虾青素提取物治疗2型糖尿病的方法与系统与流程

1.虾青素提取物对肥胖相关疾病(如2型糖尿病)治疗领域，尤其涉及验证虾青素提取物对2型糖尿病治疗的可行性。


背景技术：

2.研究显示，糖尿病已经成为一种严重威胁人类健康的内分泌代谢性疾病。在糖尿病患者中，ii型糖尿病占95％以上。ii型糖尿病主要是由外周胰岛素抵抗和b细胞分泌功能减退两者交互作用所致。单纯存在胰岛素抵抗并不必然导致ii型糖尿病。因此，理想的ii型糖尿病的治疗手段应该兼顾以上两种发病机理。
3.虾青素化学名称为3，3
′-
二羟基-4，4
′-
二酮基-β，β
′-
胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，是迄今为止人类发现自然界最强的抗氧化剂，具有多种生理功效，具有促进细胞再生能力，其降血糖作用尤为显著，且无明显副作用，不良反应低，耐受性好，对糖尿病的治疗有着重要的作用。
4.虾青素提取物具有显著降低糖尿病小鼠血糖的作用。可能与它高效清除人体内的自由基有关，但其作用机制仍需进一步研究，通过测定胰岛素受体底物p-irs-1的蛋白表达水平，再则探测虾青素提取物对小鼠成肌细胞株(c2c12)胰岛素敏感性的影响，为2型糖尿病的治疗提供理论依据。
5.目前，国内外证实虾青素提取物效果及作用机制是采用野生型、adipor1-/-、 adipor2-/-、adipor1-/-adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠做对照实验，通过检测各传导通路活性、相关基因检测，验证虾青素提取物对2型糖尿病的改善作用。虾青素提取物显著降低了甘油三酸酯含量和氧化应激，减少编码促炎细胞因子基因的表达水平。其中 adipor1-/-、adipor2-/-、adipor1-/-adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠来源少、价格昂贵，不适实合实验室推广。我们采用的是廉价的c57bl/6小鼠，通过虾青素提取物对ampk所介导的信号通路影响检测来达到同样的效果，适合实验室推广。


