mem中进行转染并且在5 小时后进一步更换为成骨培养基似乎并没有损害转染效率(图4a)。在成骨培养基存在下进行转染时，观察到显著更低的hbmp
‑
2表达(p<0.05)。图4b显示在转染后不同时间点，转染细胞的细胞溶胞产物和上清液中定量的分泌的和细胞相关的hbmp
‑
2的含量。与未转染的对照相比，
来自转染细胞的样品中检测到显著更高的hbmp
‑
2水平(p<0.001)。转染 48小时后观察到最大的hbmp
‑
2表达。48小时后，hbmp2的细胞内水平显著降低(p＝ 0.007)。尽管hbmp
‑
2的细胞内水平较高，转染的amsc在转染后长达7天分泌显著更高的hbmp
‑
2水平(图4b和c)(p＝0.0008)。图4b和c展示了来自磁转染细胞的样品中的 hbmp
‑
2水平。总细胞产生的hbmp
‑
2约为700pg/μg cmrna(图4c)。这代表了与脂转染后获得的hbmp
‑
2水平相比的6倍增加(mai)(图4c)。利用磁转染观察到的较高水平的 hbmp
‑
2与对编码egfp报告基因(图3b、图12)、metluc(图3d)和tomato(图3a)的cmrna 中观察到的更高的转染效率和表达是一致的。值得一提的是如此事实：利用磁转染，转染细胞中的hbmp
‑
2的细胞内水平也大量增加(p<0.0003)。在图4b中，可以观察到，在转染后24小时，hbmp
‑
2的细胞内数量几乎与分泌的hbmp
‑
2相同(p＝0.8)。在此时间点后，与细胞溶胞产物中量化的水平相比，转染的细胞能够分泌显著更高量的hbmp
‑
2(p< 0.001)。
[0413]
实施例5.在amsc中，hbmp
‑
2cmrna递送诱导体外骨生成。
[0414]
作为体外骨生成的第一个指征，检测了hbmp
‑
2转染的amsc的碱性磷酸酶(alp)活性。在hbmp
‑
2cmrna转移后12天，可以确定转染细胞中增加的alp表达(图5a和b)。 alp活性的定量表明，与对照组相比，对于转染细胞，早在7天就观察到显著增加，并且该增加持续直至第12天(图5b，p<0.01)。
[0415]
随后，通过实时pcr在不同时间点定量骨生成相关基因的表达(图5c
‑
h)。对于脂转染和磁转染组二者，与未转染相比，runx2、osterix、alp、coll i、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达随时间增加。有趣的是，在转染后14天，当与脂转染相比时，在磁转染组中runx2、 alp和opn显示出显著更高的表达。特别是在opn的情况下，磁转染在14天后导致连续的高表达。另一方面，对于磁转染组，仅在14天后才观察到runx2表达的降低。
[0416]
茜素红染色(图6b和c)显示转染组中钙化结节数比未转染细胞明显更高(图6a)。此外，在脂转染后，在较低的hbmp
‑
2cmrna剂量(即20pg/细胞，图6c)下，染色明显更强烈。这对应于通过用metluc cmrna滴定实验获得的优化的剂量(图10)。在32pg/细胞的较高剂量下，矿化明显较差(图c右侧)。然而，当磁转染用于cmrna转移时，其变得更强(图 6b)。茜素红染色的定量分析证实了那些结果。图6d显示，当使用阳性脂质体时，与较高剂量(32pg/细胞)相比，较低剂量组(20pg/细胞)显著更高的矿化(p<0.0001)。对于用20pghbmp
‑
2cmrna转染的细胞，矿化随着培养时间而增加。通过使用磁转染，对于较高剂量组，检测到明显更高的矿化(p＝0.04，14天；p＝0.007，21天，图6d)。此外，早在转染后14天，就明确地注意到此。
[0417]
实施例6.人脂肪组织的转染诱导体外基因表达。
[0418]
用df
‑
gold/tomato n1 cmrna或df
‑
gold/hbmp
‑
2cmrna复合物转染人脂肪组织。如图7a所示，脂肪盘内的大量细胞在转染后成为tomato n1阳性的。对于hbmp
‑
2转染的盘，与未处理的外植体相比，对于转染组织，rt
‑
pcr揭示hbmp
‑
2表达增加超过4倍(图 7b)。此外，与对照组相比，在成骨条件下培养的转染组织中，清楚观察到骨相关基因如 runx2、osterix和coll i的表达增加。在alp和coll i的情况下，它们的表达从转染后3 天到7天显著增加(p<0.001)。
[0419]
实施例7.在两周内，bmp
‑
2cmrna使体内骨形成大约加倍。
[0420]
图13a
‑
c显示了处理2周后所有研究组的μct 3d重建和纵向截面。可以在 c12
‑
(2
‑
3
‑
2)/hbmp
‑
2cmrna组的μct截面中观察到新骨(neo
‑
bone)形成的迹象。相比之下，在纤维蛋白或c12
‑
(2
‑3‑
2)/ffl cmrna组中没有观察到新骨(new bone)形成的迹象。该模型用于确定hbmp
‑
2cmrna在自发骨愈合过程中的作用。图13d显示了对所有组的愈伤组织形成量的定量分析。该μct数据显示与对照组相比，在用含有c12
‑
(2
‑3‑
2)/hbmp
‑
2 cmrna的纤维蛋白(p<0.05)处理的动物中2周后，愈伤组织形成显著增加。在纤维蛋白和含有c12
‑
(2
‑3‑
2)/ffl cmrna的纤维蛋白组之间没有发现显著差异。在这些组中，没有观察到显著的愈伤组织形成。
[0421]
获得的μct结果证明了hbmp
‑
2cmrna对骨愈合的治疗作用。在用hbmp
‑
2cmrna 处理的那些动物中，可以清楚地观察到体内骨生成的刺激。相比之下，对于用非特异性 cmrna(即ffl cmrna)处理的动物，没有观察到骨生成。这表明hbmp
‑
2cmrna介导 hbmp
‑
2在骨缺损的部位处的治疗性表达，引起骨生成发生。
[0422]
进一步的材料和方法(尤其与实施例8至14相关)。
