一种辣椒育种用的制种方法与流程

1.本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种辣椒育种用的制种方法。


背景技术：

2.辣椒（capsicum annuum l.），为木兰纲、茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。果实长指状，顶端渐尖且常弯曲，未成熟时绿色，成熟后成红色、橙色或紫红色，味辣。种子扁肾形，淡黄色。目前，生物技术在辣椒遗传育种中得到了应用，推动了辣椒育种技术的发展。辣椒育种技术主要有原种育种技术、杂交育种技术、航天诱变育种技术、单倍体培养技术以及分子育种技术等，这些技术各自都有着相应的优势，也存在着一定的不足和缺陷。育种家在辣椒育种工作中经常要配置组合和少量繁种，收获的种子经常会纯度很低或者收获的种子太少。通过制种各个环节的改进来提升制种的纯度和产量非常迫切。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种辣椒育种用的制种方法。本发明所述制种方法操作简单，能够显著提高繁种种子的纯度和质量。
4.本发明提供了一种辣椒育种用的制种方法，包括以下步骤：1）将辣椒父本和母本播种，进行育苗，在所述育苗阶段，取叶片进行分子标记检测，留取纯合抗病幼苗；2）定植前，整地、施肥和起垄做畦；3）待幼苗长到六叶一心，进行定植，所述定植采用双行错位定植法，同行株距为45cm，设置父本株距35cm，母本株距40cm，行距都是50cm，配置父母本比例1:2；4）定植后，将白天温度控制在24~28℃，夜间13~17℃，进行水肥管理；5）辣椒采用三杆整枝法进行修剪；甜椒采用双杆整枝法进行修剪，门椒全部摘除，对称留果；6）植株主枝第2~5层的花开花前一天，进行去雄，去雄后，使用花粉隔离装置将去雄后的辣椒花隔离；7）取父本的花粉，对已去雄的盛开的花进行授粉，坐果后，去掉花粉隔离装置；8）待80~90%的果实转色时，进行采收，对种子进行干燥，得到辣椒种子；所述步骤1）和步骤2）没有时间先后顺序的限定。
5.优选的是，所述步骤1）中，父本比母本提早一周播种。
6.优选的是，步骤1）所述分子标记检测包括：抗黄瓜花叶病毒检测、抗烟草花叶病毒检测和抗疫病检测。
7.优选的是，所述定植前还包括用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根；所述定植后还包括立即浇透水；定植2~4d，浇水并用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行灌根；定植12~16d，浇水并施加水溶性平衡肥。
8.优选的是，步骤5）门椒全部摘除后，还包括从第二层对辣椒开始留花，掰除门椒以
下和发育不好的枝条。
9.优选的是，所述花粉隔离装置包括隔离网筒和隔离盖，所述隔离盖可拆卸的连接在所述隔离网筒的开口部；所述隔离盖包括沿所述隔离网筒径向开合的两个夹持部，两个所述夹持部闭合后能够将所述隔离盖连同所述隔离网筒一起固定在花梗上；所述夹持部上设置有与所述隔离网筒开口相匹配的连接结构；两个所述夹持部闭合后能够将所述隔离网筒连接在所述夹持部上。
10.优选的是，步骤7）所述授粉的时间为上午九点到十点。
11.优选的是，所述步骤7）还包括对未进行授粉的花和蕾全部去掉；果实生长过程中及时摘除畸形果，第2层花留果1~2个，第3~5层每层留果3~4个。
12.优选的是，所述步骤8）中，采收前，拔除母本中存在的杂株，采收时，采收父本和母本的杂交果。
13.优选的是，步骤8）所述干燥包括：夏季在纱网上晾晒，纱网距地面20cm以上，晾晒2~3d；冬季或阴天，27~32℃烘干45~50h。
14.本发明提供了一种辣椒育种用的制种方法。本发明所述方法通过对育苗、栽培管理、杂交授粉，隔离保纯、采收晾晒等环节进行具体设置，显著提高了繁种种子的纯度和质量；在定植前利用分子标记进行植株去杂，去除了杂合不纯的植株和不带抗病基因的植株，可以有效提高少量繁种种子的纯度和质量；利用辣椒育种专用花粉隔离装置能够保证花朵去雄后和坐果前不被非目标花粉污染，规范了授粉程序，可以显著降低父母本间花粉的交叉污染，提高种子纯度。
附图说明
15.图1为本发明隔离盖结构俯视图；图2为本发明隔离盖结构侧视图；图3为本发明隔离盖与隔离网筒连接俯视图；图4为本发明隔离网筒结构示意图。
16.其中，1
‑
隔离网筒，11
‑
外沿翻边，12
‑
塑料框架，13
‑
网布b；2
‑
隔离盖，21
‑
夹爪，211
‑
夹头，212
‑
手柄，22
‑
网布a，23
‑
开口圆环，24
‑
半环形卡槽。
具体实施方式
17.本发明提供了一种辣椒育种用的制种方法，包括以下步骤：1）将辣椒父本和母本播种，进行育苗，在所述育苗阶段，取叶片进行分子标记检测，留取纯合抗病幼苗；2）定植前，整地、施肥和起垄做畦；3）待幼苗长到六叶一心，进行定植，所述定植采用双行错位定植法，同行株距为45cm，设置父本株距35cm，母本株距40cm，行距都是50cm，配置父母本比例1:2；4）定植后，将白天温度控制在24~28℃，夜间13~17℃，进行水肥管理；5）辣椒采用三杆整枝法进行修剪；甜椒采用双杆整枝法进行修剪，门椒全部摘除，对称留果；6）植株主枝第2~5层的花开花前一天，进行去雄，去雄后，使用花粉隔离装置将去
雄后的辣椒花隔离；7）取父本的花粉，对已去雄的盛开的花进行授粉，坐果后，去掉花粉隔离装置；8）待80~90%的果实转色时，进行采收，对种子进行干燥，得到辣椒种子；所述步骤1）和步骤2）没有时间先后顺序的限定。
