一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法及其应用与流程

1.本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法及其应用。


背景技术：

2.随着人民群众健康保健意识的增强，对中成药产品的质量和安全性有了更高的要求。当归六黄汤是金元四大家之一的李东垣创制的一首名方，载于其所著的《兰室秘藏》一书中。称它为“治盗汗之圣药”，主治阴虚火旺所致的盗汗。的当归六黄汤组成为：当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄芩、黄柏、黄芪，共7味药。
3.目前当归六黄汤中有效成分如何鉴别还未见标准颁布，为了鉴别当归六黄汤处方中的黄连，宿莹在《当归六黄汤物质基准的研究》中公开了薄层色谱法，采用表小檗碱和盐酸黄连碱对照品，以正丁醇
‑
醋酸
‑
水(2：1：2)为展开剂展开后捡视。结果显如图1所示，供试品色谱中，在与表小檗碱和盐酸黄连碱对照品色谱和黄连对照药材色谱相应位置上，分别呈现相同颜色的荧光斑点，而阴性色谱在相同位置处无干扰，证明原料中投入了黄连。然而，该方法无法对处方中的黄柏进行鉴别，而黄柏又是当归六黄汤重要的原料之一。
4.因此，亟需建立一种准确率高、节约时间及成本、易于推广的方法来对当归六黄汤复方制剂及物质基准实物的黄连、黄柏的定性鉴别进行控制，以保证其质量的均一、稳定、可靠。


技术实现要素：

5.因此，本发明的目的在于解决现有技术所存在的问题，通过提供一种准确率高、节约时间及成本、易于推广的方法同时对黄柏和黄连有效成分进行鉴别，从而保证产品质量可控、稳定。
6.为此，本发明公开了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括以下步骤，
7.(1)供试品溶液的制备、对照品溶液和对照药材溶液；
8.(2)薄层色谱法检测：包括两次展开以及展开后分别检视的步骤；采用乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水为展开剂进行第一次展开，采用正丁醇
‑
水
‑
乙酸为展开剂进行第二次展开。
9.优选的，薄层色谱法检测包括如下步骤：
10.1)取供试品溶液在薄层板上点样；
11.2)采用乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水为为展开剂进行第一次展开，取出，溶剂挥发，将薄层板置于360
‑
370nm的光源下检视；
12.3)采用正丁醇
‑
水
‑
乙酸为展开剂对步骤2)检视后的薄层板进行第二次展开，取出，溶剂挥发，采用显色剂显色并在可见光下检视。
13.作为优选的实施方式，溶剂挥发的方式可以直接晾干也可以用其他常规的辅助方式，例如烘干等。
14.作为优选的实施方式，步骤1)中，采用的薄层板为硅胶g薄层板。点样体积为1
‑
10μl，优选为1
‑
5μl，更优选为1
‑
3μl。
15.作为优选的实施方式，步骤2)中，乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水的体积比为3
‑
4：3
‑
4：1
‑
2：0.6
‑
1。
16.作为优选的实施方式，步骤2)中，在第一次展开之前还包括采用浓氨试液预饱和用于展开的容器，预饱和的时间为20
‑
35min。
17.作为优选的实施方式，步骤3)中，正丁醇
‑
水
‑
乙酸的体积比为6
‑
8：1
‑
3：1
‑
3。
18.作为优选的实施方式，步骤3)中，显色剂选自碘化铋钾、磷钼酸、稀碘化铋钾试液中的至少一种。
19.作为优选的实施方式，所述步骤(1)包括，取供试品与甲醇混合，超声提取，过滤，制得供试品溶液；
20.更优选的，供试品质量与甲醇的体积之比为1.5
‑
2.5g：20ml；
21.更优选的，提取时间为20
‑
40min。
22.作为优选的实施方式，所述对照药材溶液包括黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液，优选的，所述对照药材溶液的制备方法包括：
23.取黄连对照药材和黄柏对照药材分别按照本发明任一所述的步骤(1)的方法同法制备得到黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
24.作为优选的实施方式，所述对照品溶液包括盐酸巴马汀对照品溶液和盐酸黄柏碱对照品溶液。
25.优选的，所述盐酸巴马汀对照品溶液的制备方法包括，取盐酸巴马汀对照品与甲醇混合制得浓度为0.2
‑
0.6mg/ml的对照品溶液；
26.所述盐酸巴马汀对照品溶液的制备方法包括，取盐酸黄柏碱对照品与甲醇混合制得浓度为0.2
‑
0.6mg/ml的对照品溶液。
27.优选的，所述供试品为同时含有黄连和黄柏的中药组合物或者同时含有黄连和黄柏的中药制剂；
28.优选的，所述供试品为当归六黄汤或者当归六黄汤的复方制剂。
29.其中，当归六黄汤的复方制剂是由当归六黄汤按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的复方制剂。
30.更优选的，所述当归六黄汤的复方制剂选自固体制剂、半固体制剂或者液体制剂。
31.其中，固体制剂可以但不局限于片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等；
