一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法与流程

1.本发明涉及医学技术领域，具体为一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法。


背景技术：

2.奶牛在保障人类营养与健康中做出了重大的贡献，同时它对产业链和循环经济也具有重要的拉动作用，因此奶业已成为评价一个国家畜牧业发展程度的重要标志。众所周知，奶牛乳腺炎是影响奶牛养殖业发展的三大疾病之一，不仅严重影响了奶牛的健康，给奶牛养殖业造成了巨大的损失，还严重损害了产奶量和生乳的品质，制约了乳业的发展，甚至进一步影响人类的健康。据统计，世界奶牛患乳腺炎的比例约有1/3，每年因为乳腺炎造成经济损失高达350亿美元。
3.奶牛乳房炎主要是由条件致病菌引起的一种复杂的炎症反应，研究表明，大肠杆菌作为一种常见的革兰氏阴性细菌，在乳腺炎发生、发展过程中具有十分重要的作用。而lps作为大肠杆菌内毒素的主要成分，可以引起严重的免疫应答，分泌大量的炎性因子，进而损伤乳腺组织，促进了炎症的发生和发展。
4.抗生素作为目前防治乳腺炎的主流药物，在乳腺炎的防治过程中发挥了重要的作用，但是由于抗生素常伴有药物残留问题，并导致人体药物耐受，对人体健康有害，加之人们对健康内涵理解程度的加深，以及对食品品质的不断追求，有机奶、无抗奶成为人们对绿色、安全、健康牛奶饮用的新要求，抗生素防治乳腺炎逐渐被限制或被禁用由此迫使人们去寻找更加安全的抗生素替代品用于防治奶牛乳腺炎。
5.中药在我国具有悠久的历史，与抗生素相比具有绿色、安全、副反应少、刺激性小等多种优点，并且能避免药物残留和人体耐受现象的出现，日益受到医疗工作者的广泛关注。但是现有的治疗乳腺炎的中药方剂不仅存在治疗周期长，操作不方便等缺点，还存在组成成分较为复杂，成本高昂，制备工艺繁琐等问题，同时全身用药进入动物机体后药物的有效成分被破坏，分布到乳腺组织中的有效浓度就更低了，严重的限制了中药方剂在乳腺治疗中的广泛应用。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，本发明具有来源广泛，容易获得，不会产生耐药性，对于乳腺炎治疗具有明显效果等特点。
8.(二)技术方案
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂，包括以下重量份数配比的原料：薄荷醇4g，紫花地丁50g，蒲公英50g，冰片2g。
10.为配合上述中药膏剂的使用，现提供一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备方
法：第一步，准备干燥干净的原料药，并对每种原料药进行研磨粉碎；
11.第二步，取50g蒲公英干燥粉末和50g紫花地丁干燥粉末，加入1000ml的75％乙醇浸泡过夜，将浸泡过夜的混合物进行超声处理1h，然后过滤回收三次，最后合并滤液，将滤液加入到旋转蒸发器中，对滤液进行浓缩处理，使滤液浓度浓缩至1g/ml，随后加入羧甲基纤维素钠4g，制成胶体溶液；
12.第三步，量取20ml液体石蜡，将研磨完全的薄荷醇4g与冰片晶体2g溶于液体石蜡中得到混合物；
13.第四步，将第二步中得到的胶体溶液与第三步中得到的混合物加入到380g热溶解的凡士林中融合，搅拌均匀，冷却至室温后包装。
14.为配合上述中药膏剂的使用，现提供一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的应用方法：s1、选取15只spf级的品系为icr的小鼠，小鼠的年龄为8
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9周龄，对小鼠进行合笼，每笼两雌一雄，选择分娩后3
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7天的小鼠，将小鼠随机分为3组，分别为空白对照组(对照组)，乳腺炎模型组(乳腺炎组)，乳腺炎模型 中药膏剂治疗组(治疗组)，每组五只小鼠；
15.s2、试验前准备浓度为0.2mg/ml的lps，使用无菌生理盐水溶解，随后通过腹腔注射戊巴比妥(45mg/kg)的方式进行麻醉并固定，通过乳内注射lps的方式建立乳腺炎模型；
16.s3、在构建乳腺炎模型12h后，开始通过涂抹的方式给药，每天一次，共计给药三天；
17.s4、在给药完成后，进行乳腺组织的收集，取一部分新鲜的乳腺组织进行石蜡切片的制备，随后对石蜡切片进行h&e染色，用于观察乳腺组织的病理损伤情况；
18.s5、取一部分乳腺组织进行炎性因子表达水平的检测，采用elisa检测方式检测乳腺组织中炎性因子il
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1β、il
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6和tnf
‑
α的表达水平，以评估乳腺组织中炎症反应的严重程度；
19.s6、取一部分乳腺组织用于髓过氧化物酶(mpo)活性的检测，通过检测mpo活性水平高低反应中性粒细胞等白细胞在乳腺组织内的浸润情况，以评估乳腺组织炎症反应的严重程度；
20.s7、取一部分乳腺组织进行炎性因子mrna表达水平的检测，采用荧光定量pcr检测炎性因子cox
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2、inos、il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α在乳腺组织中的mrna的表达水平，以评估乳腺组织中炎症反应的严重程度。
21.优选的，所述小鼠乳腺炎模型的建立方法为：首先通过腹腔注射戊巴比妥(45mg/kg)将小鼠麻醉后固定，其次，用75％酒精给小鼠第四对乳腺周围进行消毒，然后，用微量注射器向小鼠的第四对乳头中分别注射50μl的lps(0.2mg/ml)，最后，收集乳腺组并于
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80℃冰箱保存。
22.优选的，所述石蜡切片的制作方法为：收集新鲜的乳腺组织，将其浸泡在4％的甲醛溶液中固定24h后，转移至70％的乙醇中保存，将组织在不同浓度的酒精中进行脱水处理，随后在二甲苯中进行透明处理，通过浸蜡、包埋和切片等步骤制作石蜡切片。
23.优选的，乳腺组织中炎性因子的检测方法为：取乳腺组织称重后置于2ml ep管中，按照每100mg的组织加入4000μl hepes sti的比例加入hepes sti溶液，在研磨仪中研磨10min，随后在4℃离心机中13000r/min离心30min，取上清液稀释10倍后，使用elisa试剂盒进行il