技术实现要素：

6.为了克服adipor1-/-、adipor2-/-、adipor1-/-adipor2-/-双敲除小鼠和db/db小鼠动物模型难以实现问题，本发明提前构建2型糖尿病小鼠模型，进一步对小鼠进行各项指标检测。组织学水平，对比观察普通小鼠对照组(nc)、ii型糖尿病小鼠组(dm)、给低剂量虾青素提取物小鼠组(dm l)、给高剂量虾青素提取物小鼠组(dm h)的组织特征；细胞水平，虾青素提取物改善c2c12细胞胰岛素敏感性；分子水平，对各组小鼠血清中相关指标进行生化检测，重点监测肝脏中各项相应指标含量，测定各组小鼠血胰岛素含量；基因水平，检测肝脏中糖代谢相关酶pepck mrna，c2c12细胞中glut4 mrna表达的测定；综合检测虾青素提取物对 pi3k/akt信号通路影响。
7.本发明通过构建2型糖尿病小鼠模型克服了β细胞基因敲除小鼠的高成本问题，简化了验证虾青素提取物对肥胖相关疾病(如2型糖尿病)治疗效果实验。为虾青素提取物疗
效的验证性实验提供一种新型、简便的方法与系统，一定程度上推动虾青素提取物开发和临床治疗的进展，具有良好的推广性和可行性。
具体实施方式
8.1.2型糖尿病小鼠模型的制备和分组处理及组织学检查
9.使用12周大的雄性c57bl/6小鼠40只(购自中国科学院上海实验动物中心)，40只spf 级雄性c57bl/6小鼠(适应性喂养1周，随机分为正常对照nc组10只和实验组30只，nc组给予常规饲料，实验组给予高糖高脂(md12031(gm％/kacl％)蛋白质19.2/20脂肪4.30/10 碳水化合物67.3/70微量元素9.20/0)饮食喂养。5周后，禁食12h，腹腔注射1％链脲佐菌素40mg/kg诱导糖尿病模型，72h后禁食4h，断尾取血测fpg。血糖浓度＞11.8mmol/l，且出现多饮、多食、多尿症状提示糖尿病鼠模型诱导成功。给药虾青素分模型对照(dm)组、模型 低剂量组(dm l)组、模型 高剂量(dm h)组、普通对照nc组。使用生理盐水水溶解虾青素(浓度为0.04g/ml)，dm l组小鼠灌胃0.21g/kg.d-1虾青素，dm h组小鼠灌胃0.42g/kg.d-1虾青素，nc、dm组则灌胃等量生理盐水。14d后，将小鼠禁食6h，称量小鼠体重，断尾取血测量空腹血糖(fbg)，摘眼球取血0.6ml血样，离心后取上清于干净的离心管中，分别检测空腹血清葡萄糖(fbg)取各组肝脏标本并编号。一部分肝脏组织予4％多聚甲醛固定后用于组织包埋24-48h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切成4微米切片，将切片后的肝脏组织进行he染色，镜下观察并拍照各组肝脏组织形态变化。其余肝脏组织标本分装后液氮速冻后保存于-80℃冰箱冷冻保存。
10.2.用全自动生化仪检测相关指标：
11.(1)血清中各组谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)及碱性磷酸酶(alp)的指标。
12.(2)血清中各组甘油三酯(tg)、血糖(glu)的变化，用elisa试剂盒检测胰岛素(ins) 和游离脂肪酸(ffa)含量。
13.3.肝脏中糖代谢相关酶g6pc、pepck mrna含量测定
14.用elisa试剂盒检测葡萄糖-6磷酸酶(g6pc)含量的测定，采用trizol一步法提取小鼠肝组织总rna，逆转录合成cdna，操作遵照试剂盒说明书，用实时荧光定量pcr测定肝磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)mrna表达，以β-actin为内参。pepck上游引物：5
’-
tgaaag gcc gca cca tgt at-3’；pepck下游引物：5
’-
gca cag ata tgc cca tcc ga-3’。β
ꢀ-
actin上游引物：5
’-
aac agt ccg cct aga agc ac-3’；β-actin下游引物：5
’-
cgt tgacat ccg taa aga cc-3’。反应体系20μl：sybr green(2
×
)10μl，10μmol/l上下游引物各0.4μl，ddh2o7.2μl，模板0.2μl。反应条件：95℃变性30s；循环40次：95℃变性 5s，55℃退火30s，72℃延伸34s；融解：95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s；冷却：60℃ 15s。
15.4.虾青素提取物改善c2c12细胞胰岛素敏感性的测定
16.(1)c2c12的培养：加入含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，置于37℃、含5％co2的培养箱中培养，隔日换液，待细胞生长至70％～80％融合时按1∶3传代。
17.(2)c2c12诱导分化：c2c12细胞达80％左右融合时，传代接种于六孔板中，待生长至 80％～90％融合时，换用含2％马血清的dmem培养基诱导分化4d，每24小时换液一次；4天后 90％以上成为成熟骨骼肌细胞用于实验。
18.(3)葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基中葡萄糖水平
19.给药组在细胞分化后分别加入含50ug/ml的虾青素提取物、20ug/ml的虾青素提取物、 20ug/ml胰岛素以及20ug/ml虾青素提取物 20ug/ml pi3k和20ug/ml胰岛素 20ug/ml pi3k 的2％hs dmem培养基，同时设立空白组、不含细胞的dmem组。温育12h后再将培养基移出并用葡萄糖氧化酶法检测培养基中的含糖量。用dmem组含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是12h各孔细胞的葡萄糖消耗量，并且收集细胞提取总rna。
20.(4)rt-pcr法检测glut4 mrna表达
21.采用trizol一步法提取各组细胞的总rna，取1μl总rna为模板逆转录，引物由上海生工合成glut4和β-actin单核酸引物。glut4上游：5
’-
gcccgaaagag-3’，下游：5
’ꢀ-
actaagagcaccgagaccaa-3’，扩增产物长312bp。β-actin上游：5
’-
cgtgcgtgagattaaagag
ꢀ-3’
，下游：5
’-
ctggaaggtggacagtgag-3’，扩增产物长435bp。扩增条件：95℃ 5min预变性，然后95℃ 45s，58℃45s，72℃ 45s进行35个循环，再以72℃延伸10min，再以 72℃延伸10min。反应完成后取1μl pcr产物，10ul sybr green，上下游引物各0.8ul，7.4ulddh20，荧光定量仪检测。
22.附图说明：图1是体外实验路线图
23.图2是提前构建2型糖尿病小鼠模型，监测肝脏中各项相应指标线路图。