眼表液采集检测装置的制作方法

1.本发明涉及医疗器械技术领域，尤其是涉及一种眼表液采集检测装置。


背景技术：

2.免疫层析技术是标记示踪粒子（胶体金、乳胶微球、荧光微球等）的抗体与待检测物质预先结合形成复合物，利用毛细作用在硝酸纤维素膜等固相载体上层析，膜上预先包被的抗原或者抗体，与流经的复合物结合而显色。该方法可通过肉眼直接判读结果，整个操作简单便捷，适用于基层诊断及大面积筛查使用。
3.泪液中特定蛋白质组份的定量研究已经越来越多地被用来诊断眼表疾病、判断其严重程度，并可作为预防或治疗眼表疾病的指征应用于临床和科研。在实际临床诊断中，临床医生很难通过表象判断患者眼部疾病，因此亟需借助一些快速检测技术辅助判断。
4.目前对于眼表液采用接触式采集，例如刺激泪液法、毛细管采泪法和吸附采泪法，这些方法都会不同程度对被采集者造成不适影响。采集后样本保存较多采用冷冻保存，使用时复融样本可能会对蛋白造成破坏，从而影响检测结果。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种眼表液采集检测装置，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明提供了一种眼表液采集检测装置，包括采集部和检测件；所述采集部包括壳体，设置于所述壳体外表面的用于收集眼表液的凹槽，以及设置于所述凹槽底部的吸样孔；所述检测件设于壳体内部，包括免疫层析检测卡；所述吸样孔用于将眼表液引流槽内的待测眼表液样本引流到免疫层析检测卡上。
8.进一步的，凹槽设置于壳体的一端，且所述凹槽与壳体的边缘形成开口；优选地，所述凹槽上还设置有引流槽，所述引流槽的一端与吸样孔的边沿连接，另一端向凹槽的开口处延伸；优选地，所述凹槽最外缘还设有防溢条。
9.进一步的，所述壳体包括卡盖和卡底；所述卡盖的内表面及卡底的内表面均设有固定件，所述固定件用于将卡盖和卡底相连接；优选地，所述固定件包括固定柱和固定孔，所述固定柱和固定孔插接；优选地，所述卡盖的内表面设有第一固定柱和第一固定孔，所述卡底的内表面设有与所述第一固定柱和第一固定孔对应的第二固定孔和第二固定柱。
10.进一步的，所述卡盖的外表面还设有用于观察检测件上检测结果的结果观察口；
优选地，所述卡盖的外表面从一端至另一端依次设有眼表液引流槽、样本id书写处、结果观察口、透气孔和磨砂手柄。
11.进一步的，所述卡盖的内表面设有按压部，所述按压部位于检测件上方，用于辅助提供虹吸作用；优选地，所述卡底的内表面设有用于固定检测件的卡槽。
12.进一步的，所述卡盖的内表面和/或卡底的内表面还设有挤压部，用于挤压检测件以贴合吸样孔。
13.进一步的，沿待测样品流动方向，所述免疫层析检测卡包括依次相接于底板上的样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸；所述吸样孔位于样品垫上方。
14.进一步的，所述纤维素膜上设有至少两条检测线及一条质控线；所述质控线包括羊抗鼠抗体、羊抗兔抗体、羊抗鸡抗体或羊抗人抗体中的一种或多种；所述检测线包括抗待检测因子的抗体、受体蛋白、多肽或核酸适配体。
15.进一步的，所述标记垫包括玻璃纤维膜、尼龙膜或聚酯膜；所述标记垫上包括示踪粒子与抗待检测因子的抗体、受体蛋白、多肽或核酸适配体的偶联物。