18.本发明将辣椒父本和母本播种，进行育苗，在所述育苗阶段，取叶片进行分子标记检测，留取纯合抗病幼苗。本发明优选根据当地的气象条件选取合适的播种时间，以山东为例，上半年优选选取1月上旬播种，下半年优选选取7月上旬进行播种。在本发明中，所述播种前，本发明优选对种子进行预处理。在本发明中，所述预处理优选包括选取色泽饱满的种子进行药水浸种。具体的，本发明所述药水浸种优选包括先用清水对种子浸4~5h，然后用质量百分含量为1%的硫酸铜水溶液浸5min。浸种完成后，本发明优选用清水将种子冲洗干净。在本发明中，所述育苗阶段，优选将辣椒种子播种到育苗盘中进行育苗。本发明对所述育苗盘的规格没有特殊限定，优选使用72孔育苗盘。在本发明中，所述育苗盘中优选放入消毒的基质。本发明对所述基质的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售辣椒用育苗基质即可。在本发明中，父本优选比母本提早一周播种，促进花期相遇。播种后，在种子出苗前，本发明优选保持育苗温度在25~30℃，优选每天撒一次水，使基质保持湿润。出苗后，本发明优选将温度控制在白天20~25℃，夜间15~18℃。第一片真叶出现后，本发明优选将温度控制在白天25~27℃，夜间15~20℃，同时增加光照时间，增加通风避免基质湿度过大。定植前一周，本发明优选去掉遮阳网，同时增加通风时间，进行练苗，可以避免徒长，提高苗期抗性。在育苗阶段，本发明取叶片进行分子标记检测。在本发明中，所述分子标记检测优选包括：抗黄瓜花叶病毒检测、抗烟草花叶病毒检测和抗疫病检测。本发明根据检测结果，留取纯合抗病幼苗，即选取纯合阳性的单株进行定植，纯合阴性和杂合的幼苗去掉。本发明在定植前采用分子标记检测，可有效识别出带有抗病基因的植株，效率高，用时短，且对幼苗损害小；定植前若采用病原菌直接接种法，则费时费工，操作繁琐，观察周期长，对幼苗损害大；定植前若采用辣椒幼苗期的生态学性状进行观察，则无法筛选出抗病植株，辣椒幼苗期的生态学性状太少，且性状与抗病基因不连锁。
19.本发明定植前，整地、施肥和起垄做畦。本发明定植优选在温室中进行。在本发明中，所述整地优选包括清除上茶留下的病果、烂果和植株。本发明优选每年9月份定期更换温室棚膜，保证透光性和流镝性。定植前一个月，本发明优选关闭温室风口，用百菌清熏剂进行熏棚，并进行高温闷棚14~17d，更优选15d，保证有效杀灭温室内病害，减少农药用量。在本发明中，所述施肥优选包括：在定植前一周，施加有机肥和复合肥，施肥后优选深翻。在本发明中，施加有机肥优选为每亩施加30方稻壳粪，复合肥优选每亩施加100kg。本发明所述深翻优选使用小型旋耕机进行，本发明所述深翻的次数优选为3~5次，更优选为4次。深翻后，本发明优选清除干净碎砖和杂草。在本发明中，所述垄优选宽60cm，高20cm，所述畦优选宽70cm。
20.本发明待幼苗长到六叶一心，进行定植，所述定植采用双行错位定植法，同行株距为45cm，设置父本株距35cm，母本株距40cm，行距都是50cm，配置父母本比例1:2。本发明优选选择晴天的下午定植。在本发明中，所述定植前优选还包括用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。本发明定植后，优选将白天温度控制在24~28℃，夜间13~17℃，进行水肥管理。在本发明中，所述定植后优选还包括立即浇透水；定植2~4d，更优选3d，优选浇水并用霜霉威、恶
霉灵和生根剂进行灌根；定植12~16d，优选浇水并施加水溶性平衡肥。定植后的第一次浇水，本发明优选采用大水漫灌的方式，浇透水。土壤干燥后，优选进行中耕松土，增加土壤透气性以利根系生长，还能防止土壤生杂草。在本发明中，所述浇水并用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行灌根的作用为促进辣椒快速生根，提早缓苗，预防辣椒根部病害。在本发明中，所述浇水并施加水溶性平衡肥能够给植物补充营养，促进植物生长。定植后，本发明优选还包括对辣椒进行吊蔓的操作。具体的，本发明所述吊蔓优选包括：在大棚的立柱和棚架之间用16号钢丝东西向拉紧，钢丝高度为2.2米，位置与立柱方向一致，在钢丝的上部沿畦的定植方向用18号钢丝拉紧，南北两侧连接到大棚的前棚架和后立柱上；然后在辣椒苗的正上方系上2米长的30丝号尼龙绳，下边系在辣椒的主枝上，使主枝缠绕在尼龙绳上，调整尼龙绳位置，使辣椒主枝互相展开，增加透光透气性。
21.本发明辣椒采用三杆整枝法进行修剪；甜椒采用双杆整枝法进行修剪，门椒全部摘除，对称留果。上述操作有利于培育壮棵，给花和果实提供充足营养。在本发明中，门椒全部摘除后，优选还包括从第二层对辣椒开始留花，掰除门椒以下和发育不好的枝条。本发明在摘除门椒的同时，多余的已开之花也优选摘除。
22.本发明植株主枝第2~5层的花开花前一天，进行去雄，去雄后，使用花粉隔离装置将去雄后的辣椒花隔离。最佳去雄时期是花蕾已充分膨大，花苞变为白色，花瓣即将裂开，花柱已成熟，而花药又没裂开的时候。本发明所述去雄优选从第2层花开始，去雄前，优选先清除植株上已盛开的花。本发明所述去雄的具体操作优选包括以下步骤：用左手拇指与食指和中指轻轻夹住辣椒花的基部，右手持镊子将花瓣轻轻拨开，再将镊子尖端沿花药筒基部深入，轻轻放松对镊子的夹持力，将花药撑开，然后再将花药摘除。本发明所述去雄优选必须干净彻底，同时将畸形花、小花等不良花摘除。