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1β、il
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6和tnf
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α炎性因子表达水平的检测。
24.优选的，乳腺组织中髓过氧化物酶(mpo)活性的检测方法为：取乳腺组织称重后置于2ml ep管中，按照每100mg的组织加入4000μl的比例加入0.5％ctac溶液，在研磨仪中研磨10min，随后在4℃离心机中13000r/min离心30min，取上清液稀释10倍后进行髓过氧化物酶(mpo)活性的检测。
25.优选的，乳腺组织中炎性因子mrna表达水平的检测方法为：将新鲜的乳腺组织装入1.5ml的ep管并加入trizol后研磨，随后提取乳腺组织中的总rna，并反转录为cdna，本操作以20μl体系为单位，分别加入正向引物1μl，反向引物1μl，稀释10倍后的cdna模板8μl，以及pcr mix荧光染料10μl，随后放入荧光定量pcr仪器中进行检测，获取实验数据后进行乳腺组织中炎性因子mrna表达情况的分析。
26.(三)有益效果
27.与现有技术相比，本发明提供了一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，具备以下有益效果：
28.1、该用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，通过乳腺组织石蜡切片、h&e染色的方法，评估了乳腺组织的损伤情况，证明了该中药膏剂能够缓解小鼠乳腺组织的损伤，抑制了乳腺组织炎性细胞浸润以及乳腺腺泡的萎缩。有力的说明了本中药膏剂能减轻乳腺的病理损伤，对lps诱导的小鼠乳腺炎具有良好的治疗作用。
29.2、该用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，通过髓过氧化物酶(mpo)活性检测的实验方法，检测乳腺组织的mpo活性的高低能反映中性粒细胞等白细胞在组织内的浸润情况，本实验中通过该中药膏剂治疗后，小鼠乳腺组织的mpo活性水平显著降低，实验结果表明该中药膏剂对lps诱导的乳腺炎具有良好的治疗作用。
30.3、该用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，炎性因子的表达水平的高低能够反应炎症反应的程度，本实验通过elisa和荧光定量pcr对炎性因子的表达水平及其mrna的转录水平进行了检测，表明本中药膏剂的治疗能够显著降低乳腺组织内炎性因子的表达和转录，实验结果证实了，该中药膏剂能显著降低lps诱导的小鼠乳腺组织的炎症反应，对小鼠乳腺炎具有良好的治疗作用。
31.4、该用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备及应用方法，由纯天然产物过程，通过在患病部位涂抹给药的方式，使药物直达患病部位，不仅能够直接作用于患病部位，而且能够避免抗生素治疗带来的不利影响。本膏剂具有方便携带、成分无害、抗炎效果明显、细菌不易产生耐药性、不产生抗生素残留以及直接作用于患病部位等优点。
附图说明
32.图1为本发明中药膏剂对乳腺组织病理学损伤的影响的示意图；
33.图2为本发明中药膏剂对乳腺组织病理学损伤的损伤评分；
34.图3为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子il
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1β表达水平的影响示意图；
35.图4为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子il
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6表达水平的影响示意图；
36.图5为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子tnf
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α表达水平的影响示意图；
37.图6为本发明中药膏剂在lps诱导的乳腺炎模型中mpo活性的影响示意图；
38.图7为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子cox
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2的rna表达水平的影响示意图；
39.图8为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子inos的rna表达水平的影响示意图；
40.图9为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子il
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1β的rna表达水平的影响示意图；
41.图10为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子il
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6的rna表达水平的影响示意图；
42.图11为本发明中药膏剂对lps诱导的乳腺炎模型中炎性因子tnf
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α的rna表达水平的影响示意图。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.请参阅图1
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11，本发明公开了一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂，包括以下重量份数配比的原料：薄荷醇4g，紫花地丁50g，蒲公英50g，冰片2g。
45.为配合上述中药膏剂的使用，现提供一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的制备方法：第一步，准备干燥干净的原料药，并对每种原料药进行研磨粉碎；
46.第二步，取50g蒲公英干燥粉末和50g紫花地丁干燥粉末，加入1000ml的75％乙醇浸泡过夜，将浸泡过夜的混合物进行超声处理1h，然后过滤回收三次，最后合并滤液，将滤液加入到旋转蒸发器中，对滤液进行浓缩处理，使滤液浓度浓缩至1g/ml，随后加入羧甲基纤维素钠4g，制成胶体溶液；