[0423]
材料。杜氏改良伊氏培养基(dmem)、α
‑
最低必需培养基(α
‑
mem)、不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)、胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素(p/s)、0.05％胰蛋白酶
‑
edta 和i型和ii型胶原酶购自life technologies gmbh的gibco(darmstadt,germany)。
[0424]
包括1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dppc)和胆固醇的辅助脂质由avanti polarlipids inc,(al,usa)供应。分别从carlroth(karlsruhe,germany)和nof americacorporation(ny,usa)购买了其它所需的用于复合物制备的材料，如乙醇和1,2
‑
二肉豆蔻酰
ꢀ‑
sn
‑
甘油、甲氧基聚乙二醇(dmg
‑
peg)2kd。商品名为“kollagen resorb
tm”的胶原海绵由resorba(n
ü
renburg,germany)提供。其它试剂和材料均从sigma
‑
aldrich获得，除非另有说明。
[0425]
复合物制备。已经使用阳离子脂质c12
‑
(2
‑3‑
2)(由ethris gmbh提供并且也称为“c12 epe”)作为非病毒转染试剂，连同dppc和胆固醇作为辅助脂质和dmg
‑
peg2k作为聚乙二醇化脂质。
[0426]
rna复合物以200μg/ml的rna浓度、8的n/p比(其代表脂质的氨基与rna的磷酸基团的摩尔比)下形成。使用胰岛素注射器，通过快速注射含有cmrna的水相内的脂质相的乙酸溶液，然后高速下15秒涡旋，并且在室温下孵育30分钟，诱导复合物自组装。使用透析盒——分子量截断值为7kda(pierce,usa)，将合成的阳性脂质体对双蒸水透析， 30分钟后进行单次水交换，然后透析过夜。
[0427]
粒径和ζ电位的测量。使用zetasizer(malvern instruments,worcester,uk)通过激光散射测量阳性脂质体的粒径。将750μl复合物填充到干净的一次性比色皿池中，并且分别进行总计30次和300次运行，以进行颗粒分级并评估表面电荷。
[0428]
长腹水蚤萤光素酶测定。报告mrna长腹水蚤萤光素的表达动力学用于测试胶原海绵持续mrna递送的质量。为此，转染后每24h收集细胞培养上清液，并且用新的培养基替换。收集的培养基立即进行测量，或者在
‑
20℃冷冻，直到实验的最后一天共同地测量样品。为了量化met luc表达，将80μl上清液在黑色96孔板(costar,ny,usa)与30μl 0.05mm 腔肠素(synchem,felsberg,germany)轻轻混合，并且使用发光读数器(wallac victor, perkin
–
elmer life sciences)测量，一式三份。
[0429]
大鼠间充质干细胞(msc)的分离和扩增。大鼠骨髓间充质干细胞(bmsc)由ethris
gmbh提供。从雄性大鼠的脂肪组织分离脂肪间充质干细胞(amsc)。在此过程中，将脂肪组织切割成毫米大小的块并转移到含有无菌dpbs的falcon管(corning inc.,ny,usa)，并且用dpbs洗涤数次。接下来，在加湿的37℃下将脂肪块在ii型胶原酶溶液(0.4mg/ml) 中孵育30分钟。然后，通过加入完全dmem培养基(含有10％v/v fbs和1％v/v青霉素/ 链霉素的dmem)终止胶原酶活性，并且将混合物以600g下离心10分钟。收集上层脂肪层，并且将其重新悬浮于完全dmem培养基中。在下一步中，将细胞悬浮液通过40μm 细胞过滤器(corning inc.,ny,usa)过滤，在t75 cm烧瓶(corning inc.,ny,usa)中平板接种，并且在加湿的37℃和5％co2中置于完全dmem中[20]。为了去除非贴壁细胞，在第二天更换培养基。细胞被扩增，细胞密度为1500
‑
3000个细胞/cm2，并且每三天更换一次培养基。在本研究中，直到第6代使用msc。
[0430]
实验装置。使用冲孔机(vbs lochzange，nr.19970181)将胶原海绵切成小块(直径6 mm)。将块放在无菌平底的聚丙烯未包被的96孔板(eppendorf,humburg,germany)的孔中。将50μl作为冻干保护剂的蔗糖中的阳性脂质体(2％)逐滴加入每个块，并在室温下孵育90 分钟以使其完全被海绵吸收。然后将加载的海绵移至高真空(martin christgefriertrocknungsanlagen gmbh,osterode am harz,germany)中，并且在那里在0.05mbar 下干燥至少2小时。之后，将海绵用于接种细胞或真空密封并保持在室温下直至使用。在细胞接种的情况下，向每个海绵加入50μl完全培养基(用于nih3t3和msc细胞的完全 dmem)中的期望细胞密度，然后在加湿的37℃和5％co2下孵育30分钟。在孵育期间，细胞必须接种在胶原海绵上，因为它们不能在聚丙烯未包被的板上贴壁和生长。然后，将 200μl完全培养基加入到在细胞培养箱中孵育的孔和板中。
[0431]
使用层流罩(bdk luft und reinraumtechnik gmbh,sonnenb
ü
hl
‑
genkingen,germany)在无菌条件下进行整个程序。此外，由于胶原海绵的高静电电荷，避免塑料材料。
[0432]
cmrna转移的有效性。进行facs分析以表征3d体系中cmrna转染的有效性。为此，将每块海绵在具有钙和镁的hanks平衡盐溶液(hbss)中与300u/ml i型胶原酶一起孵育4至7小时。在孵育期间，视觉上检查海绵数次，以确保胶原完全消化。将细胞在500g 下离心5分钟，然后用dpbs洗涤。在下一步骤中，将细胞在37℃下与10μl的0.05％胰蛋白酶