32.半固体制剂可以但不局限于软膏剂、糊剂、乳膏剂等；
33.液体制剂可以但不局限于口服液、注射剂、乳剂、混悬剂、纳米液体制剂等。
34.根据食品药品监督管理总局起草的《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求(征求意见稿)》规定，经典名方物质基准系是指以古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。作为衡量经典名方复方制剂是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。本品在当归六黄汤古方的基础上，通过对其科学研究，合理加工，制成了当归六黄汤物质基准，保证原方的药性和药效。
35.本发明通过古代文献确定当归六黄汤标准汤剂制备方法，当归六黄汤传统汤剂的
制备，包括如下步骤：
36.(一)制备标准汤剂用原料
37.供研究和制备标准汤剂的原料包括中药材及其饮片，规格应与现行版《中国药典》要求一致。
38.(二)标准汤剂的制备
39.处方：当归1重量份、生地黄1重量份、熟地黄1重量份、黄芩1重量份、黄连1重量份、黄柏1重量份与黄芪2重量份。
40.制备方法：(1)前处理：待煎饮片除应符合临床汤剂的规格外，还应视饮片质地按中药调剂“逢壳必捣，逢籽必破”等传统经验对饮片进行必要的处理。
41.(2)浸泡：按照上述处方重量份称取当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏与黄芪，粉碎成粗粉，按照药材质量与水体积的比例为1:20加水，先浸泡，浸泡时间0
‑
60分钟。
42.(3)煎煮时间：煎煮至药液量为加水量的一半。
43.(4)滤过：应趁热进行固液分离。
44.(5)冷却：分离液应迅速冷却，以抑制成分的热分解。
45.(6)浓缩：浓缩至相对密度为1.02～1.04(60℃)的流浸膏。
46.(7)干燥：采用减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
47.本发明还提供了上述任一所述的同时鉴定黄连和黄柏成分的方法在检测中药产品质量中的应用。
48.本发明还提供了一种中药产品的质量检测方法，包括将待检测产品按照本发明任一所述的鉴定黄连和黄柏成分的方法处理。
49.在第一次展开并显色后，将供试品色谱与黄连对照药材色谱或者盐酸巴马汀对照品色谱比较，判断待检测产品中是否存在黄连。
50.在第二次展开并显色后，将将供试品色谱与黄柏对照药材色谱或者盐酸黄柏碱对照品色谱比较，判断待检测产品中是否存在黄柏。
51.若供试品色谱在与黄连对照药材色谱和盐酸巴马汀对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则证明待检测产品中存在黄连。
52.供试品色谱在与黄柏对照药材色谱和盐酸黄柏碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则证明待检测成品中存在黄柏。
53.优选的，所述中药产品为同时含有黄连和黄柏的中药组合物、中药复方汤剂或者该中药复方汤剂制成的固体制剂；
54.优选的，所述供试品选自当归六黄汤或者当归六黄汤的复方制剂。
55.更优选的，所述当归六黄汤的复方制剂选自固体制剂、半固体制剂或者液体制剂。
56.其中，固体制剂可以但不局限于片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等；
57.半固体制剂可以但不局限于软膏剂、糊剂、乳膏剂等；
58.液体制剂可以但不局限于口服液、注射剂、乳剂、混悬剂、纳米液体制剂等。
59.当归六黄汤可以直接采用各药材饮片加溶剂煎煮提取获得，也可以将饮片粉粹后加溶剂煎煮提取获得。
60.本发明技术方案，具有如下优点：
61.1.本发明所述的同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，首次利用“二次薄层展开法”，
即“先进行第一次展开后检视，然后进行第二次展开后检视”且在第一次展开和第二次展开中，分别采用特定组成的展开剂，采用同一薄层板无需第二次点样，即可同时定性鉴别出黄连和黄柏成分，避免了单独定性鉴别黄连、黄柏成分造成的资源和成本的提高，能够同时对当归六黄汤复方制剂及物质基准实物的黄连、黄柏的定性鉴别进行控制，保证其质量的均一、稳定、可靠，具有准确率高、节约时间及成本、易于推广应用的优点。
62.2.本发明所述的同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，单独采用乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水为展开剂进行展开盐酸黄柏碱rf值偏小，无法鉴定黄柏成分，单独采用正丁醇
‑
水
‑
乙酸为展开剂时，盐酸黄柏碱与另一斑点分离效果不好，导致盐酸黄柏碱的斑点辨别力差，无法同时鉴定黄柏和黄连成分；本发明先采用乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水为展开剂展开，显色，实现了黄连成分的鉴别，在不破坏薄层板的情况下，采用正丁醇
‑
水
‑
乙酸为展开剂进行二次展开，显色，既可以避免乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水单次展开时盐酸黄柏碱rf值偏小，又避免了正丁醇
