普洱姜花挥发油在制备抗菌或抗炎的药物中的应用的制作方法

botanical garden press,2000；vol.24:322
–
377)。普洱姜花因其美丽芳香的花朵而被广泛栽培作为观赏植物。来自姜花属植物的挥发油已被证明在制药领域具有巨大的应用潜力。然而，目前还没有关于普洱茶挥发油的化学成分和药理活性的相关报道，这可能会阻碍其开发和利用。


技术实现要素：

5.本发明的目的：提供普洱姜花挥发油在制备抗菌或抗炎的药物中的应用，开拓了普洱姜花挥发油的新用途，为制备抗菌或抗炎的药物提供了新选择。
6.本发明还发现了普洱姜花挥发具有广谱抗菌特性以及抑制脂多糖诱导的促炎介质(no)和促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)的产生和改善二甲苯致耳肿胀的作用，并对普洱姜花挥发油的化学成分进行了鉴定。
7.本发明采取的技术方案如下：
8.普洱姜花挥发油在制备抗菌或抗炎的药物中的应用。
9.普洱姜花挥发油在制备抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的药物中的应用。
10.普洱姜花挥发油在制备改善脂多糖lps诱导的raw264.7细胞中促炎介质no和促炎细胞因子tnf
‑
α和il
‑
6异常中的应用。
11.普洱姜花挥发油在制备改善二甲苯致耳肿胀的药物中的应用。
12.把普洱姜花挥发油和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、脂肪乳剂、栓剂、滴丸或软膏剂剂型的药物。
13.普洱姜花挥发油的制备方法，将鲜的普洱姜花地下根茎粉碎，将粉碎的原料与蒸馏水按1:2～1:5g/ml的料液比混合，在挥发油提取器中水蒸汽蒸馏3～5h，收集挥发油，无水硫酸钠除水，得到普洱姜花挥发油。
14.通过采用上述技术方案，本发明首次发现了普洱姜花挥发油在治疗细菌感染和炎症相关疾病方面的新用途，为制备抗菌或抗炎的药物提供了新选择，在制药行业具有重要的应用价值。
附图说明
15.图1为普洱姜花地下根茎挥发油的gc
‑
ms色谱图；
16.图2为普洱姜花挥发油对raw264.7(小鼠巨噬细胞)和l929(小鼠成纤维细胞)的细胞毒性；
17.图3为普洱姜花挥发油对lps诱导的raw264.7细胞系的细胞形态以及no、il
‑
6和tnf
‑
α产生的影响；
18.图4为普洱姜花挥发油对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀度的影响。
具体实施方式
19.本发明的实施例：将鲜的普洱姜花地下根茎(采收地：云南省临沧市；由贵州大学胡国雄教授鉴定)粉碎，将粉碎的原料与蒸馏水按1:4的料液比混合，将混合物料在挥发油提取器中水蒸汽蒸馏4h，收集挥发油，无水硫酸钠除水，得到普洱姜花挥发油，密封保存于4℃冰箱。
20.本实施例普洱姜花挥发油的化学成分：通过gc
‑
ms鉴定普洱姜花挥发油的化学成分。gc
‑
ms分析条件：进样量2μl，色谱柱为hp
‑
5ms(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)弹性石英毛细管柱，初始温度70℃(保留2min)，以2℃/min升温至180℃，再以10℃/min升温至310℃(保留14min)，运行时间：84min；汽化室温度250℃；载气为高纯he(99.999％)；柱前压18.53psi，载气流量1.0ml/min，分流比10：1，溶剂延迟时间：6.0min；离子源为ei源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70ev；发射电流34.6μa；倍增器电压1847v；接口温度280℃；质量范围29～500amu。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对nist2017和wiley275标准质谱图，确定化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。普洱姜花地下根茎挥发油的化学成分如图1和表1所示，共鉴定了34种化学成分，占总峰面积的98.2％，其中主要的化学成分为芳樟醇(linalool，26.5％)、β
‑
蒎烯(β
‑
pinene，18.6％)、γ
‑
萜品烯(γ
‑
terpinene，12.1％)、4
‑
松油醇(terpinen
‑4‑
ol，7.7％)、α
‑
蒎烯(α
‑
pinene，5.8％)、桧烯(sabinene，4.9％)、e