‑
edta一起孵育5分钟以加速细胞的分离。通过向每个孔中加入90μl含有2％fbs 的dpbs来停止分离。
[0433]
使用attune nxt流式细胞仪(life technologies,ny,usa)进行facs分析。在每个实验之前，使用校准珠(molecular probes,life technologies,ny,usa)校准机器。通过使用前向和侧向散射门控将细胞碎片排除在分析之外。将在2d和3d条件下培养的未转染细胞用作阴性对照以调节荧光通道来检测egfp荧光。使用flowjo_v10软件分析三次获得的数据。
[0434]
细胞死亡/存活的测定。使用碘化丙啶染色和wst测定来评价细胞存活。对于两种测定，使用真空干燥的加载不同剂量的egfp cmrna复合物的胶原海绵。将10,000个nih3t3 细胞/每个海绵接种在完全dmem培养基中，并在加湿的37℃和5％co2下孵育48小时。
[0435]
对于活
‑
死亡染色，如前所述，准备细胞进行facs分析。然后，就在测量前，向每个孔中加入1∶1000稀释的1mg/ml碘化丙啶原液。
[0436]
根据制造商的说明书(比色细胞存活试剂盒ii(wst
‑
1)，promokine,heidelberg, germany)，通过wst反应测定评估细胞存活。在加入wst试剂前，将上清液用移液管上下抽吸
三次，以在每孔中从海绵中得到匀浆溶液。然后将100μl上清液转移到新的细胞培养物96孔板(corning inc.,ny,usa)中进行测量。来自未转染孔的上清液用作空白对照。使用多分光光度计读数器(wallac victor,perkin
–
elmer life sciences,ma,usa)在450nm下测量吸光度，一式三份。
[0437]
通过在hbmp2
‑
cmrna加载的胶原基质上培养的msc的hbmp
‑
2分泌。在转染后 24小时收集用不同剂量的hbmp2 cmrna阳性脂质体转染的msc的培养基样品，并且按照制造商的说明书(r&d systems,minneapolis,mn)用人bmp
‑
2elisa试剂盒测量hbmp
‑
2 的浓度。实验一式三份进行，并且使用标准曲线(r2＝0.99)测定蛋白含量。
[0438]
扫描电子显微镜检查。使用扫描电子显微镜检查(sem)表征胶原海绵的形态，并且评价在其上加载mrna复合物。使用溅射涂布机(edwards sputter coater s150b,hhv ltd,westsussex,uk)将所有样品用比率60/40的金和钯涂覆。然后，使用zeiss
‑
leo dsm 982 gemini (felmi
‑
zfe,graz,austria)在1.2kv下进行sem。
[0439]
在胶原海绵上接种的细胞的苏木精染色。在胶原海绵上接种nih3t3细胞后24小时，将细胞用ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的4％甲醛固定，在室温下过夜。然后将胶原海绵脱水并包埋在石蜡中。胶原切片(7μmm)脱蜡，并且按照标准方案用苏木精染色。
[0440]
rna分离和逆转录酶实时聚合酶链反应(rt
‑
pcr)。在hbmp
‑2‑
加载的胶原海绵上接种细胞后7天和14天，向每孔加入hanks平衡盐溶液(hbss)中的适量体积的i型胶原酶，以达到300u/ml的最终浓度的i型胶原酶。然后将板在加湿的37℃和5％co2下孵育4 至7小时。根据制造商的说明书，当胶原海绵完全溶解时，将细胞在500g下离心5分钟，移出上清液，随后通过trizol试剂(ambion by life technologies,darmstadt,germany)裂解细胞，进行总rna分离。
[0441]
用nanodrop 2000c分光光度计(thermo scientific,de,usa)测定rna浓度和纯度。按照制造商的说明书，通过使用第一链cdna合成试剂盒(first strand cdna synthesis kit) (thermo scientific,darmstadt,germany)从450ng总rna逆转录第一链cdna。对于hbmp2 转染和未转染组的每个，使用15个海绵，并且将裂解的细胞合并在一起进行rna分离。
[0442]
为了评价骨相关基因的表达，因此采用advvanced universal sybr green supermix (bio
‑
rad,munich germany)进行定量实时pcr(n＝3)。pcr在light cycler 96热循环仪 (roche,mannheim,germany)上进行。靶基因的表达水平被归一化为gapdh(在mc3t3
‑
e1 细胞的情况下)和β
‑
微管蛋白(对于msc)的表达水平。数据表示为相对于对照即3d中未转染的mc3t3
‑
e1细胞、2d培养中未转染的msc的加倍诱导。从5’端至3’端的引物序列列出如下：
[0443]
用于mc3t3
‑
e1细胞骨再生实验的小鼠引物：
[0444]
基因正向引物(seq id no.)反向引物(seq id no.)alpgtgccctgactgaggctgtc(32)ggatcatcgtgtcctgctcac(33)ocnccgggagcagtgtgagctta(34)tagatgcgtttgtaggcggtc(35)gapdhgcacagtcaaggccgagaat(36)gccttctccatggtggtgaa(37)
[0445]
用于msc骨再生实验的大鼠引物：
[0446]
基因正向引物(seq id no.)反向引物(seq id no.)
