一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法与流程

1.本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法。


背景技术：

2.枸杞(medlar)为茄科、属多年生落叶灌木的干燥果实，是药食同源的产品，具有滋补肝肾、 明目的功效。现代药理学研究一般认为枸杞的活性成分、微量元素等有药理效果。枸杞的活性 成分主要有3类，甜菜碱为其中之一。甜菜碱是一类季胺盐化合物，分子式c5h
11
no2,结构式 (ch3)3n

‑
ch2‑
coo
‑
，相对分子量117.15，是枸杞果、柄，叶中主要的生物碱之一，它在植物 体内起甲基供应体的作用。因此，甜菜碱含量的高低成为了评价枸杞好坏的重要指标之一。
3.目前，甜菜碱的测定主要依托2项农业部推广标准，即：《枸杞中甜菜碱含量的测定高效 液相色谱法》(ny/t2947
‑
2016)和《甜菜中甜菜碱的测定比色法》(ny/t1746
‑
2009)。其中，第 一种测定方法是使用高效液相色谱法(hplc)测定枸杞中的甜菜碱，枸杞中甜菜碱含量基本在 1.0％
‑
3.0％之间，采用高效液相色谱法，检出限为0.001g/100g，取样量需低于0.2g，降低了 样品的代表性；使用此方法进行了多次测定实验发现：该测定方法的提取净化步骤仅将枸杞涡 旋1min、均质2min、离心5min后上固相萃取柱，用有机试剂洗脱两次无法将甜菜碱有效分 离出来，蛋白、脂肪、色素等杂质也去除不完全，上机后杂峰多，误差大，需实验人员自己摸 索优化提取净化条件，试验难度较大；而且高效液相色谱价格较高，还必须配备固相萃取装置 和氮吹仪，使用有机试剂也必须是色谱纯，实验人员也要具备大型精密仪器设备操作经验和优 化试验方法的能力，不适合中小型企业和基层检验检测机构开展实验。第二种测定方法不适用 于枸杞中甜菜碱的测定，其前处理时间过长，仅仅用水浸泡3h，无法对甜菜碱充分提取，枸 杞中蛋白质含量在10
‑
14％，粗脂肪含量在2
‑
3％，必须要去除蛋白、脂肪、色素等干扰因素， 否则最后的沉淀物为薄膜状，无法用有机试剂溶解检测；此方法是离心后弃去上清液，留存沉 淀为目标物，可上清液无法准确移除，导致标准曲线线性较差，样品测量结果误差大，而且此 标准计算式中稀释倍数错误，导致结果相差较大，此标准不能正常使用。


技术实现要素：

4.为克服现有技术中还不能有效检测枸杞中甜菜碱含量的缺陷，本发明的目的在于提出一种 枸杞中甜菜碱的提取检测方法，能够快速、简单、准确率高地得到枸杞中甜菜碱的含量。
5.本发明目的通过以下技术方案实现：
6.一种枸杞中甜菜碱的提取测定方法，包括以下步骤：
7.s1.前处理：将枸杞果洗净、干燥，然后粉碎过筛，得到枸杞粉；
8.s2.提取：将w g枸杞粉加入v ml去离子水中，超声分散，微波加热搅拌提取，过滤， 得到提取物溶液；
9.s3.提取物的纯化：将步骤s2得到的提取物溶液加入通入co2的咪唑基离子液体中进行萃 取，静置分层，取离子液体层，然后加入冰醋酸，搅拌条件下加热后静置分层，取冰醋酸层， 加入甲苯，混合均匀，加入结晶紫指示液，得到待测液；
10.s4.标准曲线的绘制：分别配置不同浓度的甜菜碱溶液，加通入co2的离子液体中，搅拌 萃取，静置分层，取离子液体层，然后加冰醋酸，搅拌条件下加热后静置分层，取冰醋酸层加 入甲苯，混合均匀，加入结晶紫指示液，分别得到不同已知浓度的甜菜碱溶液；将所述光热电 位分析仪的光度电极放入溶液a、b、c、d、e中，滴定液为高氯酸标准滴定溶液，使用光度滴 定，滴定至终点，记录各个溶液所消耗的高氯酸标准滴定溶液的体积；按照同样方法滴定空白 样品，空白样品所消耗的高氯酸标准滴定溶液的体积，根据测得的体积绘制标准曲线；
11.s5.测定：将所述光热电位分析仪的电极放入步骤s3中待测液，按照步骤s4中相同 方法滴定至终点，记录待测液所消耗的高氯酸标准滴定溶液的体积；根据s4的甜菜碱浓 度
‑
体积标准曲线，得到所述溶液b中甜菜碱的浓度。