‑
水
‑
乙酸单次展开时，盐酸黄柏碱受到另一斑点的干扰，不易辨别，二者呈互补关系，使得不仅可以鉴别黄柏成分，而且可以鉴别黄连成分。
63.3.本发明所述的同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，采用盐酸黄柏碱作为黄柏的薄层鉴别成分而无阴性干扰，采用盐酸巴马汀作为黄连的薄层鉴别成分而无阴性干扰。因此，本发明采用盐酸巴马汀为黄连薄层鉴别的特征斑点，盐酸黄柏碱为黄柏薄层鉴别的特征斑点。
64.4.本发明所述的同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，供试品溶液制备方法采用加“取供试品与甲醇混合，超声提取，过滤，制得供试品溶液”，制备所用的溶剂少、时间短，简单易操作。
附图说明
65.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
66.图1是现有技术中当归六黄汤物质基准的薄层鉴定色谱；其中，编号1为表小檗碱，2为盐酸黄连碱，3
‑
4为黄连对照药材，5为供试品，6为黄连阴性；
67.图2是本发明实施例1中第一次展开色谱图；
68.图3是本发明实施例1中第二次展开色谱图；
69.图4是本发明实施例2中第一次展开色谱图；
70.图5是本发明实施例2中第二次展开色谱图；
71.图6是本发明实施例3中第一次展开色谱图；
72.图7是本发明实施例3中第二次展开色谱图；
73.图8是本发明实施例4中第一次展开色谱图；
74.图9是本发明实施例4中第二次展开色谱图；
75.图10是本发明实施例5中第一次展开色谱图；
76.图11是本发明实施例5中第二次展开色谱图；
77.图12是实验例1中确定对照品的斑点位置中第一次展开色谱图；
78.图13是对比例1中晾干后可见光下检视色谱图；
79.图14是对比例1中喷以稀碘化铋钾试液后在可见光下检视色谱图；
80.图15是对比例2中方法一显色的色谱图；
81.图16是对比例2中方法二显色的色谱图；
82.图17是对比例2中方法三显色的色谱图；
83.图18是对比例4中方法一显色的色谱图；
84.图19是对比例4中方法二显色的色谱图。
具体实施方式
85.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
86.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
87.本发明中采用的药材及其饮片，规格均与现行版《中国药典》要求一致。
88.其中，下面各实施例、实验例和对比例中的当归六黄汤、当归六黄汤物质基准实物或复方制剂的制备方法如下：
89.(1)当归六黄汤的制备：分别按照当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏和黄芪的质量比为1：1：1：1：1：1：2称取当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏和黄芪，混合，粉碎成粗粉，加入20倍量水(倍量是指每克药材中加入水的毫升数)，煎煮至药液体积为加水体积的一半，过滤，得到当归六黄汤。
90.(2)当归六黄汤物质基准实物的制备：按照上述方法制得当归六黄汤，干燥，得当归六黄汤物质基准实物粉末。
91.(3)当归六黄汤复方制剂的制备：取当归六黄汤物质基准实物粉末，经粉末直接压片工艺，制得当归六黄汤的片剂。取当归六黄汤物质基准实物粉末，装入胶囊中，制得当归六黄汤的胶囊剂。
92.下面各实施例、实验例和对比例中黄连单阴性供试品粉末、黄柏单阴性供试品粉末和黄连黄柏双阴性供试品粉末的制备方法如下：
93.(1)黄连单阴性供试品粉末的制备：与当归六黄汤物质基准实物粉末同法制备，区别仅在于当归六黄汤中不添加黄连，其余原料和步骤参数均相同。
94.(2)黄柏单阴性供试品粉末的制备：与当归六黄汤物质基准实物粉末同法制备，区别仅在于当归六黄汤中不添加黄柏，其余原料和步骤参数均相同。
95.(3)黄连黄柏双阴性供试品粉末的制备：与当归六黄汤物质基准实物粉末同法制备，区别仅在于当归六黄汤中不添加黄柏和黄连，其余原料和步骤参数均相同。
96.实施例1
97.本实施例提供了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括如下步骤：
98.(1)溶液的制备
99.供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物粉末2g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
100.对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
101.阴性对照溶液制备：取黄连单阴性供试品粉末、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
102.对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱的对照品溶液(盐酸黄柏碱对照品溶液)和含0.5mg盐酸巴马汀的对照品溶液(盐酸巴马汀对照品溶液)。
103.(2)薄层色谱检测
104.1)吸取步骤(1)制得的各组溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