被认为是显著的。
[0454]
实施例8.进一步可选的具有c12
‑
(2
‑3‑
2)的cmrna复合物形成。
[0455]
由ethris gmbh提供的阳离子脂质已经被用作非病毒载体，基于脂质的正氨基和 cmrna的负磷酸基团之间的静电相互作用，制造具有cmrna的稳定的阳性脂质体 (anderson,human gene therapy 14,2003,191
‑
202)。为了稳定阳性脂质体结构并减少渗漏，向ethris脂质供应了称为1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dppc)和胆固醇的两种辅助脂质(anderson,drug delivery 11,2004,33
‑
39；liang,journal of colliod and interface science278,2004,53
‑
62)。最后，将1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油、甲氧基聚乙二醇(dmg
‑
peg)2kd加入到脂质混合物中以提供peg化的脂质体。众所周知，peg化通过增加水溶性、保护免受酶降解和限制免疫原性和抗原反应来改善脂质体制剂的物理化学特性(milla,currentdrug metabolism 13,2012,105
‑
119)。整个乙酸脂质混合物的最终n/p比是8/5.29/4.41/0.88，其代表c12
‑
(2
‑3‑
2)/dppc/胆固醇/dmg
‑
peg分别的氨基与cmrna分子的一个磷酸基团的摩尔比。cmrna阳性脂质体的生物物理特性在表6中制表。所有产品的流体动力学直径大约为50nm，多分散指数接近0.1，这表明为同质产品。此外，所有复合物的总表面电荷略微为正，接近中性。
[0456]
实施例9.胶原海绵上的cmrna复合物加载和细胞接种。
[0457]
在胶原海绵上加载之前，将2％的蔗糖加入到cmrna阳性脂质体溶液中作为冻干保护剂。冻干保护剂在真空干燥过程中的脱水期间保持生物系统的完整性(kannan,journal ofliposome research,2014,1
‑
9)。通过扫描电子显微镜检查(sem)可视化海绵显示，真空干燥的含有2％蔗糖的胶原海绵与真空干燥前相比，类似具有较小孔隙的封闭笼(图23)。
[0458]
为了确保在海绵上加载cmrna阳性脂质体的可能性，通过sem研究了cmrna
‑
加载的海绵，并且在胶原海绵上检测到含有cmrna的阳性脂质体(图14a)。
[0459]
为了研究胶原海绵上的cmrna加载以及细胞转染，海绵加载有2μg tdtomato cmrna 阳性脂质体，其中10％的tdtomato cmrna是共价地fitc缀合的。使用leica dmi8荧光显微镜(leica microsystems,heerbrugg,switzerland)，在接种nih3t3细胞后30小时，可视化细胞和cmrna阳性脂质体在海绵上的分散性以及转染功效。如图14b所示，细胞被转染并表达tdtomato蛋白(红斑)，主要在具有高cmrna积累的位置(绿点)中。
[0460]
为了研究3d基质上的细胞性状，在接种nih3t3细胞后7天，通过海绵垂直切片的苏木精染色证实nih3t3细胞已经迁移到胶原海绵中。从图14c，显然细胞能够迁移到海绵中并使用整个基质进行生长和信号传导，这更可能类似于体内的情况。
[0461]
首先，显示细胞可以在胶原海绵3d基质内生长。其它研究也证明了胶原海绵作为合适的用于细胞培养的3d支架，其又可以改善细胞信号传导和细胞性状，并且影响细胞中的基因表达(chevallay,medical and biological engineering and computing 38,2000, 211
‑
218)。然后，使用具有荧光标记的cmrna的sem和荧光显微镜检查，可见均匀分布的cmrna阳性脂质体和细胞(图14)。
[0462]
实施例10.胶原海绵上的转染功效和细胞存活。
[0463]
为了验证胶原海绵上的细胞转染的功效和安全性，转染后48h评估了nih3t3细胞系中的egfp cmrna的表达。首先，使用july
tm
荧光显微镜(baker and baker ruskinn,usa) 可视化阳性egfp表达细胞(图15a)。为了量化这些结果，进行facs分析，并且观察到转染细
胞中平均荧光强度的显著增加。(图15b)。在剂量反应实验中，在使用每个细胞更高的cmrna量的情况下，观察到高达100％的转染效率(图15c)。
[0464]
在临床环境中，不但转染效率而且细胞毒性成为决定因素。因此，除了gfp表达外，还在两次独立实验中，使用两种不同的方法——即pi染色随后facs分析和wst测定——在转染后48小时量化了细胞存活。使用两种方法获得了60
‑
70％范围内细胞存活的类似结果(图15d和e)。与转染效率不同，在观察到功效的剂量依赖性增加时，细胞存活似乎与剂量无关。
[0465]
通过facs分析对胶原海绵上的egfp cmrna转染功效的量化证明了本技术技术的显著的高功效，本技术的技术达到了100％转染的细胞(图15b和c)。为了验证本技术的技术用于临床方法，还评估了细胞存活，并且观察到约为60
‑
70％的剂量独立性的细胞存活，这对于本技术的体外和体内方法来说都是可以接受的。(图15d和e)。细胞存活测定中的剂量独立性可以是3d基质内的均匀细胞分布的结果，其可能非常类似于体内情况，并且改善细胞信号传导和增殖(mueller