16.进一步的，所述样品垫包括玻璃纤维膜、尼龙膜或聚酯膜；所述样品垫上包括蛋白保护剂、封闭剂或表面活性剂中的一种或多种。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的眼表液采集检测装置，通过壳体上的凹槽设计，在外眼睑处即可收集被采集者的眼表液，眼表液收集无需与患者眼表直接接触，避免眼部的不适反应，且操作简单便捷。同时，从外眼睑收集流出的眼表液在凹槽内通过重力作用会滑落至吸样孔，然后进入配套设置的免疫层析检测卡，由此可以对眼表部位的相关蛋白因子和致病微生物进行即时快速的诊断，避免蛋白反复冻融影响，并且还具体操作简单，检测时间短等优点，15min即可完成眼表液相关项目检测，结果准确，真正意义上解决眼表相关疾病现场诊疗的问题。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为本发明提供的眼表液采集检测装置的俯视图；图2为本发明提供的眼表液采集检测装置凹槽的结构图；图3为本发明提供的眼表液采集检测装置卡盖的内表面结构图；图4为本发明提供的眼表液采集检测装置卡底的内表面结构图；图5中的（a）为标准曲线拟合图；图5中的（b）为线性回归方程及系数结果图。
20.图标：1
‑
凹槽；2
‑
吸样孔；3
‑
引流槽；4
‑
防溢条；5
‑
第一固定柱；6
‑
第一固定孔；7
‑
第
二固定孔；8
‑
第二固定柱；9
‑
样本id书写处；10
‑
结果观察口；11
‑
透气孔；12
‑
按压条；13
‑
按压点；14
‑
卡槽；15
‑
第一挤压部；16
‑
第二挤压部。
具体实施方式
21.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
22.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
23.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.根据本发明的一个方面，提供了一种眼表液采集检测装置，包括采集部和检测件；所述采集部包括壳体，设置于所述壳体外表面的用于收集眼表液的凹槽，以及设置于所述凹槽底部的吸样孔；所述检测件设于壳体内部，包括免疫层析检测卡；所述吸样孔用于将眼表液引流槽内的待测眼表液样本引流到免疫层析检测卡上。
25.可以理解的是，所述凹槽可以为弧面结构，也可以为平面结构，本发明对此不作限定，只要吸样孔位于凹槽的底部汇聚点即可，以便于经所述凹槽表面流动的介质在重力作用下汇聚至所述吸样孔处，故而，即时在待测眼表液样本较少的情况下，也能够被传导到免疫层析检测卡上，不会出现检测不准确或无效的情况。并且通过壳体上的凹槽设计，在外眼睑处即可收集被采集者的眼表液，眼表液收集无需与患者眼表直接接触，避免眼部的不适反应，且操作简单便捷。
26.同时，从外眼睑收集流出的眼表液在凹槽内通过重力作用会滑落至吸样孔，然后进入配套设置的免疫层析检测卡，由此可以对眼表部位的相关蛋白因子和致病微生物进行即时快速的诊断，避免蛋白反复冻融影响，并且还具体操作简单，检测时间短等优点，15min即可完成眼表液相关项目检测，结果准确，真正意义上解决眼表相关疾病现场诊疗的问题。
27.需要说明的是，本发明检测卡所要检测的泪液分析物包括但不限于眼表液中的蛋白质、肽、代谢物、电解质、小分子、脂质、糖、核酸等。
28.在使用时，在待采集者内眼睑处滴加生理盐水，将眼表液采集检测装置中的凹槽放置于待采集者外眼睑处，待待采集者转动眼球后，从外眼睑收集流出含有待测眼表液样本的润洗液，液体滑落至吸样孔后进入检测卡层析反应，15min后读取结果。
29.在一些优选的实施方式中，凹槽设置于壳体的一端，且所述凹槽与壳体的边缘形成开口。将凹槽设置于壳体的一端，能够更加便于眼表液采集检测装置的使用，提高待测眼表液样本的收集效率。
30.所述凹槽上还设置有引流槽，所述引流槽的一端与吸样孔的边沿连接，另一端向凹槽的开口处延伸。由于引流槽直接设置于凹槽表面，因此可随凹槽设置为弧线形或直线型，同样保证在水平条件下，与吸样孔边沿的连接端低于向凹槽的开口处延伸端即可。
31.为了减少待测眼表液样本在凹槽内不必要的流动，和/或避免待测眼表液样本外溢，保证尽量多的待测眼表液样本流入吸样孔进行检测，优选在所述引流槽两边设置凸起的边缘。
32.此外，为了避免吸附在凹槽边缘的待测眼表液样本因表面张力滑落至卡壳外缘，凹槽最外缘还设有防溢条。