23.本发明所述去雄优选使用去雄授粉工具。在本发明中，所述去雄授粉工具优选包括尖头镊子、酒精、脱脂棉、培养皿和花粉隔离装置。在本发明中，所述花粉隔离装置优选包括辣椒育种专用花粉隔离装置，包括隔离网筒和隔离盖，所述隔离盖可拆卸的连接在所述隔离网筒的开口部；所述隔离盖包括沿所述隔离网筒径向开合的两个夹持部，两个所述夹持部闭合后能够将所述隔离盖连同所述隔离网筒一起固定在花梗上；所述夹持部上设置有与所述隔离网筒开口相匹配的连接结构；两个所述夹持部闭合后能够将所述隔离网筒连接在所述夹持部上。本发明所述装置能够在有效隔离花粉的基础上，拆装方便，降低工作负担，提高工作效率。如图1至图4所示，本发明提供一种辣椒育种专用花粉隔离装置，包括能够套设在辣椒花上的隔离网筒1和能夹持在辣椒花花梗上的隔离盖2，其中，隔离盖2可拆卸的连接在隔离网筒1的开口部上；需要注意的是，隔离网筒1为网状筒，其网格能够透气透水，并隔离花粉和昆虫；隔离盖2可以是网状结构，也可以是其他能够隔离花粉和昆虫的结构。隔离盖2包括沿隔离网筒1径向开合的两个夹持部，两个夹持部闭合后能够将隔离盖2连同隔离网筒1一起固定在辣椒花花梗上；夹持部上设置有与隔离网筒1开口相匹配的连接结构；两个夹持部闭合后能够将隔离网筒1连接在夹持部上。
24.当辣椒花完成去雄时，先用隔离网筒1将辣椒花套住，之后将隔离盖2的两个夹持部开启，再将夹持部移动到辣椒花花梗位置，其中，辣椒花花梗位于两个夹持部之间的空隙，然后将夹持部上设置的连接结构与隔离网筒1的开口对准，最后将两个夹持部闭合，此时，通过夹持部上设置的连接结构，实现了隔离网筒1与隔离盖2的连接，通过两个夹持部的
夹持力，实现了花粉隔离装置被固定在辣椒花花梗上；通过隔离网筒1和隔离盖2的隔离，有效隔绝了花粉和昆虫侵扰，避免非目标花粉的污染。
25.当辣椒花盛开需要授粉时，先打开闭合的两个夹持部，夹持部上设置的连接结构失效，再取下隔离网筒1；待完成授粉操作后，还可以换上另一种颜色的隔离网筒1，以此对已完成去雄和需要授粉的辣椒花进行区分，加快识别效率，提高工作效率。
26.本发明的辣椒育种专用花粉隔离装置通过采用隔离网筒1配合具有可开合夹持部的隔离盖2的结构设计，相较于现有的隔离装置，其整个工作过程只需先将隔离网筒1套设，再将隔离盖2夹持并与隔离网筒1连接即可，其中，对于隔离网筒1的连接和辣椒花花梗的夹持，是夹持部同一动作、同一时间完成的，以此极大的提高了隔离装置的安装效率，从而提高工作效率。
27.进一步的，如图1和2所示，加持部为夹爪21，两个夹爪21相互交错、镜相布置，并且转动连接；夹爪21包括夹头211和手柄212，夹头211内安装有网布a22，两个夹头211夹合后形成与隔离网筒1开口相匹配夹持网盖；两个夹爪21之间设置有为夹头211提供夹合力的弹性部；连接结构设置在夹爪21上。更进一步的，连接结构为安装在夹头211上的半环形卡槽24，两个夹头211夹合后形成与隔离网筒1开口部外沿翻边11相匹配的环形卡槽。
28.由此，隔离装置安装时，隔离网筒1套设在辣椒花外侧，通过按压两个手柄212使两个夹头211分离，将分离的两个夹头211之间的空隙对准辣椒花花梗，松开手柄212，夹头211受弹性部影响闭合，利用两个夹头211中设置的具有弹力的网布a22夹紧辣椒花花梗；并且，在两个夹头211合并的过程中，隔离网筒1开口部的外沿翻边11与两个夹头211上的半环形卡槽24对其，两个夹头211合并后完成隔离网筒1与隔离盖2的连接。其中，通过采用具有弹力的网布a22来与辣椒花花梗夹紧，一方面，用软质材料实现夹紧，在固定条允许的情况下（即隔离装置的重力小于夹紧摩擦力），能够更好的保护辣椒花花梗，进而保证辣椒花的正常生长；另一方面，网布a22使其隔离盖2能够透气透水，进而保证辣椒花的正常生长。
29.进一步的，夹头211呈半圆形结构，两个夹头211夹合后形成整圆，隔离网筒1为圆筒形结构；更进一步的，夹头211的半圆形直径为2cm，夹头211的框架宽为1cm，厚为0.15cm；隔离网筒1包括塑料框架12和编织在塑料框架12上的网布b13，塑料框架12直径为1.65cm，高度为3.5cm，隔离网筒1开口部的外沿翻边11高于隔离网筒1开口部0.1cm；网布b13开设有能够透气透水，并隔离花粉和昆虫的小孔。需要注意的，上述对于隔离装置的形状和尺寸的描述并不意味着隔离装置一定局限在上述形状和尺寸上，可以根据实际情况进行调整，例如：隔离网筒1还可以为方桶形结构、三角桶形结构等等，对应的夹头亦会作出调整。
30.进一步的，弹性部为具有弹性的开口圆环23，开口圆环23两端固定在夹头211的外壁，环体贯穿两个手柄212。需要说明的是，这里采用类似嫁接夹的弹性结构，但这并不意味着隔离装置只局限于上述设计，还可采用其他弹力布局，例如：衣架夹、书夹等等。
31.进一步的，手柄212长3cm，其表面设置有防滑层，以便操作人员操作稳定，尾端设置有用于连接信息吊牌的吊环，以便工作人员观察。
32.进一步的，网布a22和网布b13均为尼龙网布。
33.根据实际需求而进行的适应性改变均在本发明的保护范围内。
34.本发明所述隔离装置具有以下优势：（1）本发明通过采用隔离网筒配合具有可开合夹持部的隔离盖的结构设计，相较于现有的隔离装置，其整个工作过程只需先将隔离网
筒套设，再将隔离盖夹持并与隔离网筒连接即可，其中，对于隔离网筒的连接和辣椒花花梗的夹持，是夹持部同一动作、同一时间完成的，以此极大的提高了隔离装置的安装效率，从而提高工作效率。
35.（2）本发明通过采用具有弹力的网布a来与辣椒花花梗夹紧，一方面，用软质材料实现夹紧，在固定条允许的情况下（即隔离装置的重力小于夹紧摩擦力），能够更好的保护辣椒花花梗，进而保证辣椒花的正常生长；另一方面，网布a使其隔离盖能够透气透水，进而保证辣椒花的正常生长。
36.（3）本发明所采用的手柄，其表面设置有防滑层，以便操作人员操作稳定，尾端设置有用于连接信息吊牌的吊环，以便工作人员观察。