‑
橙花叔醇(e
‑
nerolidol，4.1％)和对
‑
聚伞花素(p
‑
cymene，3.6％)。
21.表1普洱姜花地下根茎挥发油的化学成分
[0022][0023]
a
化合物：按从hp
‑
5ms色谱柱洗脱的顺序排列。
[0024]
b
计算ri(保留指数)根据hp
‑
5ms色谱柱上的正烷烃(c8
‑
c22)计算。
[0025]
c
数据库ri(保留指数)来自数据库的nist 2017和wiley 275。
[0026]
d tr：trace(trace<0.1％)。
[0027]
药理实例1：普洱姜花挥发油对3种革兰氏阳性菌株(金黄色葡萄球菌atcc 6538p、
粪肠球菌atcc 19433和枯草芽孢杆菌atcc 6633)和3种革兰氏阴性菌株(变形杆菌accc 11002、铜绿假单胞菌atcc 9027和大肠杆菌cicc 10389)的抗菌活性的测试。
[0028]
抑菌圈直径(the diameter of the inhibition zone，diz)采用滤纸片扩散法测定(biomed res int.2021,2021:5562461)。将100μl细菌悬浮液(1
×
106cfu/ml)均匀涂抹在mueller
‑
hinton琼脂培养基上。随后，将含有20μl的挥发油(100mg/ml溶解于乙酸乙酯)或链霉素(100μg/ml溶解于蒸馏水)的滤纸片(直径6mm)放置在琼脂培养基表面。在37℃下孵育24h后，测量并记录抑菌圈(diz)的直径(包括6mm滤纸片)。
[0029]
最小抑菌浓度(the minimal inhibitory concentration,mic)和最小杀菌浓度(the minimal bactericidal concentration,mbc)通过半倍稀释法测定(front pharmacol.2020,11:572659)。100μl细菌悬液(2
×
105cfu/ml)和半倍稀释的样品溶液(100μl)加入到96孔板的每个孔中。在37℃下孵育24h后，每孔加入刃天青(resazurin)溶液(20μl,0.1mg/ml)并在37℃下避光孵育2h。mic值定义为没有颜色变化的最小样品浓度。为了确定mbc值，将来自96孔板中没有颜色变化的培养基(10μl)均匀涂抹在mueller
‑
hinton琼脂培养基上，并在37℃下再培养24h。mbc值定义为没有细菌生长的最小样品浓度。
[0030]
通过测量抑菌圈直径(diz)、最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)值来评估挥发油对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的抗菌活性。链霉素用作阳性对照。如表2所示，普洱姜花挥发油显示出广谱抗菌特性，diz值范围为7.44至10.30mm，粪肠球菌(mic＝3.13mg/ml、mbc＝3.13mg/ml)、枯草芽孢杆菌(mic＝3.13mg/ml、mbc＝3.13mg/ml)，金黄色葡萄球菌(mic＝6.25mg/ml、mbc＝12.50mg/ml)，变形杆菌(mic＝3.13mg/ml、mbc＝6.25mg/ml)，铜绿假单胞菌(mic＝6.25mg/ml、mbc＝12.50mg/ml)和大肠杆菌(mic＝6.25mg/ml、mbc＝12.50mg/ml)。芳樟醇作为普洱姜花挥发油的最主要成分，已被证明是具有卓越的抗菌活性，可以通过干扰细胞膜和细胞壁的功能和完整性，诱导细胞的泄漏和能量代谢紊乱(molecules.2021,26:245)。因此，普洱姜花挥发油可用作制药行业中天然抗菌剂。
[0031]
表2普洱姜花地下根茎挥发油的抑菌活性
[0032][0033]
a
菌株：粪肠球菌(enterococcus faecalis,atcc 19433)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis,atcc 6633)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,atcc 6538p)、变形杆菌(proteus vulgaris,accc 11002)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,atcc 9027)、大肠杆菌(escherichia coli,cicc 10389)。
[0034]