105.2)以体积比为4∶3∶1.5∶1的乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水为展开剂，置用浓氨试液预饱和20min的展开缸内，展开，取出，晾干，365nm光源下观察，如图2所示。结果显示，供试品色谱在与黄连对照药材色谱和盐酸巴马汀对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
106.3)步骤2)观察后的薄层板再以体积比为7：2：1的正丁醇
‑
水
‑
乙酸为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察，如图3所示。结果显示，供试品色谱在与黄柏对照药材色谱和盐酸黄柏碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
107.实施例2
108.本实施例提供了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括如下步骤：
109.(1)溶液的制备
110.供试品溶液制备：取当归六黄汤，干燥得到粉末，取该粉末2g加甲醇20ml，超声处理20min，过滤，滤液作为供试品溶液。
111.对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，按照上述“供试品溶液制备”同法制成对照药材溶液。
112.阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末1g，分别按照上述“供试品溶液制备”同法制成阴性对照溶液。
113.对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每lml各含0.5mg对照品的溶液作为对照品溶液。
114.(2)薄层色谱检测
115.1)吸取步骤(1)制得的各组溶液1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
116.2)以乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水(体积比为3∶3∶1.5∶0.8)为展开剂，置用浓氨试液预饱和25min的展开缸内，展开，取出，晾干，360nm光源下观察黄连相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图4所示。
117.3)上述薄层板再以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为6：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察黄柏相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图5所示。
118.在图4和5中，编号1为盐酸小檗碱，2为盐酸黄连碱，3为盐酸巴马汀，4为盐酸黄柏碱，5为供试品，6为黄连对照药材，7为黄柏对照药材，8为黄连单阴性对照溶液，9为黄柏单
阴性对照溶液，10为黄连黄柏双阴性对照溶液。
119.实施例3
120.本实施例提供了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括如下步骤：
121.(1)溶液的制备
122.供试品溶液制备：取当归六黄汤物质片剂，粉粹得到粉末，取该粉末1.5g加甲醇20ml，超声处理40min，过滤，滤液作为供试品溶液。
123.对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材1.5g，分别按照上述“供试品溶液制备”同法制成对照药材溶液。
124.阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末1g，分别按照上述“供试品溶液制备”同法制成阴性对照溶液。
125.对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每lml各含0.5mg对照品的溶液作为对照品溶液。
126.(2)薄层色谱检测
127.1)吸取步骤(1)制得的各组溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
128.2)以乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水(体积比为4∶3.5∶1∶0.6)为展开剂，置用浓氨试液预饱和30min的展开缸内，展开，取出，晾干，370nm光源下观察黄连相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图6所示。
129.3)上述薄层板再以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为7：1：1.5)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察黄柏相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图7所示。
130.在图6和7中，编号1为盐酸小檗碱；2为盐酸黄连碱；3为盐酸巴马汀；4为盐酸黄柏碱；5为供试品；6为黄连对照药材；7为黄柏对照药材；8为黄连单阴性对照溶液；9为黄柏单阴性对照溶液；10为黄连黄柏双阴性对照溶液。