12.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述过筛的筛网目数为100
‑
200目。
13.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述超声功率为1500
‑
2000w，超声分散时间为 10
‑
30min；所述微波功率使提取物水溶液加热至温度为35
‑
50℃，微波加热提取时间为0.5
‑
1h。 采用超声和微波协同作用，可以促进枸杞粉中甜菜碱的溶出，本发明中超声和微波的频率、功 率和时间不宜过大过长，避免过多色素溶出。按照本发明上述微波加热条件提取，能够在减少 杂质同时提出，同时保证甜菜碱的充分提出。
14.作为本发明的进一步改进，所述离子液体为不溶于水的咪唑基离子液体，选自1
‑
丁基
‑3‑ꢀ
甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐、1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟锑酸、1
‑
己基
‑3‑
甲基咪唑四氟硼酸盐、1
‑
己基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐、1
‑
己基
‑3‑
甲基咪唑六氟锑酸盐 中的至少一种。
15.作为本发明的进一步改进，所述离子液体为1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐和1
‑ꢀ
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐的混合物，质量比为(1
‑
5)：2。发明人预料不到地发现，采用上 述两种离子液体的复配，能够明显提高甜菜碱的溶解度，而降低其他杂质的溶解度。
16.作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述co2的通气量为0.5
‑
1l/min，通气10
‑
20min， 所述加热温度为45
‑
55℃。
17.作为本发明的进一步改进，所述线性曲线的公式为y＝739.2x 2.1，r2＝0.997。
18.可选的，所述结晶紫指示液为结晶紫的无水醋酸溶液。
19.可选的，所述高氯酸标准滴定溶液的浓度为0.1
‑
0.2mol/l。
20.可选的，滴定时由紫色变为蓝绿色时，即为光度滴定的终点；光度滴定的光度电极的 光线波长为502nm。
21.本发明具有如下有益效果：本发明通过向提取物中加入不溶于水的咪唑基离子液体，通过 向离子液体中通入co2，可以显著提高离子液体的极性，同时，咪唑基离子液体中的含氮离子， 与甜菜碱具有极好的相似相溶性，使得提取物中的甜菜碱进入离子液体层，而提取物中其他的 杂质则仍然留在水层中，分液后再加入冰醋酸，进一步，加热使得离子液体中co2逸散，甜 菜碱为弱碱，更易于溶于冰醋酸中，使得甜菜碱再次复溶于冰醋酸层
中，从而实现了甜菜碱的 纯化过程，制得的供试品溶液中其他杂质含量少，进一步通过化学滴定法进行测定，能够快速、 简单、准确率高地得到枸杞中甜菜碱的含量。
附图说明
22.图1为光热电位分析仪的馈液传动单元与滴定管连接示意图。
23.图2为浓度
‑
体积标准曲线。
具体实施方式
24.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅 是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员 在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明所用咪唑离子液体均采购自商业途径，1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐cas 号为174899
‑
83
‑
3；1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐cas号为174501
