一株红霉素降解菌W1及其应用的制作方法

一株红霉素降解菌w1及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体为一株红霉素降解菌w1以及在土壤、水体中红霉素降解领域的应用。


背景技术：

2.红霉素属于大环内酯类抗生素，具有很强的抗菌作用，应用广泛，作用机制主要是与核糖核蛋白体的50s亚单位相结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白体的移位过程，妨碍肽链增长，抑制细菌蛋白质的合成，系抑菌剂。而且红霉素是一种多组分抗生素，临床上主要应用红霉素a，其化学结构由具有14元环的红霉内酯(erythronolide)、脱氧氨基乙糖(desosamine)和红霉糖(cladnose)3部分组成。红霉素结构稳定，很难通过水解或光解等自然降解途径去除，易在环境中不断积聚，达到一定浓度后会抑制植物生长，特别不利于农作物的生长，甚至会影响农作物的产量。但因为红霉素药效好、成本低，现已广泛应用于农业、畜牧业和水产养殖业。
3.在自然生态系统中，微生物之间的相互作用和它们对有机污染物的共代谢作用，可加快或促进有机污染物的降解；因此，利用微生物对各类有机污染物进行降解和转化极具潜力。现有的处理工艺，如曝气生物滤池，只能消减废水中的微量红霉素，若要更有效地降解环境中的红霉素残留，还要依靠特定的微生物。因此，生产中亟需筛选到可有效降解红霉素的微生物，并投入使用。但是，目前国内外针对红霉素等大环内酯类抗生素造成的污染，筛选红霉素降解菌进行治理的报道甚少，已经报道的菌种资源也非常有限，极大地阻碍了红霉素污染微生物修复技术的应用，也限制了对红霉素降解酶、降解途径等的阐明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株红霉素降解菌w1，该红霉素降解菌为聚多曲霉 (aspergillus sydowii)，该菌已于2021年07月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.23059。
5.上述诉红霉素降解菌w1对被红霉素污染的环境具有修复作用，尤其对被红霉素污染的土壤环境，以及被红霉素污染的水体具有修复作用。
6.上诉红霉素降解菌w1对土壤中的废弃红霉素具有降解作用，对水体中所含的红霉素具有降解作用，可直接应用于农田的净化处理领域。
7.上述的该红霉素降解菌w1的筛选方法，步骤如下：
8.1)从被红霉素污染的污泥中称取泥土，加入红霉素降解菌筛选液体培养基进行富集，在35
‑
40℃、150
‑
200r/min恒温摇床中培养4
‑
10天；
9.2)吸取步骤1中所得的培养基加入新的红霉素降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代3
‑
6次；
10.3)取步骤2中所得菌液在lb平板上划线分离，得到红霉素降解菌w1；
11.其中红霉素降解菌筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有红霉素 100mg/l,氯
化铵(nh4cl)0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4) 0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠(nacl) 0.35g，ph 7.0
‑
7.2；
12.pda固体培养基成分为：称取200g马铃薯切成小块，先洗净去皮再加水煮烂(煮沸20
‑
30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1l，分装锥形瓶包扎，115℃灭菌20min。
13.上述红霉素降解菌w1的优选筛选方法，步骤如下：
14.1)从被红霉素污染的污泥中称取泥土5g，加入100ml红霉素降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180r/min恒温摇床中培养5
‑
7天；
15.2)吸取步骤1中所得的培养基3ml加入新的红霉素降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4
‑
5次；
16.3)取步骤2中所得菌液在lb平板上划线分离，得到红霉素降解菌w1；
17.上述红霉素降解菌w1的干粉剂，为用使用扩大培养后的红霉素降解菌w1 培养物，经过常规方法干燥而成。
18.所述红霉素降解菌w1是按照如下所述方法筛选获得：
19.一、从江苏常州武进区被红霉素污染的污泥中称取泥土分离菌株，称取污泥 5g，加入100ml红霉素降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180r/min恒温摇床中培养5
‑
7天；然后吸取培养基3ml加入新的红霉素降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4
‑
5次，在pda平板上划线分离，经过多次分离试验筛选，最终得到一批能在以红霉素作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；
20.所述红霉素降解菌筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有红霉素100mg/l,氯化铵(nh4cl)0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4) 0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠(nacl)0.35 g，ph 7.0
‑
7.2；
21.所述pda固体培养基成分为：称取200g马铃薯切成小块，先洗净去皮再加水煮烂(煮沸20
‑
30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加15 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1l，分装锥形瓶包扎，115℃灭菌20min。
22.二、分析分离得到的不同菌株对培养基中红霉素的降解效率，筛选获得红霉素降解效果最佳的菌株。
23.具体测定方法如下：
24.1、培养基制备
25.基础盐培养基：nh4cl 0.66g，k2hpo41.5 g，kh2po40.5 g，mgso40.1 g， k2hpo41.5 g，nacl 0.35g，ph 7.0
‑
7.2；121℃灭菌20min。
26.ypd液体培养基：1溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml水中，高压115℃灭菌30min。加入100ml含20g葡萄糖溶液(葡萄糖溶液灭菌后加入)。
27.2、红霉素降解效率测定方法
28.2.1红霉素标准曲线的绘制
29.取0.5g红霉素标准品，用色谱乙腈溶解，定容至50ml容量瓶中，制成10 g/l的母液。再用色谱纯乙腈稀释母液，逐级配置10、20、50、70、100mg/l浓度的系列标准溶液，利用
高效液相色谱仪在波长210nm条件下，测定峰面积，作红霉素浓度
‑
峰面积标准曲线。
30.2.2红霉素降解率测定方法
31.取培养液，用高效液相色谱仪在波长210nm条件下，流动相为含乙腈 /0.005m k2hpo4(60/40,v/v)的混合物以0.6ml/min流速输送洗脱。进样体积为10 μl，柱温保持在35℃，测定峰面积。利用红霉素标准曲线所建立的线性回归方程计算出红霉素浓度，进一步计算得出红霉素降解率。所有实验均设置三个重复。
32.2.3通过红霉素降解菌对红霉素的降解率，得出最优菌种
33.将红霉素降解菌菌株在ypd液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，将所选菌株接种1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体)到100.0ml 含100mg/l红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，30℃培养，每12小时取样测定降解率。