‑
klieser,american journal of physiology
‑
cell physiology 273, 1997,c1109
‑
c1123)，以这样的方式，细胞可以耐受甚至高剂量的cmrna复合物。当总体功效低且需要较高剂量的cmrna时，细胞存活的这种剂量独立性趋势将是特别有益的。
[0466]
实施例11.胶原海绵起持续cmrna递送的贮库的作用
[0467]
为了研究胶原海绵是否可以提供持续的cmrna递送系统，每24小时测量mih3t3 细胞中长腹水蚤萤光素cmrna(met luc)的表达动力学，并且在2d和3d培养中进行比较 (图16)。
[0468]
基于该结果，胶原海绵显示出持续cmrna递送系统的性质，对于接下来的6天具有蛋白质表达平台。此外，与在8天后显示几乎没有表达的2d细胞培养相比，利用较高的 cmrna剂量，即使在11天后，cmrna
‑
加载的胶原海绵显示出相对高的蛋白质表达。
[0469]
通过将含未修饰的mrna的阳性脂质体加载到胶原海绵上已经获得了类似的结果(图 24)。然而，当使用非真空干燥的胶原海绵时，该系统失去其延迟递送效率(图25)。这提供了证据：真空干燥是在本技术设置中提供持续的cmrna递送系统的必需且关键步骤。
[0470]
在下一步骤中，使用从骨髓(bmsc)和脂肪组织(amsc)中分离的大鼠间充质干细胞 (msc)，对原代细胞测试该系统。使用这两种细胞类型，通过在阳性脂质体
‑
加载的胶原海绵上接种增加数量的细胞来测定met luc表达的动力学。如图17所示，无论细胞密度如何，在至少接下来的四天里，接种在复合物加载的胶原海绵上的msc揭示延长的蛋白质表达。对于更高的细胞密度(>10000个细胞/海绵)，没有观察到met luc表达的显著增加，使用 10
‑
20,000个细胞/海绵进行进一步的实验。
[0471]
使用细胞系(图16)和具有各种细胞密度的原代细胞(图17)以及修饰和未修饰的mrna (图24)测定长腹水蚤萤光素酶cmrna的表达动力学以评估胶原海绵的持续cmrna递送的能力。基于动力学结果，真空干燥的cmrna
‑
加载的胶原海绵为cmrna提供了稳健的持续递送系统，其独立于rna修饰、细胞类型和细胞密度；甚至也为对接触抑制和细胞密度更敏感的原代细胞提供了稳健的持续递送系统[21]。当变换到低细胞密度也可行时，这种系统在缺乏细胞来源和患者样品的情况下将是非常有利的。为了具有这样的延迟递送系统，真空干燥似乎具有关键作用，而在非干燥海绵中的cmrna的表达更迅速地下降(图 25)。真空干
燥后延长的cmrna递送——不受疗法所限制——可以是由于真空干燥的胶原海绵的封闭笼结构(图23)，其中被关入的阳性脂质体需要时间来与细胞接触或从基质中释放[10]。真空干燥的cmrna阳性脂质体在胶原海绵上的均匀分布(图14a)可以是持续数天的没有转染功效或爆发释放的峰的稳态表达的另一个原因(lee,biomaterials 32,2011, 744
‑
752)。
[0472]
真空干燥还有另一个实质性的影响，其中真空干燥的胶原海绵上的cmrna复合物在室温下至少稳定6个月(图22；也参见实施例14)。对于非常敏感的mrna分子，本研究首次实现了此相当大的保质期。这又可以增加潜在的cmrna治疗剂的可用性和易用性，并且使cmrna更接近临床应用。
[0473]
当本技术被良好优化用于递送报告cmrna到细胞系和原代细胞中时，本系统被测试以研究使用hbmp2 cmrna的生理效应，即骨形成。
[0474]
实施例12.体外细胞分化
[0475]
为了验证持续的cmrna传递系统的生理效应的性能，用两种不同的细胞，即 mc3t3
‑
e1和msc，使用hbmp2 cmrna阳性脂质体，设计了两个体外骨分化实验(lee, biomaterials 32,2011,744
‑
752；meine,biomaterials 27,2006,4993
‑
5002；kim,biomaterials28,2007,1830
‑
1837)。
[0476]
为了确认将细胞接种在hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵上之后7天和14天成骨细胞样细胞(mc3t3
‑
e1)中的骨分化，进行逆转录聚合酶链反应(rt
‑
qpcr)以量化成骨标志物 (ocn和alp)的表达。接种在未加载的胶原海绵上的未转染细胞被用来作为阴性对照。如图20a所示，两种标志物在两个时间点都强烈表达，并且到第14天表达增加。
[0477]
在下一步骤中，使用相同的设置进行使用msc的体外骨分化。首先，使用facs分析评价新鲜分离的msc的阳性和阴性标志物(图26)。然后将msc接种在加载有hbmp2cmrna阳性脂质体的胶原海绵上。转染后24h，使用elisa定量上清液中hbmp2的表达(图19)。7和14天后，使用rt
‑
qpcr检测成骨标志物(runx2、osx、ocn和alp)的表达。出乎意料的是，不但在接种在3d胶原支架上的转染的msc中而且在未转染的msc 中，所有的标志物都高度表达。因此，选择与3d中细胞完全一样处理(对于培养基和洗涤) 的在常规2d情况(在培养皿中标准细胞培养物培养)中的未转染的msc培养物作为阴性对照以使在3d中的细胞中观察到的分化标志物的表达归一化。如图20b所示，单独的3d 胶原基质中的培养显著上调msc中成骨标志物的表达。