b diz：抑菌圈的直径(mm)包括滤纸片直径(6mm)。用乙酸乙酯稀释的挥发油溶液(测试体积：20μl，100mg/ml)；用蒸馏水稀释的链霉素溶液(测试体积：20μl，100μg/ml)作为
阳性参考。
[0035]
c mic：最小抑菌浓度；mbc：最小杀菌浓度。
[0036]
药理实例2：普洱姜花挥发油对lps诱导的raw264.7的影响(体外抗炎实验)
[0037]
采用mtt法评估普洱姜花挥发油(essential oil，eo)对raw264.7(小鼠巨噬细胞)和l929(小鼠成纤维细胞)的细胞毒作用(j immunol methods.1983,65:55
–
63)。raw264.7和l929细胞分别在dmem培养基和rpmi 1640培养基中培养，并补充10％胎牛血清、100μg/ml链霉素、100u/ml青霉素和2mm谷氨酰胺。将普洱姜花挥发油溶解在dmso中，然后用培养基连续半倍稀释，最终dmso浓度不高于0.5％。将细胞悬液(100μl)加入96孔板中(2
×
104cells per well)，并在37℃的5％co2培养箱中培养24h。随后，将稀释的普洱姜花挥发油溶液(100μl)加入到每个孔中继续培养24h。然后，加入10μlmtt溶液(5mg/ml溶解于pbs)并再孵育4h。最后用dmso(150μl)溶解甲臜晶体后，在490nm处测量吸光度以评估细胞活力。
[0038]
如图3所示，不同剂量的普洱姜花挥发油(0、31.25、62.5、125、250、500μg/ml)孵育24h后，通过mtt测定法测量对raw264.7和l929细胞的细胞毒性。与未处理的细胞相比，浓度为31.25～250μg/ml的普洱姜花挥发油对raw264.7和l929细胞未产生显著的细胞毒性。因此，普洱姜花挥发油的无细胞毒性浓度31.25～250μg/ml用于后续实验。
[0039]
将raw264.7细胞悬液(100μl)加入96孔板(2
×
104cells per well)中孵育24h。随后，将细胞暴露于100μl含有普洱姜花挥发油的新鲜培养基中。培养2h后，每孔加入100μl脂多糖(lps)溶液，终浓度为1μg/ml并培养24h。通过leica dmi8显微镜(leica microsystems，germany)观察raw264.7细胞的细胞形态变化。离心收集上清液后，使用no检测试剂盒(beyotime，shanghai，china)检测上清液中no的积累量。raw264.7细胞的促炎细胞因子(il
‑
6和tnf
‑
α)使用各自的elisa测定试剂盒(multi sciences biotech co.,ltd.,hangzhou,china)进行测定。地塞米松(dxm，20μg/ml)作为阳性对照。
[0040]
通过lps诱导的raw264.7细胞炎症细胞模型检测普洱姜花挥发油的抗炎作用。普洱姜花挥发油处理后，raw264.7细胞的形态变化在显微镜相差下观察(图3a)。对照组的细胞呈圆形，表面光滑。经lps处理的raw264.7细胞体积变大且形状不规则，而普洱姜花挥发油处理组的细胞形态变化较小。
[0041]
如图3b～3d所示，普洱姜花挥发油显著抑制了lps诱导的raw264.7细胞中促炎介质(no)和促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)的产生。地塞米松(dxm，20μg/ml)作为阳性参照。如图3b所示，与lps组(7.88
±
0.27μm)相比，普洱姜花挥发油显著降低了no的产生。尤其是在62.5、125、250μg/ml剂量的普洱姜花挥发油预处理的raw264.7细胞中的no产量分别降低至1.01
±
0.05μm(93.84
±
0.93％)、0.98
±
0.06μm(94.16
±
1.07％)、0.61
±
0.03μm(99.23
±
0.26％)，低于dxm(2.11
±
0.15μm,78.76
±
2.31％)。此外，与lps组(3335.91
±
216.38pg/ml)相比，普洱姜花挥发油在浓度为31.25μg/ml(2910.24
±
62.13pg/ml)、62.5μg/ml(2689.24
±
68.85pg/ml)、125μg/ml(2649.58
±
80.41pg/ml)和250μg/ml(131.58
±
3.51pg/ml)下，显著降低了lps诱导的raw264.7细胞中tnf
‑
α的产生(图3c)。特别是，普洱姜花挥发油在250μg/ml(97.14
±
0.11％)的抑制率超过了dxm(67.36
±
3.67％,20μg/ml)。如图3d所示，与lps组(832.51