131.实施例4
132.本实施例提供了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括如下步骤：
133.(1)溶液的制备
134.供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物粉末2g加甲醇20ml，超声处理25min，过滤，滤液作为供试品溶液。
135.对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，按照上述“供试品溶液制备”同法制成对照药材溶液。
136.阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末1g，按照上述“供试品溶液制备”同法制成阴性对照溶液。
137.对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每lml各含0.5mg对照品的溶液作为对照品溶液。
138.(2)薄层色谱检测
139.1)吸取各溶液3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上
140.2)以乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水(体积比为4∶3∶2∶1)为展开剂，置用浓氨试液预饱和35min的展开缸内，展开，取出，晾干，368nm光源下观察黄连相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图8所示。
141.3)上述薄层板再以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为8：2.5：3)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察黄柏相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图9所示。
142.在图8和9中，编号1为盐酸小檗碱；2为盐酸黄连碱；3为盐酸巴马汀；4为盐酸黄柏碱；5为供试品；6为黄连对照药材；7为黄柏对照药材；8为黄连单阴性对照溶液；9为黄柏单阴性对照溶液；10为黄连黄柏双阴性对照溶液。
143.实施例5
144.本实施例提供了一种同时鉴定黄连和黄柏成分的方法，包括如下步骤：
145.(1)溶液的制备
146.供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物粉末2g加甲醇20ml，超声处理25min，过滤，滤液作为供试品溶液。
147.对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别按照上述“供试品溶液制备”同法制成对照药材溶液。
148.阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末1g，分别按照上述“供试品溶液制备”同法制成阴性对照溶液。
149.对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀对照品，分别加甲醇制成每lml各含0.5mg的溶液作为对照品溶液。
150.(2)薄层色谱检测
151.1)吸取各溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上
152.2)以乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水(体积比为4∶3∶2∶1)为展开剂，置用浓氨试液预饱和30min的展开缸内，展开，取出，晾干，360nm光源下观察黄连相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图10所示。
153.3)上述薄层板再以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为7：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察黄柏相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图11所示。
154.在图10和11中，编号1为盐酸黄柏碱对照品溶液；2为盐酸巴马汀对照品溶液；3为黄柏对照药材溶液；4为黄连对照药材溶液；5为供试品溶液；6为当归六黄汤黄连单阴性溶液；7为当归六黄汤黄柏单阴性溶液；8为当归六黄汤黄连黄柏双阴性溶液。
155.实验例1对照品的筛选和特征斑点的确定
156.(1)确定对照品的斑点位置
157.按实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液、黄连对照药材溶液和黄连单阴性对照溶液。
158.对照品溶液的制备：分别取盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg各对照品的溶液。
159.按实施例1中步骤(2)的方法检测本实施例制得的供试品溶液、黄连对照药材溶液、黄连单阴性对照溶液和各对照品溶液，第一次展开色谱图见图12所示。