33.本发明中的壳体可以为一体成型，也可以为拼装得到，为了便于检测件的安装和使用，壳体优选包括卡盖和卡底。
34.所述卡盖的内表面及卡底的内表面均设有固定件，所述固定件用于将卡盖和卡底相连接。对固定件的具体选择不做限定，本领域常规的可起到固定作用的部件均可，例如可以为，但不限于卡扣、卡槽或插接件等。
35.优选地，所述固定件包括固定柱和固定孔，所述固定柱和固定孔插接；所述卡盖的内表面设有第一固定柱和第一固定孔，所述卡底的内表面设有与所述第一固定柱和第一固定孔对应的第二固定孔和第二固定柱。交叉孔柱设计可以使卡盖和卡底的扣合更紧密。
36.为了加强眼表液采集检测装置的使用便捷性，作为优选，所述卡盖的外表面还设有用于观察检测件上检测结果的结果观察口。
37.所述卡盖的外表面从一端至另一端依次设有凹槽、样本id书写处、结果观察口、透气孔和磨砂手柄。
38.在一些优选的实施方式中，所述卡盖的内表面设有按压部，所述按压部位于检测件上方，用于辅助提供虹吸作用，从而推进待测眼表液样本在免疫层析检测卡上的行进，加快检测速度，提高检测效率。典型的按压部可以为设置于卡盖内表面的凸起，当按压卡盖外表面时，该凸起则因受力向下压至免疫层析检测卡上，以提供虹吸作用；按压部也可以为设置于卡盖外表面的凸起，当按压该凸起时，卡盖则因受力向下，其内表面下压至免疫层析检测卡上，同样可以提供虹吸作用。
39.在一些实施方式中，所述卡盖的内表面和/或卡底的内表面还设有挤压部，用于挤压检测件以贴合吸样孔。
40.其中，“和/或”指的是可以单独在卡盖内表面设置挤压部，或者单独在卡底内表面设置挤压部，或者在卡盖和卡底的内表面均设置挤压部。典型的挤压部为设置于卡盖的内表面和/或卡底的内表面的凸起结构，当卡盖和卡底扣合时，该凸起结构能够接触到设置于壳体内的免疫层析检测卡，以最大程度地使免疫层析检测卡与吸样孔贴合，避免待测眼表液样本从吸样孔流入壳体后随缝隙流走。
41.在一些优选的实施方式中，沿待测样品流动方向，所述免疫层析检测卡包括依次相接于底板上的样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸。
42.其中，底板为提供支撑的塑料制成，材料可以为pvc等。
43.纤维素膜包括醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜；具体地，所述纤维素膜上包含有质控线和至少两条检测线；其中，“至少两条”指的是，根据实际检测需求，可以将检测线设置为两条、三条或四条及以上等，用于单个致病因子或多个致病因子的检测。
44.优选地，所述质控线包括羊抗鼠抗体、羊抗兔抗体、羊抗鸡抗体或羊抗人抗体中的一种或多种；所述检测线包括抗待检测因子的抗体、受体蛋白、多肽或核酸适配体。
45.在一些可选的实施方式中，所述标记垫包括玻璃纤维膜、尼龙膜或聚酯膜；所述标记垫上包括示踪粒子与抗待检测因子的抗体、受体蛋白、多肽或核酸适配体的偶联物。
46.其中，所述示踪粒子例如可以为，但不限于胶体金、胶体硒、彩色乳胶微球、荧光微球等。
47.所述样品垫包括玻璃纤维膜、尼龙膜或聚酯膜；所述样品垫上包括蛋白保护剂、封闭剂或表面活性剂中的一种或多种。
48.其中，蛋白保护剂例如可以为，但不限于bsa或酪蛋白；封闭剂例如可以为，但不限于peg20000、peg6000或pvp10000；表面活性剂例如可以为，但不限于吐温20或吐温80等。
49.吸水纸可以为吸水能力较强的吸水滤纸。
50.下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
51.实施例1本实施例提供了一种眼表液采集检测装置，包括采集部和检测件；如图1和图2所示，所述采集部包括壳体，设置于所述壳体外表面的用于收集眼表液的凹槽1，以及设置于所述凹槽底部的吸样孔2。
52.凹槽1设置于壳体的一端，且所述凹槽1与壳体的边缘形成开口。
