一种酿酒酵母和乳酸杆菌在普洱茶发酵中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种酿酒酵母和乳酸杆菌在普洱茶发酵中的应用，涉及生物技术领域。


背景技术：

2.近年来在食品发酵领域，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和乳酸杆菌(lactobacillus)应用非常广泛。酿酒酵母主要应用在白酒、啤酒、果酒等酒类饮品发酵工业中以及面包、馒头等面类食品发酵中。除此以外，酿酒酵母由于其菌体含有高蛋白、微量元素和维生素等，也被制作成辅料应用于医疗保健和饲料生产领域。乳酸杆菌主要应用在乳酸饮料、发酵乳、乙醇等工业发酵中。
3.普洱毛茶在传统发酵过程中，由于需要通过茶体中内生菌在适宜的湿热环境中繁殖，产生大量的酶类对茶叶中的生物活性物质进行催化转换，经过5
‑
7周的发酵才会产生普洱熟茶。但是在现代普洱茶发酵工艺中，人们更加侧重于发酵后茶叶的色香味，而忽略其营养性、保健功能、安全性以及稳定性。因此如何提供一种应用于普洱茶工业发酵菌株，提升普洱茶品质并增强其安全性和稳定性，受到了越来越多的关注。


技术实现要素：

4.本发明提供一种酿酒酵母和乳酸杆菌在普洱茶发酵中的应用，用于克服现有技术中发酵周期长、不注重发酵后茶叶色香味、营养性、保健功能、安全性以及稳定性等问题。
5.本发明提供一种酿酒酵母和乳酸杆菌在普洱茶发酵中的应用。
6.进一步地，将所述酿酒酵母和所述乳酸杆菌分别放置于培养液中培养得到酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液，并将所述酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液接种于普洱茶原料中进行普洱茶发酵。
7.进一步地，所述酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液的接种总体积为所述普洱茶原料总质量的10％。
8.进一步地，所述酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液的体积比为1：1。
9.进一步地，所述普洱茶原料的含水量为20
‑
30％。
10.进一步地，所述发酵温度为35
‑
50℃。
11.进一步地，在普洱茶发酵过程中，维持普洱茶原料的含水量为20
‑
30％。
12.进一步地，所述酿酒酵母和乳酸杆菌通过如下方法制备得到：
13.采集普洱茶渥堆中期样品，粉碎研磨后加入无菌水，震荡后收集上清液并涂布于茶基质培养基中，纯化培养得到所述酿酒酵母和乳酸杆菌。
14.进一步地，所述茶基质培养基为添加有茶叶粉末的ypd固体培养基、pda固体培养基、lb固体培养基、na固体培养基中任一种，所述茶叶粉末由普洱茶原料研磨过筛得到。
15.进一步地，所述培养温度为30
‑
40℃，时间为3
‑
4天。
16.本发明通过筛选出酿酒酵母菌株和乳酸杆菌菌株，应用于普洱茶的发酵中，极大
的加快普洱茶的发酵速度，并且在发酵结束后茶叶中生物活性物质的含量显著性增高，抗氧化能力明显增加，提升了普洱茶的品质并增强其稳定性，使得发酵后普洱茶中功能性物质的含量更高，对于提升普洱茶品质并增强其安全性和稳定性具有重要意义。
具体实施方式
17.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1
19.本实施例提供了一种酿酒酵母和乳酸杆菌的制备方法：
20.按照gb/t 8302
‑
2013标准采集普洱茶渥堆中期样品，研磨得到茶叶粉末1g，在超净台加入10ml无菌水，充分振荡后浓度标记为10
‑1，并依次稀释至10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5；将浓度为10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5的菌悬液分别取出100μl，并涂布至四种茶基质培养基上，每个浓度以及每种培养基均设置三组重复，便于后续观察比较。待涂布液干燥后放置于30
‑
40℃培养箱中培养，每24小时观察一次。培养3
‑