‑
64
‑
5；1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑 六氟锑酸cas号为174645
‑
81
‑
9；1
‑
己基
‑3‑
甲基咪唑四氟硼酸盐cas号为244193
‑
50
‑
8；1
‑
己 基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐cas号为304680
‑
35
‑
1；1
‑
己基
‑3‑
甲基咪唑六氟锑酸盐cas号为 884659
‑
95
‑
4。
26.标准曲线的测定：
27.(1)分别配置0.005g/ml、0.010g/ml、0.015g/ml、0.020g/ml、0.025g/ml的甜菜碱的去 离子水溶液，分别取上述不同浓度的50ml甜菜碱溶液加入50ml离子液体中，向离子液体中 通入co2，co2的通气量为1l/min，通气15min，然后搅拌萃取1h，静置分层，分液，收集 离子液体层，然后加入50ml冰醋酸，边搅拌边加热至50℃离子液体中的co2逸散，离子液 体中萃取的甜菜碱返溶于冰醋酸中，静置分层，分液，收集冰醋酸层，加入70ml甲苯，混合 均匀，加入1
‑
2滴结晶紫指示液，分别得到溶液a、b、c、d、e；离子液体为1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪 唑双三氟甲磺酰亚胺盐和1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐的混合物，质量比为3：2。
28.(2)空白样品的制备：分别移取与50ml冰醋酸和70ml甲苯，将冰醋酸和甲苯混合均 匀，加入1
‑
2滴结晶紫指示液，得到空白样品；
29.(3)测定：将所述光热电位分析仪的分别电极放入溶液a、b、c、d、e中，滴定液为0.1mol/l 高氯酸标准滴定溶液，同时使用电位滴定和光度滴定，滴定至终点，记录各个溶液所消耗的高 氯酸标准滴定溶液的体积；按照同样方法滴定空白样品，空白样品所消耗的高氯酸标准滴定溶 液的体积，根据测得的体积绘制标准曲线，横坐标为浓度，单位g/ml，纵坐标为体积，单位 ml，如图2。可见，线性曲线公式为：y＝739.2x 2.1，r2＝0.997。
30.实施例1
31.参照图1，一种枸杞中甜菜碱的提取测定方法，包括以下步骤：
32.s1.前处理：将枸杞果洗净、干燥，然后粉碎过200目筛，得到枸杞粉；
33.s2.提取：将10克枸杞粉加入50ml去离子水中，超声分散20min，微波加热至温度为45℃ 搅拌提取3h，过滤，得到提取物；
34.s3.提取物的纯化：将步骤s2得到的提取物加入50ml离子液体中，向离子液体中通入co2， co2的通气量为1l/min，通气15min，然后搅拌萃取1h，静置分层，分液，收集离子液体
层， 然后加入50ml冰醋酸，边搅拌边加热至50℃离子液体中的co2逸散，离子液体中萃取的甜菜 碱返溶于冰醋酸中，收集冰醋酸层，得到溶液a；离子液体为1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑双三氟甲磺 酰亚胺盐和1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐的混合物，质量比为3：2；
35.s4.待测液的制备：在溶液a中加入70ml甲苯，混合均匀，加入1
‑
2滴结晶紫指示液， 得到溶液b
36.s5.空白样品的制备：分别移取与50ml冰醋酸和70ml甲苯，将冰醋酸和甲苯混合均匀， 加入1
‑
2滴结晶紫指示液，得到空白样品；
37.s6.测定：将所述光热电位分析仪的分别电极放入溶液b中，滴定液为0.1mol/l高氯酸标 准滴定溶液，同时使用电位滴定和光度滴定，滴定至终点，记录溶液所消耗的高氯酸标准滴定 溶液的体积；按照同样方法滴定空白样品，空白样品所消耗的高氯酸标准滴定溶液的体积，得 到如图2所示标准曲线，线性曲线公式为：y＝73.92x 2.1，r2＝0.997，测得，该溶液中甜菜碱 的含量为0.0175g/ml，因此，该枸杞粉中，甜菜碱的含量为8.75％。