37.本发明取父本的花粉，对已去雄的盛开的花进行授粉，坐果后，去掉花粉隔离装置。在本发明中，所述授粉的时间优选为上午九点到十点。在上述授粉时间，优选选取盛开的父本，进行花粉的采集。在本发明中，优选选取花瓣展开180度，花药刚刚裂开的父本进行划分的采集。本发明所述采集优选使用培养皿进行收集，具体的，本发明用培养皿将花朵接住，然后用手轻弹花，乳白色粉末状的花粉会落到培养皿里。收集后，本发明优选在培养皿上做好标记。取完粉后，本发明进行授粉。本发明所述授粉优选包括：选取已去雄的盛开的花，确认花去雄干净，柱头没有花药和损伤，然后优选将花的柱头轻轻放到上述培养皿里的白色花粉上，使柱头占满白色花粉。授粉后，本发明优选换上另一种颜色的隔离网筒，用来区别已经授粉。坐果后，本发明优选去掉隔离网筒，只留下隔离盖以区别杂交果。授粉的操作优选要轻要稳，以免戳伤或弄断花柱。本发明所述授粉优选应足量，使柱头涂满均匀。一组父母本授粉后，优选更换培养皿，并对双手消毒。本发明所述消毒优选使用酒精，更优选的，用脱脂棉蘸取酒精擦拭双手。在本发明中，优选还包括对未进行授粉的花和蕾全部去掉（此步骤优选在杂交工作进行时和结束后进行）；果实生长过程中优选及时摘除畸形果，第2层花优选留果1~2个，第3~5层每层优选留果3~4个。本发明利用辣椒育种专用花粉隔离装置进行授粉，相对现有技术，具有操作简单，防止其他花粉污染，提高种子纯度，适合中小量辣椒种子的高纯度制种的优势。现有隔离方式具有以下缺点：父母本中间种植其他作物进行隔离，两侧相隔15m，这种方法占地较多，适合几个品种大量繁种；父母本分开种植在两个尼龙网棚内，这种方法占地较多，适合几个品种大量繁种；母本去雄杂交采后用硫酸纸袋套花进行隔离，容易落花上病，操作相对繁琐，用工较多；母本去雄杂交采后用药棉蒙花进行隔离，操作繁琐，药棉容易脱落。
38.在本发明中，果期优选进行浇水施肥：夏秋季优选：5~8d，更优选6d浇一次水；冬春季：优选10~14d，更优选12d浇一次水；授粉前，即门椒盛花期，优选浇一遍水并追施每亩18~22kg，优选20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中优选不能大水浇，以防落花；辣椒坐果后，可以浇水并追施高钾性水溶肥。在本发明中，辣椒疏果（果实生长过程中优选及时摘除畸形果，第2层花优选留果1~2个，第3~5层每层优选留果3~4个）后，当辣椒坐到顶层果后优选摘除顶尖，使植株将营养尽量供应到果实，促进果实和种子的发育。
39.本发明待80~90%的果实转色时，进行采收，对种子进行干燥，得到辣椒种子。在本发明中，采收前，优选拔除母本中存在的杂株，采收时，优选采收父本和母本的杂交果。在本发明中，母本杂株的鉴定优选通过果实的横经、纵经、颜色、果形、果实表面等性状来决定，性状不同，即认为是杂株，发现杂株须拔除。本发明在采收果实时，优选查看果实是否有辣
椒育种专用花粉隔离装置的隔离盖，有隔离盖的果实就是杂交果，需要采收取种；没有隔离盖的就是没有做杂交的，需要摘除丢掉。本发明采收果实后，优选取种子，去除杂质。本发明优选将去除杂质的种子装入网袋，不用水洗，立即干燥。在本发明中，所述干燥优选包括：夏季在纱网上晾晒，纱网距地面优选20cm以上，晾晒2~3d；冬季或阴天，优选27~32℃烘干45~50h，更优选48h。本发明待种子干燥后，优选对种子进行精选，去除杂质。然后进行装袋、编号和入库。
40.下面结合具体实施例对本发明所述的一种辣椒育种用的制种方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
41.本发明分子标记检测具体参照以下方法进行：一、辣椒疫病辣椒疫病引物名称zl6726，引物序列：f：tccagccatccattatttcat（seqidno.1）r：atcccgaactgccaataatta（seqidno.2）1pcr反应程序94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，10℃forever。
42.2聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1灌胶聚丙烯酰胺胶100ml，temed（四甲基乙二胺)100μl，aps（过硫酸铵）1000μl，缓慢摇匀（避免出现气泡）；用夹子将玻璃板两侧夹住，将上述所制凝胶混匀后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子；待胶凝固0.5~1h后，将玻璃板固定到架子上；倒入缓冲液，拔掉梳子；吸取pcr产物3μl于新的pcr板中，加6μl上样缓冲液，离心；用枪吸打加样孔（把油吹掉），点样，单孔点0.5μl。
43.2.2电泳条件：u（v）180恒压t（min）902.3银染：（一块胶）量取agno31ml，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢摇晃8min后，用无菌水冲洗至少3遍。
44.2.4显影：（一块胶）称取1.5gnaoh，量取甲醛500μl，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢震荡，5min后，用无菌水冲洗至少3遍。
45.2.5结果记录将胶捞起后平铺在观片灯上，标记好样品批次和引物名称，在观片灯箱上照相保存。
46.判定方法如下：zl6726引物对扩增片段大小为抗病195bp，感病152bp，根据50bpdnamaker对比选择条带，maker最亮条带为250bp。具体的，当出现大小为195bp的条带时，判定为此样品为纯合抗病，当出现大小为152bp的条带时，判定为此样品为纯合感病品种。当出现195bp和152bp两条带时，判定此样品为杂合抗病。
47.二、烟草花叶病毒病
烟草花叶病毒病引物名称l4sc340，引物序列f：aaggggcgttcttgagccaa（seqidno.3）r：tccatggagttgttctgcat（seqidno.4）1pcr反应程序94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，10℃forever。