160.样品编号分别代表：1、盐酸黄柏碱；2、盐酸药根碱；3、盐酸巴马汀；4、盐酸表小檗碱；5、盐酸黄连碱；6、盐酸小檗碱；7、黄连对照药材；8、供试品；9、黄连单阴性对照溶液。
161.从图12可知，在本实验例的色谱条件下，样品1及2未检出，通过与样品3、4、5对照
品斑点位置(rf值)及颜色对比后，确定了盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱的斑点。
162.(2)选择合适的对照品
163.以实施例1两次展开后制得的色谱为研究对象。
164.表1薄层色谱检测结果表
[0165][0166]
从图3可以看出，供试品的色谱图中检出8个斑点，与样品6、8比较，除盐酸巴马汀外，其他7个斑点阴性均有干扰，因此在供试品中盐酸巴马汀是黄连薄层鉴别的特征斑点，盐酸巴马汀对照品作为鉴定黄连成分的对照品。
[0167]
从图4可以看出，供试品的色谱图中检出5个点，与样品6、8比较，盐酸巴马汀不同，但是供试品此处斑点拖尾严重，鉴别效果与第1次展开后紫外下检识比较，鉴别效果较差；与样品7、8比较，盐酸黄柏碱不同，因此在供试品中盐酸黄柏碱是黄柏薄层鉴别的特征斑点，盐酸黄柏碱作为鉴定黄柏成分的对照品。
[0168]
此外，从图3和4可以看出，只有盐酸黄柏碱才能作为黄柏的薄层鉴别成分而无阴性干扰，盐酸巴马汀才能作为黄连的薄层鉴别成分而无阴性干扰。若仅采用第1次展开只能鉴别黄连成分，无法鉴别黄柏成分。
[0169]
实验例2方法学验证
[0170]
1、仪器、试剂与试药
[0171]
仪器：数控超声波清洗机、电热恒温水浴锅、goodlook
‑
1000薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)、jj500电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)、msa6
·
6s
·
0ce
‑
dm电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
[0172]
薄层板商品名：硅胶g薄层板，厂家：烟台市化学工业研究所；规格：100
×
200cm；型号：hsg；批号：20190808。
[0173]
试剂：乙酸、甲醇、次硝酸铋、碘化钾、纯化水、三氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯、异丙
醇、三乙胺、正丁醇、石油醚(60～90℃)、乙酸丁酯、氨水均为分析纯。
[0174]
试药：当归六黄汤物质基准实物、当归六黄汤黄连单阴性供试品粉末、当归六黄汤黄柏单阴性供试品粉末、当归六黄汤黄连黄柏双阴性供试品粉末分别按照上述方法制备。
[0175]
黄连对照药材、黄柏对照药材、盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀均购自中国食品药品检定研究院。
[0176]
2、溶液的制备
[0177]
供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物2g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
[0178]
对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
[0179]
阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
[0180]
对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱的对照品溶液和含0.5mg盐酸巴马汀的对照品溶液。
[0181]
3、薄层色谱条件
[0182]
1)吸取步骤(1)制得的各组溶液3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
[0183]
2)以乙酸丁酯
‑
甲醇
‑
异丙醇
‑
水(体积比为4∶3∶1.5∶0.6)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20min的展开缸内，展开，取出，晾干，365nm光源下观察黄连相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0184]
3)上述薄层板再以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为7：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下观察黄柏相关特征，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0185]
4、不同称样量的考察
[0186]
分别称取当归六黄汤物质基准实物1.5g、2.0g、2.5g，按本实验例第2项制备各供试品溶液。鉴于黄连对照药材、黄柏对照药材色谱斑点清晰，用量合理，因此不对对照药材进行称样量的考察。
[0187]
吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，按本实验例第3项下操作。
[0188]
小结：通过对称样量的考察，供试品称样量2.0g时，薄层色谱斑点清晰，斑点大小适中，分离度佳，rf适中。
[0189]