[0478]
使用在hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵上接种的成骨细胞样细胞系(mc3t3
‑
e1)和 msc进行体外骨分化[10,19](图20)。在mc3t3
‑
e1细胞的情况下，hbmp2 mrna在触发骨形成方面具有显著的效果，因为与在3d胶原支架上接种的未转染的细胞相比，在转染的细胞中成骨标志物的表达高出数倍(图20a)。
[0479]
相反，在胶原海绵上hbmp2转染和未转染的msc之间的成骨标志物的表达几乎没有显著差异(图20b)。然而，先前使用elisa检测了从在hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵上接种的msc中hbmp2的表达(图19)。根据该数据，胶原海绵本身可以引发体外msc骨再生。以前，也已经表明胶原海绵可以引发软骨形成(bosnakovski,biotechnology andbioengineering 93,2006,1152
‑
1163)。这种现象的另一个解释仔细检查(go through)了在含有 msc的转染和未转染的胶原海绵中的急剧的宏观变化(图27)。到第7天，加载有hbmp2 的海绵看起来更蓬松，尺寸扩大，而未加载的海绵随着时间的推移会压缩和收缩。由于在未加载的收缩海绵
中msc过于汇合，所以它们将丧失其多能性，并且开始重新编程成终末分化的细胞(sekiya,stem cells 20,2002,530
‑
541；coulter,pnas 97,2000,3213
‑
3218)，并且当它们在成骨培养基中生长时，成骨分化将是最可能的。
[0480]
实施例13.体内细胞分化
[0481]
通过大鼠股骨缺损模型评价体内骨再生活性。作为实验组和对照组，分别将hbmp2 cmrna
‑
加载和未加载的真空干燥的胶原海绵施加至两组动物的股骨缺损处。详细地说，将制备的海绵植入到在大鼠股骨的中心部分建立的2mm直径的骨缺损处。为了可视化和量化骨愈合，手术后两周进行了微计算机断层照相(μ
‑
ct)扫描。如图21a所示，在hbmp2cmrna处理组中发现了更多新形成的骨。结果的定量还证明，与空白胶原相比，hbmp2cmrna
‑
加载的胶原海绵可以显著增加骨再生(图21b)。在μ
‑
ct的3d扫描模型中，hbmp2 对愈伤组织形成的影响也很明显(图29)。探讨进一步的细节，利用在骨(骨膜、皮质和髓质) 不同部分的μ
‑
ct的进一步分析揭示了在髓质区域中的最高骨再生(图27)，其中存在许多骨髓干细胞。
[0482]
为了验证新形成的骨，也在第2周进行免疫组织化学，并且在hbmp2 cmrna处理组中发现了较高的矿化骨组织。与μ
‑
ct结果类似，高度矿化的区域(免疫组织化学图像中的深黑色)被观察到大部分在骨髓质部分中(图18a)。此外，骨膜区域中的组织学分析显示与对照相比，hbmp2 cmrna处理组中愈伤组织形成的显著增加(图18b)。进一步分析证明，与用空海绵处理的组相比，在用hbmp2 cmrna
‑
加载的海绵处理的组中产生显著更多的纤维组织(图18c)。在骨愈合过程中，纤维组织可以引发朝向类骨质形成和骨再生的趋势 (luellmann
‑
rauch,de boecksup
è
rrieur,2008)。因此，图18d展示出在hbmp2 cmrna处理组中有更多的类骨质形成。
[0483]
为了在临床前水平测试本cmrna递送系统，已经使用hbmp2 cmrna将cmrna
‑
加载的胶原海绵应用于体内骨形成。近来已经公开了具有pei的化学修饰的bmp2 cmrna 复合物的体内骨形成作用(elangovan，同上)。
[0484]
然而，在本研究中，使用了具有pei复合物一半大小的hbmp2 cmrna阳性脂质体(表 6)，其可以改善体外细胞摄取以及体内药代动力学和生物分布(lee,biomaterials 32,2011, 744
‑
752；albanese,annual review of biomedical engineering 14,2012,1
‑
16)。然后通过真空干燥将hbmp2 cmrna阳性脂质体稳定在胶原海绵上，并且形成即用型生物产品。最后，本生物产品的功效用动物模型进行评价，证明了本技术在hbmp2 cmrna递送用于体内骨再生中的功能。
[0485]
各种研究证明使用不同的载体bmp2蛋白在骨组织工程化中的作用(meinel, biomaterials 27,2006,4993
‑
5002；kempen,biomaterials 30,2009,2816
‑
2825)。然而，目前的胶原是唯一fda批准的重组hbmp2的载体。因此，在本研究中，调查了作为稳定的hbmp2 cmrna的载体的胶原的效率。
[0486]
为执行体内实验，加载的和未加载的胶原海绵都被植入大鼠股骨缺损处。两周后，处死大鼠，并且使用μ
‑
ct和免疫组织化学评价骨形成。得到的结果与mc3t3
‑
e1细胞体外骨再生的结果相类似。μ
‑
ct结果和免疫组织化学都显示与空白胶原相比，在用hbmp2 cmrna加载的胶原处理的缺损中骨形成显著更高(图21、18a和b以及图29)。在骨(骨膜、皮层和髓质)的不同部分中的进一步分析证明，最大骨形成发生在髓质区域中(图28、图21a 和图18a)。虽然对于理想的组织工程来说，新骨应主要在皮质区域中产生，但这里这种髓质骨形成是