48.2聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1灌胶聚丙烯酰胺胶100ml，temed（四甲基乙二胺)100μl，aps（过硫酸铵）1000μl，缓慢摇匀（避免出现气泡）；用夹子将玻璃板两侧夹住，将上述所制凝胶混匀后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子；待胶凝固0.5~1h后，将玻璃板固定到架子上；倒入缓冲液，拔掉梳子；吸取pcr产物3μl于新的pcr板中，加6μl上样缓冲液，离心；用枪吸打加样孔（把油吹掉），点样，单孔点0.5μl。
49.2.2电泳条件：u（v）180恒压t（min）902.3银染：（一块胶）量取agno31ml，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢摇晃8min后，用无菌水冲洗至少3遍。
50.2.4显影：（一块胶）称取1.5gnaoh，量取甲醛500μl，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢震荡，5min后，用无菌水冲洗至少3遍。
51.2.5结果记录将胶捞起后平铺在观片灯上，标记好样品批次和引物名称，在观片灯箱上照相保存。
52.判定方法如下：l4sc340引物对为显性标记，其扩增片段大小为抗病340bp，根据50bpdnamaker对比选择条带，maker最亮条带为250bp。具体的，当出现大小为340bp的条带时，判定为此样品可以抗病，但不能判定是否纯合，当不出现大小为340bp的条带时，判定为此样品为感病品种。
53.三、黄瓜花叶病毒病黄瓜花叶病毒病引物名称catm
‑
int1，引物序列为f：tcagcaaagaaagattcacgaac（seqidno.5）r：acgtacacttgatgatgccttgt（seqidno.6）1.pcr反应程序94℃预变性3min；94℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，10℃forever。
54.2.酶切酶切体系：buffer2μl，内切酶（hinfⅰ）1μl，pcr产物10μl，depc水7μl。
55.酶切pcr程序：37℃，120min。
56.3.聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1灌胶聚丙烯酰胺胶100ml，temed（四甲基乙二胺)100μl，aps（过硫酸铵）1000μl，缓慢摇匀（避免出现气泡）；用夹子将玻璃板两侧夹住，将上述所制凝胶混匀后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子；待胶凝固0.5~1h后，将玻璃板固定到架子上；倒入缓冲液，拔掉梳子；吸取pcr产物3μl于新的pcr板中，加6μl上样缓冲液，离心；用枪吸打加样孔（把油吹掉），点样，单孔点0.5μl。
57.3.2电泳条件：u（v）180恒压t（min）903.3银染：（一块胶）量取agno31ml，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢摇晃8min后，用无菌水冲洗至少3遍。
58.3.4显影：（一块胶）称取1.5gnaoh，量取甲醛500μl，无菌水100ml，放置于摇床上，缓慢震荡，5min后，用无菌水冲洗至少3遍。
59.3.5结果记录将胶捞起后平铺在观片灯上，标记好样品批次和引物名称，在观片灯箱上照相保存。
60.判定方法如下：catm
‑
int1引物对扩增片段大小为抗病300bp/150bp，感病496bp，根据50bpdnamaker对比选择条带，maker最亮条带为250bp。具体的，当出现大小为300bp和150bp的两条带时，判定为此样品纯合抗病，当出现大小为496bp的条带时，判定为此样品为纯合感病品种。当出现大小为300bp、150bp和496bp的三条带时，判定此样品为杂合抗病。
61.实施例1一、育苗：1、育苗时间：在山东（寿光蔬菜小镇），上半年选取1月（3日）上旬播种，下半年选取7月（8日）上旬进行播种。
62.2、种子处理播种：选取对应编号的辣椒父本种子和母本种子。选取色泽饱满的种子进行药水浸种，先将种子用清水浸4~5h，再用1%的硫酸铜溶液浸5min，取出种子用清水冲洗干净进行播种。用72孔的育苗盘和消毒的基质进行播种。父本提早播种一周，促进花期相遇。
63.本发明以csvhpm81746054为母本，以csvhpf81690012为父本，杂交获得f1代品种，先给母本去雄，待到母本的花蕾盛开后，从父本上取得花粉，授到母本已去雄的柱头上，然后果实自然发育成熟，待到转色后摘取杂交果实，收取里边的种子，即为杂交种——圣剑8号。
64.圣剑8号的品种特点：植株长势旺盛，耐高温，连续坐果性好，果实长羊角形，果长25~28cm，肩宽3.5~4.5cm，幼果绿色，成熟果红色，外表光亮，商品性好，早熟，硬度好，耐贮运，单果重100g左右，辣味浓。抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，适合春季保护地种植。
65.母本csvhpm81746054为一代杂种“山农12”辣椒品种经过6代自交分离定向选育而成的稳定自交系。该自交系主要特征特性：植株生长势旺，植株矮，节间短，坐果好，连续坐果能力强，果实长羊角形，果长20~25cm，肩宽4~5cm，果色嫩绿色，果实成熟后黄色，外