4天后，将长出的单菌放在新的固体培养基上重复多次直到得到纯化菌株，再通过基因测序鉴定菌种，得到野生型酿酒酵母菌株(wt，saccharomyces cerevisiae，s.cerevisiae)和乳酸杆菌菌株(lactobacillus)，其中，野生型酿酒酵母(wt，saccharomyces cerevisiae，s.cerevisiae)菌落直径100mm，菌落呈现乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐；细胞宽度2.5
‑
10μm，长度4.5
‑
21μm，长宽比约1
‑
2之间，多为圆形、卵圆形或卵形；乳酸杆菌(lactobacillus)菌落布满整个培养皿，直径100mm，菌落呈乳白色、淡黄色，半透明，光滑性凸起，边缘整齐，宽度约2μm，长度不定，通常呈细丝状卷曲交织在一起，为革兰氏阳性菌，无运动性，不产芽孢。
21.其中茶基质培养基的制备方法为：
22.ypd固体培养基：蒸馏水950ml，bacto peptone 20g，bacto agar 15g，yeast extract 10g，过100目筛渥堆中期精细茶粉5g，高温高压灭菌后加入50ml的40％葡萄糖溶液。
23.pda固体培养基：取土豆小块200g，加入500ml蒸馏水，将土豆煮烂后过滤汤汁，在汤汁中加入20g葡萄糖，15
‑
20g bacto agar，加入蒸馏水至1000ml，过100目筛渥堆中期精细茶粉5g，高温高压灭菌。
24.lb固体培养基：bacto agar 15g，bacto tryptone 10g，nacl 10g，yeast extract 5g，过100目筛渥堆中期精细茶粉5g，加入950ml去蒸馏水混合均匀后加热灭菌。
25.na固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl 5g，琼脂糖15
‑
20g，过100目筛渥堆中期精细茶粉5g，加入1000ml蒸馏水后高温高压灭菌。
26.酿酒酵母和乳酸杆菌为本领域常规菌种。
27.实施例2
28.将所述酿酒酵母和乳酸杆菌分别放置于培养液中培养得到酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液，并将所述酿酒酵母种子液和乳酸杆菌种子液接种于普洱茶原料中进行普洱茶发酵，具体步骤如下：
29.将晒青毛茶加水至含水量达到20％
‑
30％，然后将所述酿酒酵母和乳酸杆菌种子液按体积比1:1的比例混合后接种于晒青毛茶中，按照酿酒酵母和乳酸杆菌的混合种子液体积与晒青毛茶质量比为10％的比例接种，放置于35
‑
50℃左右发酵数周。每隔一周补水至含水量20％
‑
30％。
30.酿酒酵母分泌的酶可以直接作用茶叶基质，在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及纤维素果胶酶作用下有效地将茶叶基质中多糖、蛋白质、脂肪等大分子水不溶性化合物分解成单糖、多肽、氨基酸等小分子水溶性碳水化合物；此外产生的少量乙醇可以增加普洱风味以及抑制杂菌生长。而乳酸杆菌能利用酿酒酵母的代谢产物，具有较强的代谢碳水化合物的能力，除了能产生乳酸和其他酸类化合物外，还能产生乙酰和乙酸乙酯等酯类化合物，增加普洱茶的香味。通过酿酒酵母和乳酸杆菌共同发酵，可以极大的加快晒青毛茶的发酵速度，并且在发酵结束后茶叶中生物活性物质的含量显著性增高，抗氧化能力明显增加，提高了普洱茶的品质并增强其稳定性。与传统发酵的样品相比，其活性物质的含量均有所升高。
31.经过接种野生型酿酒酵母菌株(wt，saccharomyces cerevisiae，s.cerevisiae)和乳酸杆菌菌株(lactobacillus)混合菌种发酵的普洱茶，与传统发酵样品相比，茶多糖含量提高约5.3％，茶多酚含量提高约9.9％，茶褐素含量提高约19.6％，茶氨酸含量提高约11.5％，得到汤色红浓明亮、木香明显、滋味醇厚的普洱熟茶，其品质接近三年陈普洱熟茶，普洱茶品质明显提升，并且显著缩短了发酵周期，对普洱茶品质的提升和稳定性具有重要的作用。
32.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。