由于将胶原海绵放置在骨缺损中。在本研究中，加载和未加载的胶原海绵都被放置在整个骨缺损中(而不仅仅是在皮质部分中)。由于髓质区域与骨的其它部分相比含有多得多的bmsc，因此最大骨形成发生在那里。换句话说，为了看到皮质骨形成，hbmp2 cmrna
‑
加载的胶原海绵应该仅放置在皮层区域中，但是由于大鼠的骨的较小尺寸，这在大鼠模型中是不可行的。其它用重组bmp2蛋白处理相同动物模型的出版物也显示出在2 周时与皮层相比，在髓质中更多的骨形成。然而，在4周内观察到了更多的皮质骨形成(keibl, injury 42,2011,814
‑
820)。因此，在靠后的时间点的额外实验对于研究皮质区域中骨再生可以是有用的。
[0487]
进一步的组织学分析证明在hbmp2处理组中产生了显著更多的纤维组织(图18c)。这也可以被认为是骨组织形成的标志，因为在骨愈合过程中，纤维组织可以遵循至功能性纤维组织然后朝向类骨质形成的趋势(luellmann
‑
rauch,de boeck sup
è
rrieur,2008)。同样，在 hbmp2 cmrna处理组中检测到了更多的类骨质形成(图18d)。
[0488]
这些结果不同于在使用msc的体外骨再生中所见的——其中hbmp2 cmrna
‑
加载和未加载的胶原海绵对骨形成的作用几乎相同(图20b)。这种差异可能是由于体外和体内情况的差异，因为大量的因素可能影响bmp和胶原海绵对体内骨再生的作用，如小分子、生长因子和细胞因子的存在(lynch,journal of periodontology 62,1991,710
‑
716；wan, pnasa105,2008,868
‑
691；mountziaris,tissue engineering part b:reviews 14,2008, 179
‑
186)。这些因素在体外环境中不存在，因此体内结果可能不完全遵循体外结果。因此，本文所述的胶原海绵和其它载体不仅可以预加载期望的cmrna阳性脂质体，而且可以预加载小分子和细胞因子，其可以增强在海绵内msc的迁移(xu,oncology reports 23,2010, 1561
‑
1567；wu,stem cell reviews and reports 8,2012,243
‑
250)，并且从而提高转染功效。
[0489]
骨组织形态测定术的进一步结果：
[0490]
尸检后，收获股骨，从周围的软组织中释放，随后在4％多聚甲醛(pfa)中固定24小时。接下来，通过浸入分级的醇和二甲苯将样品脱水，并且最后包埋在甲基丙烯酸甲酯 (mma)中。随后准备微粉碎的切片并根据von kossa的方案染色，准备甲苯胺蓝和酒石酸耐性酸性磷酸酶(tracp)。
[0491]
钻孔区域理论上分为四个区域进行组织形态测定术。即：
[0492]
·
围绕钻孔的骨膜区域(m1)，
[0493]
·
在其中放置植入物的致密层内的可见钻孔区域(m2)，
[0494]
·
其中也放置植入物的一部分的骨髓内钻孔的区域(m3)，
[0495]
·
以及其中放置植入物的骨髓内的钻孔区域周围的限定区域(m4)。
[0496]
检查von kossa染色切片以展示矿化组织，指示新骨形成。使用该方法，在植入加载有编码hbmp
‑
2的cmrna的胶原海绵的钻孔中的区域m4中发现了每组织体积显著(使用曼
‑
惠特尼u检验，p＝0.01)更高量的矿化组织(bv/tv)，这表明了骨髓内植入物外表面处增强的骨形成。预期在该局部处骨形成，尽管造血干细胞最可能与植入物在外周表面处具有最密集接触(图30a)。
[0497]
围绕钻孔的骨膜区域(m1)展现出在植入有hbmp
‑
2编码cmrna
‑
加载的海绵的骨中总体的组织量比在仅植入空海绵的骨中更高，这表明由于功能性hbmp
‑
2的过度表达而导致
增加的成骨活性(图30b)。
[0498]
甲苯蓝染色切片的检查展示在植入加载有hbmp
‑
2编码cmrna的胶原海绵后，在致密层内的钻孔区域(m2)中显著更高的纤维组织(图30c)。此外，不仅反对(object)较高的纤维组织，而且纤维组织向类骨质的形成增加(图30d)，这表明较高形成的细胞外基质意味着作为在新发展的骨组织的前体。
[0499]
tracp染色展现在用加载有编码hbmp
‑
2的cmrna的胶原海绵处理后，在致密层区域(m2)中，每毫米骨周长显著较少的破骨细胞(n.oc/b.pm)，这表明由于钻孔的骨表面中的炎症过程，骨吸收较少(图30e)。
[0500]
实施例14.胶原海绵上真空干燥的cmrna阳性脂质体的稳定性测定。
[0501]
进行长期稳定性评估以估测作为生物产品的胶原海绵上真空干燥的cmrna阳性脂质体的保质期。为此目的，含有真空干燥的胶原海绵上met luc cmrna阳性脂质体的96孔板被真空密封并在室温下储存。在某些时间点，平板之一被用于在海绵上接种nih3t3细胞。细胞接种后24小时，测量长腹水蚤萤光素酶的表达。然后将不同时间点储存的板的表达与真空干燥后直接使用的板的表达(时间点＝0)进行比较。如图9所示，无论使用的 cmrna剂量如何，真空干燥的胶原海绵上cmrna复合物在室温下至少稳定6个月。
[0502]
本发明涉及下列表：
[0503]
表1.df
‑
gold/hbmp
‑
2cmrna阳性脂质体和以0.5∶1的铁/cmrna比(w/w)配制的 so
‑
mag6
‑
115/df
‑
gold/hbmp
‑
2cmrna磁性阳性脂质体的特征。每个值表示平均值
±
sd (n＝30)。
[0504][0505]