表光亮， 光滑顺直，辣味浓，具有一定耐寒性，抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，单果重 100g 左右。
66.父本csvhpf81690012为一代杂种“迅驰”辣椒品种经 8 代自交分离定向选择而成的稳定自交系。该材料主要特征特性：植株长势旺，节间稍长，果实长羊角形，果长 25~28cm，肩宽 4~5cm，果色绿色，果实成熟后红色，外表光亮，顺直，抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，单果重 100g 左右。
67.本发明还以csvspm81870001为母本，以csvspf81770005为父本，杂交获得f1代品种，先给母本去雄，待到母本的花蕾盛开后，从父本上取得花粉，授到母本已去雄的柱头上，然后果实自然发育成熟，待到转色后摘取杂交果实，收取里边的种子，即为杂交种——华丽3号。
68.华丽3号的品种特点：植株长势旺盛，耐低温，早熟品种，连续坐果性好，果实灯笼形，果长10
‑
12cm，肩宽8
‑
10cm，果色深绿色，成熟果红色，外表光亮，商品性好，硬度好，耐贮运，单果重230g左右。抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，适合春季保护地种植。
69.母本 csvspm81870001为一代杂种“皇马”方椒品种经过 7 代自交系统选育而成的稳定自交系。该自交系主要特征特性：植株长势旺，始花节位低，节间短，坐果好，连续坐果能力强，果实灯笼形，果长9~11cm，肩宽 8~10cm，成熟果黄色，果色亮丽，外表光亮，具有一定耐寒性，抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，单果重 200g 左右。
70.父本 csvspf81770005为一代杂种“怡农175”方椒品种经7代自交分离定向选择而成的稳定自交系。该材料主要特征特性：节间短，坐果好，连续坐果能力强，果实灯笼形，4心室率高，果长 10~12cm，肩宽 9~11cm，成熟果红色，果色亮丽，外表光亮，风味浓郁，具有一定耐寒性，抗烟草花叶病毒病，中抗疫病，单果重230g左右。
71.3、苗期管理：种子出苗前保持育苗室内温度25~30℃，每天撒一次水，使基质保持湿润，出苗后将温度控制在白天20~25℃，夜间15~18℃，第一片真叶出现后，将温度控制在白天25~27℃，夜间15~20℃，同时增加光照时间，增加通风避免基质湿度过大。定植前一周，要去掉遮阳网，同时增加通风时间，进行练苗，可以避免徒长，提高苗期抗性。
72.4、取样做分子标记检测：用镊子选取合适大小的幼嫩叶片取下，放到取样盒里，在对应的取样顺表里填好单株编号，取完样品后直接送到实验室进行检测，主要是抗病标记：抗黄瓜花叶病毒、抗烟草花叶病毒、抗疫病标记。根据检测结果，选取纯合阳性的单株进行定植，将纯合阴性和杂合的幼苗去掉。
73.二、整地：1、温室整理：清除干净上茬留下的病果、烂果和植株，每年9月份定期更换温室棚膜，以保证透光性和流镝性，定植前一个月，关闭温室风口，用百菌清熏剂进行熏棚，并进行高温闷棚15天，可以有效杀灭温室内病害，减少农药用量。
74.2、施肥整地：定植前一周，每亩使用30方稻壳粪，另外每亩使用100千克复合肥。再用小型旋耕机深翻4次，深度在20厘米左右。清除干净碎砖和杂草。
75.3、调畦：起垄做畦，垄宽60厘米，高20厘米，畦宽70厘米。
76.三、苗期管理1、定植：待幼苗长到六叶一心，选择在晴天的下午定植，采用双行错位定植法。合理密植，父本株距35cm，母本株距40cm，行距都是50cm，合理配置父母本比例1:2。定植前先
用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。定植后第一次要用大水漫灌的方式浇透水。
77.2、定植后管理：将温室温度控制在白天24~28℃，夜间13~17℃，3天左右进行第二次浇水，并用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行灌根，土壤干燥后要进行中耕松土，一是增加土壤透气性以利根系生长，二是防止土壤生杂草。待二周左右后，要进行浇第三水，并随水冲施水溶性平衡肥，给植株补充营养，促进植物生长。辣椒吊蔓：在大棚的立柱和棚架之间用16号钢丝东西向拉紧，钢丝高度为2.2米，位置与立柱方向一致，在钢丝的上部沿畦的定植方向用18号钢丝拉紧，南北两侧连接到大棚的前棚架和后立柱上。然后在辣椒苗的正上方系上2米长的30丝号尼龙绳，下边系在辣椒的主枝上，使主枝缠绕在尼龙绳上，调整尼龙绳位置，使辣椒主枝互相展开，增加透光透气性。
78.四、杂交授粉1、植株整理：辣椒修剪采用三杆整枝法；甜椒修剪采用双杆整枝法，门椒全部摘除，对称留果，以利于培育壮棵，给花和果实提供充足营养。第二层对椒开始留花，合适的（当母本花蕾的花瓣处于由绿转白的，且开始膨大的时候，此时花药未散开且比较容易去雄）就准备去雄。同时进行父母本整枝，掰除门椒以下和发育不好的枝条，门椒和其余已经过了去雄最佳时间的花摘除。
79.3、去雄：准备好去雄授粉工具：尖头镊子、酒精、脱脂棉、培养皿、辣椒育种专用花粉隔离装置。
80.当辣椒花完成去雄时，把隔离盖像嫁接夹似的夹在花梗上，连接上隔离网筒，可以隔绝花粉和昆虫，避免非目标花粉的污染，同时又透气透水，不影响花的开放和发育。当花盛开需要授粉时，再取下隔离网筒，完成授粉操作，换上另一种颜色的隔离网筒，对已完成去雄和需要授粉的花进行精准识别，加快工作效率。