±
29.29pg/ml)相比，普洱姜花挥发油预处理组上清液中il
‑
6的积累明显减少。特别是普洱姜花挥发油的浓度为62.5μg/ml(441.36
±
30.58pg/ml,46.98
±
3.67％)、125μg/ml(417.90
±
36.80pg/ml,49.80
±
4.42％)和250μg/ml(146.36
±
1.35pg/
ml,82.42
±
0.16％)时对lps诱导的il
‑
6分泌的抑制作用超过dxm(551.63
±
17.62pg/ml,33.74
±
2.12％)。促炎因子(no、il
‑
6和tnf
‑
α)在炎症性疾病中起着至关重要的作用，因此抑制它们的产生已成为炎症相关疾病的治疗策略(j ethnopharmacol.2013,149:162
–
168)。芳樟醇作为普洱姜花挥发油的最主要成分，已经被证实在体外和体内抑制lps诱导的il
‑
6和tnf
‑
α的分泌，可以成为治疗炎症相关疾病的潜在候选物(j surg res.2013,180:e47
–
e54)。以上结果表明普洱姜花挥发油可以作为天然的抗炎剂。
[0042]
药理实例3：普洱姜花挥发油对二甲苯诱导的耳肿胀的影响(体内抗炎实验)
[0043]
炎性小鼠采用小鼠耳廓肿胀法造模，昆明种小鼠共60只，随机分为6组，雌雄各半，每组10只；分别建立空白对照组、模型组、地塞米松组(7.5mg/kg)及普洱姜花挥发油(essential oil，eo)的低(3.75g/kg)、中(7.5mg/kg)、高(15mg/kg)剂量组。每天给药一次，药液体积为20ml/kg，连续7天灌胃给药。分组情况具体如下：
[0044]
空白对照组：每天给药相同体积含dmso的生理盐水；
[0045]
模型组：每天给药相同体积含dmso的生理盐水；
[0046]
阳性药物组(地塞米松，dexamethasone，dxm)：每天给药7.5mg/kg；
[0047]
低剂量组：每天给药3.75mg/kg；
[0048]
中剂量组：每天给药7.5mg/kg；
[0049]
高剂量组：每天给药15mg/kg。
[0050]
小鼠适应3d后开始试验，各给药组连续7天灌胃给药，每天给药一次，其中正常组给予等体积含dmso的生理盐水灌胃，于末次给药后1h进行实验。除空白对照组外，在小鼠左耳前、后两面均匀涂抹二甲苯30μl，右耳不作处理，用于自身对照；小鼠被致炎30min后，脱臼处死小鼠，剪下小鼠双耳，使用8mm直径的电动耳肿打耳器在小鼠左、右耳相同部位打下耳片，称重。记录左、右耳片重量，计算肿胀度和耳肿抑制率。
[0051]
肿胀度＝左耳质量
‑
右耳质量
[0052]
耳肿抑制率(％)＝(模型组肿胀度
‑
给药组肿胀度)/模型组肿胀度
×
100％
[0053]
如表3和图4所示，二甲苯诱导的小鼠耳廓明显肿胀，普洱姜花挥发油对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀有一定的剂量依赖的抑制作用。与模型组比较(肿胀度：14.89
±
1.58mg)，地塞米松组(dxm，肿胀度：7.26
±
1.09)的抑制作用显著(p＜0.01)，且普洱姜花挥发油的高(肿胀度：6.55
±
1.06mg)、中(肿胀度：8.86
±
0.96mg)、低(肿胀度：9.56
±
0.83mg)剂量组均抑制作用显著(p＜0.05)；尤其是普洱姜花挥发油的高剂量组与地塞米松组作用相当，肿胀度和抑制率均无显著性差异(p＞0.05)。综上所述，普洱姜花挥发油对二甲苯诱导的耳肿胀的有显著的抑制效果，在体内具有显著的抗炎作用。
[0054]
表3普洱姜花挥发油对二甲苯诱导的耳肿胀的抑制效果(mean
±
sd,n＝10)
[0055][0056]
注：同一列中不同字母代表具有显著性差异(p＜0.05)；(
‑
)表示没有。
[0057]
综合以上药理实例，普洱姜花挥发油对革兰氏阳性菌株(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌株(变形杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌)均具有显著的抗菌活性，显示出广谱抗菌特性；普洱姜花挥发油在无细胞毒性下，显著抑制lps诱导的raw264.7细胞中促炎介质(no)和促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)的产生，且对二甲苯诱导的耳肿胀的有显著的抑制效果，在体内、外均具有显著的抗炎作用。