47.第三步，量取20ml液体石蜡，将研磨完全的薄荷醇4g与冰片晶体2g溶于液体石蜡中得到混合物；
48.第四步，将第二步中得到的胶体溶液与第三步中得到的混合物加入到380g热溶解的凡士林中融合，搅拌均匀，冷却至室温后包装。
49.并且为了配合上述药物使用，还提供了一种用于治疗乳腺炎的中药膏剂的应用方法：s1、选取15只spf级的品系为icr的小鼠，小鼠的年龄为8
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9周龄，对小鼠进行合笼，每笼两雌一雄，选择分娩后3
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7天的小鼠，将小鼠随机分为3组，分别为空白对照组(对照组)，乳腺炎模型组(乳腺炎组)，乳腺炎模型 中药膏剂治疗组(治疗组)，每组五只小鼠；
50.s2、试验前准备浓度为0.2mg/ml的lps，使用无菌生理盐水溶解，随后通过腹腔注射戊巴比妥(45mg/kg)的方式进行麻醉并固定，通过乳内注射lps的方式建立乳腺炎模型；
51.s3、在构建乳腺炎模型12h后，开始通过涂抹的方式给药，每天一次，共计给药三天；
52.s4、在给药完成后，进行乳腺组织的收集，取一部分新鲜的乳腺组织进行石蜡切片的制备，随后对石蜡切片进行h&e染色，用于观察乳腺组织的病理损伤情况；
53.所述石蜡切片的制作方法为：收集新鲜的乳腺组织，将其浸泡在4％的甲醛溶液中固定24h后，转移至70％的乙醇中保存，将组织在不同浓度的酒精中进行脱水处理，随后在二甲苯中进行透明处理，通过浸蜡、包埋和切片等步骤制作石蜡切片。
54.s5、取一部分乳腺组织进行炎性因子表达水平的检测，采用elisa检测方式检测乳腺组织中炎性因子il
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1β、il
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6和tnf
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α的表达水平，以评估乳腺组织中炎症反应的严重程度；
55.乳腺组织中炎性因子的检测方法为：取乳腺组织称重后置于2ml ep管中，按照每100mg的组织加入4000μl hepes sti的比例加入hepes sti溶液，在研磨仪中研磨10min，随后在4℃离心机中13000r/min离心30min，取上清液稀释10倍后，使用elisa试剂盒进行il
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1β、il
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6和tnf
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α炎性因子表达水平的检测。
56.s6、取一部分乳腺组织用于髓过氧化物酶(mpo)活性的检测，通过检测mpo活性水平高低反应中性粒细胞等白细胞在乳腺组织内的浸润情况，以评估乳腺组织炎症反应的严重程度；
57.乳腺组织中髓过氧化物酶(mpo)活性的检测方法为：取乳腺组织称重后置于2ml ep管中，按照每100mg的组织加入4000μl的比例加入0.5％ctac溶液，在研磨仪中研磨10min，随后在4℃离心机中13000r/min离心30min，取上清液稀释10倍后进行髓过氧化物酶(mpo)活性的检测。
58.s7、取一部分乳腺组织进行炎性因子mrna表达水平的检测，采用荧光定量pcr检测炎性因子cox
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2、inos、il
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1β、il
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6和tnf
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α在乳腺组织中的mrna的表达水平，以评估乳腺组织中炎症反应的严重程度。
59.乳腺组织中炎性因子mrna表达水平的检测方法为：将新鲜的乳腺组织装入1.5ml的ep管并加入trizol后研磨，随后提取乳腺组织中的总rna，并反转录为cdna，本操作以20μl体系为单位，分别加入正向引物1μl，反向引物1μl，稀释10倍后的cdna模板8μl，以及pcr mix荧光染料10μl，随后放入荧光定量pcr仪器中进行检测，获取实验数据后进行乳腺组织中炎性因子mrna表达情况的分析。
60.该文中出现的电器元件均与外界的主控器及220v市电电连接，并且主控器可为计算机等起到控制的常规已知设备。
61.为配合上述实验方法，现提供如下数据统计：
62.图1为中药膏剂在lps诱导的小鼠乳腺炎模型中乳腺组织病理损伤示意图；对照组中乳腺腺泡轮廓清晰完整，腺泡之间的基质厚度正常，腺泡内无炎性细胞浸润，乳腺结构完整，而lps的处理导致乳腺腺泡萎缩，炎性细胞浸润严重，并且破坏了乳腺组织的正常结构，在中药膏剂处理后，这些病理症状得到了显著的改善，本实验结果表明，中药膏剂对lps诱导的小鼠乳腺炎的病理损伤具有显著的治疗效果。
63.图2为中药膏剂在lps诱导的小鼠乳腺炎模型中对乳腺组织的病理损伤评分，依据乳腺组织的病理损伤程度而得到的病理组织损伤评分结果，评分标准为，无损伤为0分、轻度损伤为1分、中度损伤为2分、重度损伤为3分、极度损伤为4分，评分由三位病理评分经验丰富的专业内人员完成，从评分结果我们可以看出，中药膏剂可以显著的缓解由lps引起的乳腺组织损伤(#p<0.05)。
64.图3可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子il
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1β水平的升高(**p<0.01)，
表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子的表达水平显著下降(##p<0.01)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制il
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1β的表达水平，缓解炎症反应，以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