81.去雄花蕾选用开花前1天的结实率较高。选取植株主枝第2~5层的花。最佳去雄时期应是花蕾已充分膨大，花苞变为白色，花瓣即将裂开，花柱已成熟，而花药又没裂开的时候。去雄时从第二层花开始，去雄前先清除植株上已盛开的花。用左手拇指与食指和中指轻轻夹住辣椒花的基部，右手持镊子将花瓣轻轻拨开，再将镊子尖端沿花药筒基部深入，轻轻放松对镊子的夹持力，将花药撑开，然后再将花药摘除。同时在花梗上夹上隔离盖，装上隔离网筒，带上吊牌做好标记。注意此过程中不要伤害到花的柱头和子房，留全冠。去雄必须干净彻底。同时将畸形花、小花等不良花摘除。
82.4、取粉：最佳授粉时间为上午九点到十点，选取对应父本盛开的花，花瓣展开180度，花药刚刚裂开时。用培养皿将花朵接住，然后用手轻弹花，此时可以看到乳白色粉末状的花粉会落到培养皿里。在培养皿上做好标记。
83.5、授粉：取完粉后，对应母本编号，选取已去雄的盛开的花。授粉前确认此花去雄干净，柱头没有花药和损伤，将花的柱头轻轻放到培养皿里的白色花粉上，使柱头沾满白色花粉。授完粉后换上另一种颜色的隔离网筒，用来区别已经授粉。待坐果后，去掉隔离网筒，只留下隔离盖以区别杂交果，注意此过程动作要轻要稳，以免戳伤或弄断花柱。授粉应足量，使柱头涂满均匀。一组父母本的粉授完粉后，要更换培养皿，用脱脂棉蘸取酒精擦拭双手。
84.五、果期管理杂交工作进行时和结束后，及时进行植株整枝，将未进行去雄授粉的花和蕾全部
去掉。浇水施肥：夏秋季：6天浇一次水；冬春季：12天浇一次水；授粉前既门椒盛花期，浇一遍水并追施每亩20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中不能大水浇，以防落花，辣椒坐果后，浇水并追施高钾性水溶肥。辣椒疏果：果实生长过程中发现畸形果应及时摘除，第2层花留果1~2个，之后的每层留3~4个直至第5层，辣椒坐到顶层果后要摘除顶尖，使植株将营养尽量供应到果实，促进果实和种子的发育。
85.六、采收晾晒在授粉后50~80天，待果实完全转色至八九成时进行采收。采收前，果实开始转色时，检查母本是否存在杂株，如果果实的横经、纵经、颜色、果形、果实表面等性状不同，即认为是杂株，发现杂株须拔除。在采收果实时，查看果实是否有隔离盖，有隔离盖的果实就是杂交果，需要采收取种；没有隔离盖的就是没有做杂交的，需要摘除丢掉。种子去除杂质，装入网袋，不用水洗，立即干燥。夏季放在纱网上晾晒，纱网距地面20cm以上，2~3天即可干燥，严禁暴晒。冬季或阴天，置27~32℃的高温干燥箱内烘干48小时，种子干燥后还需进行清选去除杂质。然后进行装袋、编号和入库。
86.对比例1其它条件保持不变，仅改变实施例1的第二部分第1步的操作：a. 定植前一个月，关闭温室风口，用百菌清熏剂进行熏棚b. 定植前一个月，关闭温室风口，进行高温闷棚15天结果表明，采用本发明方法，即定植前一个月，关闭温室风口，用百菌清熏剂进行熏棚，并进行高温闷棚15天，可以有效杀灭温室内病害，减少农药用量。而如果不进行此操作，后期种植管理时，会发生很多病害，增加种植成本，使种子减产。本发明能够避免发生很多病害，相对提高种子的产量和质量。
87.对比例2保持其它方法条件与实施例1相同，仅仅将实施例1第三部分第1步的条件进行不同的设置：a.采用辣椒行距50，父本株距35cm，母本株距30cm，父母本比例1:2。定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量31.9g/m2，种子平均纯度98.31%。
88.b.辣椒行距50cm，父本株距35cm，母本株距50cm，父母本比例1:2。定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量30.7g/m2，种子平均纯度99.15%。
89.c.辣椒行距50cm，父本株距25cm，母本株距40cm，父母本比例1:2。定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量30.5g/m2，种子平均纯度98.91%。
90.d.辣椒行距50cm，父本株距45cm，母本株距40cm，父母本比例1:2。定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量30.7g/m2，种子平均纯度 99.07%。
91.e. 辣椒行距50cm，父本株距35cm，母本株距40cm，父母本比例1:4，定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量31.6g/m2，种子平均纯度 99.12%。
92.f. 辣椒行距50cm，父本株距35cm，母本株距40cm，父母本比例1:3，定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量31.4g/m2，种子平均纯度 99.13%。
93.g. 辣椒行距50cm，父本株距35cm，母本株距40cm，父母本比例1:2，定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。种子平均产量32.1g/m2，种子平均纯度 99.21%。
94.h. 辣椒行距50cm，父本株距35cm，母本株距40cm，父母本比例1:2，定植前不用药
剂进行蘸根。种子平均产量30.1g/m2，种子平均纯度99.17%。
95.结果表明，辣椒定植时采用行距50cm，父本株距35cm，母本株距40cm，父母本比例1:2。定植前先用霜霉威、恶霉灵和生根剂进行蘸根。这样定植，幼苗缓苗快，不会染上（减小发生根部病害的概率）根部病害，长大后植株旺盛，父本开花多，可以提供充足的花粉，母本的花朵发育好，不会出现小花和畸形花，使种子的产量和质量最好。