34.其中，筛选得到红霉素降解菌w1对红霉素的降解效果明显，且菌株生长良好，其80h对红霉素的降解率为83.53％。
35.2.4红霉素降解菌w1对土壤中的废弃红霉素的降解
36.将红霉素降解菌w1按1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体)的接种量接种于100ml灭菌的含红霉素的废水中，经高效液相色谱仪测定该废水的红霉素的含量为55mg/l，于30℃、静置培养80h，测定红霉素降解率为：66.44％。
37.2.5红霉素降解菌w1对废水中的废弃红霉素的降解
38.将红霉素降解菌w1按1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体)的接种量接种于100ml灭菌的土壤液中，经高效液相色谱仪测定，土壤中的红霉素的含量为60mg/kg，于30℃、静置培养80h，测定红霉素降解率为68.52％。
39.菌株鉴定
40.采用振荡破碎法获得红霉素降解菌w1基因组dna，通过pcr方法对菌株 its rdna进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增its rdna 的上游引物序列为：5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3’
，下游引物序列为 5
’‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3’
。
41.pcr反应条件是：98℃预变性5min，98℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸50s，反应32个循环，10℃延伸5min。使用ncbi的blast功能在genebank 数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：聚多曲霉(aspergillus sydowii)。
42.红霉素降解菌w1its rdna序列见序列表。
43.本发明的有益效果为：
44.1.筛选出一种可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活的红霉素降解菌w1，经降解分析表明，该菌株可以在含100mg/l红霉素筛选固体培养基和液体培养基中生长良好，具有很高的红霉素降解特性。
45.2.该红霉素降解菌w1将在土壤中红霉素降解、水体污染中红霉素的降解、土壤中废弃红霉素的降解和环境污染修复中具有应用前景。
46.3.本发明红霉素降解菌的应用，有利于避免因物理或化学方法降解红霉素而造成的二次污染。
附图说明
47.图1为红霉素降解菌w1单菌落形态图。
48.图2为实施例2中红霉素降解菌w1的降解曲线图。
49.图3为实施例3中红霉素降解菌w1的降解曲线图。
50.图4为实施例4中红霉素降解菌w1的降解曲线图。
具体实施方式
51.红霉素降解菌w1的筛选过程
52.(一)、主要材料
53.1、培养基
54.红霉素筛选液体培养基成分：每1l去离子水中含有红霉素100mg/l，氯化铵(nh4cl)0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4) 0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠(nacl) 0.35g，ph 7.0
‑
7.2
55.相对应的固体培养基则在1l液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
56.pda固体培养基成分为：称取200g马铃薯切成小块，先洗净去皮再加水煮烂(煮沸20
‑
30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1l，分装锥形瓶包扎，115℃灭菌20min。
57.ypd液体培养基：1溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml水中，高压115℃灭菌30min。加入100ml含20g葡萄糖溶液(葡萄糖溶液灭菌后加入)。2、仪器设备
58.flexcycler pcr扩增仪，tanon
‑
3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，uv1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司的高效液相色谱仪。
59.(二)、红霉素降解菌w1的筛选过程
60.(1)从江苏常州武进区被红霉素污染的污泥中称取泥土分离菌株，称取污泥5g，加入100ml红霉素降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、 180r/min恒温摇床中培养5
‑
7天；然后吸取培养基3ml加入新的红霉素降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4
‑
5次，在pda平板上划线分离，经过多次分离试验筛选，最终得到一批能在以红霉素作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；
61.所述红霉素降解菌筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有红霉素 100mg/l，氯化铵(nh4cl)0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠(nacl)0.35g，ph 7.0
‑
7.2；
62.pda固体培养基成分为：称取200g马铃薯切成小块，先洗净去皮再加水煮烂(煮沸20
‑
30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1l，分装锥形瓶包扎，115℃灭菌30min。
63.(2)将培养物在pda平板上划线分离，置于30℃恒温培养箱中培养 48
‑
72小时，获得红霉素降解菌株w1单菌落形态图(见图1)；
64.下面为具体实施例部分。
65.实施例1
66.将红霉素降解菌w1在ypd液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，将所
选菌株接种1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体)到含 100.0mg/l红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中120r/min、 30℃培养80h，红霉素降解菌有明显的生长，对红霉素降解效率较高。
67.实施例2
68.将红霉素降解菌w1按1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体) 的接种量接种于100ml的无菌msm中，添加红霉素至终浓度100mg/l，置于30℃、静置培养80h，测定红霉素降解率为83.53％(见图2)。
69.实施例3
70.将红霉素降解菌w1按1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体) 的接种量接种于100ml含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素的含量为60mg/l，于30℃、静置培养80h，测定红霉素降解率为：68.52％(见图 3)
71.实施例4
72.将红霉素降解菌w1按1％(每100ml无机盐培养基内添加1g菌体) 的接种量接种于100g灭菌的土壤中，经测定，土壤中红霉素的含量为55mg/kg，于37℃恒温静置培养80h，测定红霉素降解率为66.44％(见图4)。
73.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
74.