65.图4可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子il
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6水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子的表达水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制il
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6的水平来缓解炎症反应，以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
66.图5可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子tnf
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α水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子的表达水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制tnf
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α的水平来缓解炎症反应，以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
67.图6可以看出，lps显著的引起乳腺组织内mpo活性水平的升高(*p<0.05)，表明lps模型组内发生了严重的炎性细胞浸润，而中药膏剂处理后，乳腺组织内mpo的活性水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制中心粒细胞迁移进入乳腺组织内来缓解炎症损伤，以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
68.图7可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子cox
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2的rna水平的升高(*p<0.05)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子cox
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2的rna水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制炎性因子cox
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2的rna水平以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
69.图8可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子inos的rna水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子inos的rna水平显著下降(##p<0.01)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制炎性因子inos的rna水平以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
70.图9可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子il
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1β的rna水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子il
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1β的rna水平显著下降(##p<0.01)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制炎性因子il
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1β的rna水平以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
71.图10可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子il
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6的rna水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子il
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6的rna水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制炎性因子il
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6的rna水平以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
72.图11可以看出，lps显著的引起乳腺组织内炎性因子tnf
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a的rna水平的升高(**p<0.01)，表明lps模型组内发生了严重的炎症反应，而中药膏剂处理后，乳腺组织内炎性因子tnf
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a的rna水平显著下降(#p<0.05)，表明炎症反应得到了有效的缓解，该结果证明中药膏剂通过抑制炎性因子tnf
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a的rna水平以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。
73.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。