96.对比例3其它条件和方法与实施例1相同，将实施例1第四部分第1步的条件进行不同的设置：a. 辣椒修剪采用三杆整枝法，只留下三个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第二层对椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量1556粒，种子平均发芽率95%。
97.b. 辣椒修剪采用四杆整枝法，只留下四个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第三层斗椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量1426粒，种子平均发芽率90%。
98.c. 辣椒修剪采用三杆整枝法，只留下三个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第一层门椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量1468粒，种子平均发芽率89%。
99.d. 甜椒修剪采用二杆整枝法，只留下两个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第二层对椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量2207粒，种子平均发芽率93%。
100.e. 甜椒修剪采用二杆整枝法，只留下两个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第三层斗椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量2056粒，种子平均发芽率92%。
101.f. 甜椒修剪采用三杆整枝法，只留下三个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第一层门椒开始留花进行去雄授粉，单株平均种子产量2137粒，种子平均发芽率87%。
102.结果表明，辣椒修剪采用三杆整枝法，只留下三个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第二层对椒开始留花进行去雄授粉，甜椒修剪采用二杆整枝法，只留下两个主枝和一级侧枝，其余的进行摘除，第二层对椒开始留花进行去雄授粉，这样操作可以保证每个果实获得充足的营养进行发育，避免产生小果或畸形果，使种子的产量和质量最高。
103.对比例4其它方法和条件如实施例1，将实施例1第五部分进行以下不同的设置：a. 杂交工作进行时和结束后，及时进行植株整枝，将未进行去雄授粉的花和蕾全部去掉。种子平均产量32.2g/m2，种子平均纯度99.2%b. 杂交工作进行时和结束后，不进行植株整枝，不摘除未进行去雄授粉的花和蕾。种子平均产量29.6g/m2，种子平均纯度82.1%c. 授粉前既门椒盛花期，浇一遍水并追施每亩20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中采用滴灌带浇少量水，不进行大水浇，以防落花，辣椒坐果后，浇水并追施高钾性水溶肥。种子平均产量32.2g/m2。
104.d. 授粉前既门椒盛花期，浇一遍水并追施每亩20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中进行大水浇。辣椒坐果后，浇水并追施高钾性水溶肥。种子平均产量26.5g/m2。
105.e. 授粉前既门椒盛花期，浇一遍水并追施每亩20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中采用滴灌带浇少量水，不进行大水浇，辣椒坐果后，浇水时不追施高钾性水溶肥。种子平均产量28.3g/m2。
106.结果表明，在杂交工作进行时和结束后，及时进行植株整枝，将未进行去雄授粉的
花和蕾全部去掉。这样操作可以使种子获得充分营养进行发育，且避免了邻近其他花粉的污染，可以明显提高种子的纯度和质量。授粉前即门椒盛花期，浇一遍水并追施每亩20kg的平衡性水溶肥，授粉过程中采用滴灌带浇少量水，不进行大水浇，可以防止落花，提高辣椒授粉坐果率，从而提高种子产量，后期浇水时追施高钾性水溶肥，可以使果实获得充足的营养，使种子产量提高。
107.对比例5其它方法和条件和实施例1相同，将实施例1第六部分进行不同条件的设置：a.夏季放在纱网上晾晒，纱网距地面20cm以上，晾晒2~3天即可干燥，严禁暴晒。种子平均发芽率95%。
108.b.夏季放在纱网上晾晒，纱网距地面20cm以上，晾晒1天即可干燥，严禁暴晒。种子平均发芽率88%。
109.c.夏季放在纱网上晾晒，纱网距地面10cm，晾晒2~3天即可干燥，严禁暴晒。种子平均发芽率92%。
110.d. 冬季或阴天，可置27~32℃的高温干燥箱内烘干48小时左右，种子平均发芽率94%e. 冬季或阴天，可置25℃的高温干燥箱内烘干48小时左右，种子平均发芽率91%。
111.f. 冬季或阴天，可置27~32℃的高温干燥箱内烘干36小时，种子平均发芽率86%。
112.结果表明，当夏天时种子放在离地20cm的纱网晾晒2~3天比较好，此时种子发芽率最高，当离地过近时，太阳照射地面温度过高，使种子干燥过度，使种子发芽率降低，且经过2~3天的时间晾晒比较好。当冬天时，27~32℃的高温干燥箱烘干48小时，种子发芽率最高，温度过低或烘干时间过短，不能使种子充分干燥，影响了种子的发芽率。所以，夏季放在纱网上晾晒，纱网距地面20cm以上，晾晒2~3天即可；冬季或阴天，可置27~32℃的高温干燥箱内烘干48小时左右，这样处理，使种子的发芽率最高，种子质量最好。
113.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。