表2.在qrt
‑
pcr测定中使用的设计的大鼠引物的描述。
[0506][0507]
表3.在qrt
‑
pcr测定中使用的设计的人引物的描述。
[0508][0509]
表4.待采用的cmrna中的合适修饰的实例。
[0510][0511]
表5.bmp的核苷酸和氨基酸序列的数据库条目。
[0512][0513]
表6.mrna复合物的特征
[0514][0515]
本发明引用以下(附加)参考文献：
[0516]
1.balmayor,stem cell therapy for bone disorders.in:chase lg,vemuri mc(eds.) mesenchymal stem cell therapy.humana press,new york 2012,101
‑
116
[0517]
2.carmona,bone health and osteoporosis:areport of the surgeon general 2004,u.s. department of health and human services,office of the surgeon general.,rockville,md
[0518]
3.dimitriou,injury 36(12),2005,1392
‑
1404
[0519]
4.einhorn,clin orthop relat res 355,1998,7
‑
21
[0520]
5.tanner,j r soc interface 5,2010,541
‑
557
[0521]
6.tanner,proc inst mech eng h 224(12),2010,1359
‑
1372
[0522]
7.mourino,expert opin drug deliv 10(10),2013,1353
‑
1365
[0523]
8.romagnoli,clin cases miner bone metab 10(3),2013,155
‑
161
[0524]
9.bessa,j tissue eng regen med 2(2
‑
3),2008,81
‑
96
[0525]
10.bessa,j tissue eng regen med 2(1),2008,1
‑
13
[0526]
11.urist,clin orthop relat res 53,1967,243
‑
283
[0527]
12.yamaguchi,endocr rev 21(4),2000,393
‑
411
[0528]
13.keibl,injury 42(8),2011,814
‑
820
[0529]
14.katagiri,jcellbiol127(6pt1),1994,1755
‑
1766
[0530]
15.shekaran,boneregenerationusinganalpha2beta1integrin
‑
specifichydrogelasabmp
‑
2deliveryvehicle.biomaterials,2014
[0531]
16.evans,advdrugdelivrev64(12),2012,1331
‑
1340
[0532]
17.lu,jbiomaterscipolymed23(1
‑
4),2012,509
‑
526
[0533]
18.chang,neurosurgery65,2009,75
‑
81
[0534]
19.park,genether10(13),2003,1089
–
1098
[0535]
20.vantendeloo,curropinmolther9(5),2007,423
‑
431
[0536]
21.holtkamp,blood108(13),2006,4009
‑
4017
[0537]
22.kormann,natbiotechnol29(2),2011,154
‑
157
[0538]
23.mays,jclininvest123(3),2013,1216
‑
1228
[0539]
24.balmayor,bioresopenaccess2(5),2013,346
‑
355
[0540]
25.evans,eurcellmater18,2009,96
‑
111
[0541]
26.puri,jlipidres48(2),2007,465
‑
471
[0542]
27.mykhaylyk,liposomalmagnetofection.in:weissigv(ed.)liposomes,methodsinmolecularbiology,vol.605.humanapress
‑
springer,newyork2010,487
‑
525
[0543]
28.mykhaylyk,pharmres29(5),2012,1344
‑
1365
[0544]
29.inouye,proteinexprpurif88(1),2013,150
‑
156
[0545]
30.cox,jhistochemcytochem47(11),1999,1443
‑
1456
[0546]
31.lakshmipathy,stemcells22(4),2004,531
‑
543
[0547]
32.evans,tissueeng13(8),2007,1987
‑
1993
[0548]
33.dragoo,plastreconstrsurg115(6),2005,1665
‑
1673