5、不同点样量考察
[0190]
按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液，各1μl、2μl、3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，其余均按本实验例第3项下操作。
[0191]
小结：通过对点样量的考察，供试品点样量为1～3μl时，薄层色谱斑点清晰，斑点大小适中，分离度佳，rf适中。
[0192]
6、不同温湿度考察
[0193]
按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，吸取各供试品溶
液、对照药材溶液、对照品溶液3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，分别考察5～35℃高低两个温度，15～35％、35～75％、75～90％高中低三个相对湿度条件下的展开情况，具体为：(一)考察5～35℃范围内选择高低两个温度，分别为(1)温度为7.0℃，湿度为46％；(2)温度为25.3℃，湿度为46％；(二)相对湿度15～35％和75～90％范围内分别选择1个湿度条件，分别为：(1)温度为25.1℃，湿度为17％；(2)温度为25.2℃，湿度为84％。取出，晾干，其余均按本实验例第3项下操作。
[0194]
小结：不同温湿度条件下供试品均能得到良好的分离效果，该薄层色谱鉴别方法对于不同温度和湿度有较好的耐用性。
[0195]
7、不同薄层板考察
[0196]
按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，分别采用烟台市化学工业研究所、烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂、merck kgaa生产的硅胶g薄层板，吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液2μl，分别点样于上述三种薄层板上，分别按本实验例第3项下操作。
[0197]
小结：不同厂家生产的硅胶g薄层板，对当归六黄汤物质基准实物均能得到良好的分离效果，该薄层色谱鉴别方法对于不同厂家生产的薄层板有较好的耐用性。
[0198]
对比例1
[0199]
本对比例提供了一种薄层色谱的鉴别方法，包括如下步骤：
[0200]
(1)溶液的制备
[0201]
供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物粉末2.5g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
[0202]
对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
[0203]
阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
[0204]
对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱对照品的溶液。
[0205]
(2)薄层色谱检测
[0206]
1)吸取步骤(1)制得的各组溶液4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
[0207]
2)以体积比为3：3.5：1：1.5：0.5：1的环己烷
‑
乙酸乙酯
‑
异丙醇
‑
甲醇
‑
水
‑
三乙胺为展开剂，置用浓氨试液预饱和20min的展开缸内，展开，取出，分别按照如下两种方法检视，方法一：晾干后可见光下检视；方法二：晾干后，喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下检视，分别如图15和16所示。
[0208]
在图13
‑
14中，编号1为盐酸黄柏碱；2为盐酸小檗碱；3为盐酸黄连碱；4为黄连对照药材；5为黄柏对照药材；6为供试品；7为黄连单阴性对照溶液；8为黄柏单阴性对照溶液；9为黄连、黄柏双阴性对照溶液。
[0209]
结果显示，晾干后可见光下检视：盐酸黄柏碱未显斑点，而喷以稀碘化铋钾试液后在可见光下检视，盐酸黄柏碱未展开，还在原点，说明该方法无法鉴别黄柏成分。
[0210]
对比例2
[0211]
本对比例提供了一种薄层色谱的鉴别方法，包括如下步骤：
[0212]
(1)溶液的制备
[0213]
供试品溶液制备：按照上述方法制得当归六黄汤物质基准实物粉末，取该粉末2g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
[0214]
对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
[0215]
阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
[0216]
对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱对照品的溶液。
[0217]
(2)薄层色谱检测
[0218]
1)吸取步骤(1)制得的各组溶液4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
[0219]
2)以体积比为1：1的石油醚
‑
乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干。
[0220]
3)分别按照如下三种方式显色：
[0221]
方法一：晾干后可见光下检视；
[0222]
方法二：晾干后，5％香草醛浓硫酸喷雾显色，105℃加热，在可见光下检视；
[0223]
方法三：晾干后，喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下检视，结果如图17
‑
19所示。
[0224]
在图15
‑
17中，编号1为盐酸黄柏碱；2为盐酸小檗碱；3为盐酸黄连碱；4为黄连对照药材；5为黄柏对照药材；6为供试品；7为黄连单阴性对照溶液；8为黄柏单阴性对照溶液；9为黄连、黄柏双阴性对照溶液。
[0225]
结果显示，方法一显色后仅观察到原点处有黄色斑点，而方法二显色后，除样品4及5外，其他样品未展开，说明本鉴别条件未达到薄层展开鉴别的目的，方法三显色后样品未展开，说明本鉴别条件未达到薄层展开鉴别的目的。
[0226]
对比例3
[0227]
采用现有文献《成方中黄连、黄柏的薄层鉴别的研究》中一次展开的方法，实验结果发现：合方中共显示3个亮黄色的荧光斑点，其中与黄连对照药材相对应的斑点有3个，与黄柏对照药材相对应的斑点有2个；黄柏对照药材显示的这2个斑点在黄连对照药材里均可观察到，黄连、黄柏阴性相互干扰，黄柏无专属性鉴别成分，在合方中鉴别的时候，不能确定黄柏是否投料。
[0228]
对比例4
[0229]
本对比例提供了一种薄层色谱的鉴别方法，包括如下步骤：
[0230]
供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物2g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
[0231]
对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
[0232]
阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
[0233]
对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱的对照品溶液、含0.5mg盐酸小檗碱的对照品溶液和含0.5mg盐酸黄连碱的对照品溶液。
[0234]
3、薄层色谱条件
[0235]
1)吸取步骤(1)制得的各组溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
[0236]
2)以正丁醇
‑
醋酸
‑
水(体积比为2：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干。
[0237]
3)分别采用如下两种方式显色：
[0238]
方式一：直接在可见光下检视，盐酸黄柏碱不显斑点，无法检测黄柏，只能鉴别黄连中盐酸黄连碱。
[0239]
方式二：喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下检视，观察黄柏相关特征，结果显示，盐酸黄柏碱受到另一斑点的干扰，在供试品中不易辨别，因此，无法检测黄柏，只能鉴别黄连中盐酸黄连碱。
[0240]
见图18
‑
19所示，编号1为盐酸黄柏碱；2为盐酸小檗碱；3为盐酸黄连碱；4为黄连对照药材；5为黄柏对照药材；6为供试品；7为黄连单阴性对照溶液；8为黄柏单阴性对照溶液；9为黄连、黄柏双阴性对照溶液。
[0241]
对比例5
[0242]
本对比例提供了一种薄层色谱的鉴别方法，包括如下步骤：
[0243]
供试品溶液制备：取当归六黄汤物质基准实物2g加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。
[0244]
对照药材溶液制备：取黄连、黄柏对照药材2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别制成黄连对照药材溶液和黄柏对照药材溶液。
[0245]
阴性对照溶液制备：取黄连单阴性、黄柏单阴性供试品粉末、黄连黄柏双阴性供试品粉末2g，分别加甲醇20ml，超声处理30min，过滤，分别黄连单阴性溶液、黄柏单阴性溶液、黄连黄柏双阴性溶液。
[0246]
对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每lml含0.5mg盐酸黄柏碱的对照品溶液、含0.5mg盐酸小檗碱的对照品溶液和含0.5mg盐酸黄连碱的对照品溶液。
[0247]
3、薄层色谱条件
[0248]
1)吸取步骤(1)制得的各组溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。
[0249]
2)以正丁醇
‑
水
‑
乙酸(体积比为7：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干。
[0250]
3)分别采用如下两种方式显色：
[0251]
方式一：直接在可见光下检视，盐酸黄柏碱不显斑点，无法检测黄柏。
[0252]
方式二：喷以稀碘化铋钾试液，在可见光下检视，盐酸黄柏碱受到另一斑点的干扰，不易辨别，且薄层板无法再进行第二次展开，无法同时检测黄柏和黄连。
[0253]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。