38.实施例2
39.与实施例1相比，离子液体为1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，其他条件均不改 变，测试结果为甜菜碱的含量为8.71％。
40.实施例3
41.与实施例1相比，离子液体为1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐，其他条件均不改变，测试 结果为甜菜碱的含量为8.72％。
42.实施例4
43.与实施例1相比，步骤s3中加热温度为30℃，其他条件均不改变，测试结果为甜菜碱的 含量为8.64％。
44.实施例5
45.与实施例1相比，步骤s3中加热温度为70℃，其他条件均不改变，测试结果为甜菜碱的 含量为8.70％。
46.实施例6
47.与实施例1相比，步骤s3中co2的通气量为0.5l/min，通气5min，其他条件均不改变， 测试结果为甜菜碱的含量为8.62％。
48.实施例7
49.与实施例1相比，步骤s3中co2的通气量为1.5l/min，通气20min，其他条件均不改变， 测试结果为甜菜碱的含量为8.72％。
50.对比例1
51.与实施例1相比，未通入co2气体，其他条件均不改变，测试结果为甜菜碱的含量为8.16％。
52.测试例1
53.将上述枸杞粉通过离子色谱法检测甜菜碱的含量，作为标准值，检测方法按照国标 gb/t 23710
‑
2009《饲料中甜菜碱的测定离子色谱法》，测试在枸杞粉中，甜菜碱的含量 为8.77％，以此值作为枸杞粉中甜菜碱含量真实值，将实施例1
‑
7和对比例1的检测结果 与液相色谱法的检测结果进行对比，评价本发明方法的准确性。表1中准确性的计算方法 为：
[0054][0055]
表1实施例1
‑
7和对比例的检测结果比较
[0056]
组别准确性偏差(％)实施例10.23实施例20.68实施例30.57实施例41.48实施例50.80实施例61.71实施例70.57对比例16.96
[0057]
由上表可知，使用本发明所述的枸杞中甜菜碱的检测方法，检测结果与使用离子色谱 法的检测结果相比偏差较小，大致控制在2％以内，优选实施例在0.5％以内；而且本发明 检测方法不需要液相色谱等大型仪器设备即可做到令人满意的准确性。使用光度滴定，比 肉眼观察能够更准确判断滴定终点。本发明的方法适用于枸杞中甜菜碱的检测，适用性较 强，比液相色谱检测方法更为简单、快捷，具有广泛推广价值。
[0058]
实施例2、实施例3中采用单一的离子液体1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐或1
‑
丁基
‑3‑
甲基咪唑六氟磷酸盐，使得少量甜菜碱没有被溶解至离子液体层中，从而造成了 检测结果偏小。
[0059]
实施例4中加热温度偏低，使得部分co2没有被逸散完全，部分甜菜碱仍然溶解于离 子液体层中，从而造成了检测结果偏小。
[0060]
实施例5中加热温度偏高，虽然co2完全逸散，检测结果准确，但是，由于温度太高， 会造成能源动力的浪费。
[0061]
实施例6中co2通入的总量较小，使得离子液体极性不足以使全部甜菜碱溶解，从而 造成了检测结果偏小。
[0062]
实施例7中co2通入的总量较大，离子液体极性高，检测结果准确，但造成了能源动 力的浪费。
[0063]
对比例1中未通入co2气体，离子液体极性未增加，大量的甜菜碱没有溶入离子液体 层中，从而使得检测结果大大减小。
[0064]
为了便于理解本发明所使用的光热电位分析仪，现将其馈液传动单元和滴定管的结构 补充如下：
[0065]
如图1所示，所述滴定管2包括管体21和位于管体内的泵头22，用于抽打滴定液； 所述馈液传动单元1推拉泵头22，从而将滴定液抽取至管体21中或将管体21内的滴定 液注入烧杯中，烧杯中存放有待滴定液体。
[0066]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。