53.所述凹槽1上还设置有引流槽3，所述引流槽3的一端与吸样孔2的边沿连接，另一端向凹槽1的开口处延伸。
54.所述凹槽最外缘还设有防溢条4。
55.如图3和图4所示，所述壳体包括卡盖和卡底：所述卡盖的内表面及卡底的内表面均设有固定件，所述固定件用于将卡盖和卡底相连接。
56.具体地，卡盖的内表面设有4个第一固定柱5和2个第一固定孔6，卡底的内表面设有与所述第一固定柱和第一固定孔对应的4个第二固定孔7和2个第二固定柱8，第一固定孔6位于卡盖前部，第一固定柱5位于卡盖中部和后部，所述位置与卡底对应。
57.所述卡盖的外表面从一端至另一端依次设有凹槽1、样本id书写处9、结果观察口10、透气孔11和磨砂手柄。
58.所述卡盖的内表面设有按压部，所述按压部位于免疫层析检测卡上方，用于辅助提供虹吸作用。
59.具体地，按压部包括按压条12和按压点13，其中按压点13能够有效节约制作成本，
其对应位置为吸水纸与硝酸纤维素膜的交界处；按压条12能够保证待测眼表液样本释放均匀且层析均匀，其对应位置为样本垫与硝酸纤维素膜的交界处。
60.所述卡底的内表面设有用于固定检测件的卡槽14。
61.所述卡盖的内表面和卡底的内表面还设有挤压部，其中卡盖内表面的第一挤压部15设置于结果观察口四周，卡底内表面的第二挤压部16设置于卡槽14之间。当卡盖和卡底扣合后，第一挤压部15和第二挤压部16与免疫层析检测卡相接触，用于挤压检测件以贴合吸样孔2。
62.所述检测件设于壳体内部，包括免疫层析检测卡。
63.沿待测样品流动方向，所述免疫层析检测卡包括依次相接于底板上的样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸，吸样孔2位于样品垫上方。
64.其中，与底板的连接方式可以为固定连接，例如通过粘性物质将样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸固定于底板上。所述粘性物质优选为不干胶。
65.上述样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸可以依次对接，也可以依次搭接。当样品垫、标记垫、纤维素膜和吸水纸依次搭接时，沿样品流动方向由上自下依次为样品垫、标记垫和纤维素膜，以及搭接于纤维素膜上的吸水纸。
66.所述吸样孔2用于将凹槽1内的待测眼表液样本传导到免疫层析检测卡上，以实现对待测眼表液样本的快速检测。
67.在本实施例中，眼表液采集检测装置使用时，是在内眼睑处滴加生理盐水，将眼表液采集检测装置放置于患者外眼睑处，待患者转动眼球后，从外眼睑收集流出润洗液，液体滑落至吸样孔2后进入检测卡层析反应，15min后读取结果。
68.本实施例中所要检测的眼表液分析物包括但不限于眼表液中的蛋白质、肽、代谢物、电解质、小分子、脂质、糖、核酸等。所述分析物包括一些蛋白质生物标记物，包括但不限于：免疫球蛋白（免疫球蛋白g（igg）、免疫球蛋白m（igm）、免疫球蛋白a（iga）、免疫球蛋白e（ige）），细胞因子（肿瘤坏死因子
‑
ɑ
（tnf
‑
ɑ
）、转化生长因子
‑
β（tgf
‑
β）、白介素），蛋白质（乳铁蛋白、脂质运载蛋白、组织蛋白酶、黏蛋白或其它糖蛋白）。
69.实施例2本实施例提供了实施例1中采用胶体金定性法对待测眼表液样本中特异性ige抗体进行检测的方式：1、反应原理免疫层析检测卡硝酸纤维素膜上预先固定抗ige单克隆抗体1号（t线）和羊抗鸡多克隆抗体（c线），金标垫上预涂胶体金标记的抗ige单克隆抗体2号和鸡igy。采集的待测眼表液样本进入吸样孔2后，依据毛细作用待测眼表液样本流经样本垫、金标垫及硝酸纤维素膜。当样本中含有ige时，目标物先和胶体金标记的抗ige单克隆抗体2号形成反应复合物，经过t线时与其形成双抗体夹心复合物从而显色，胶体金标记的鸡igy抗体和c线反应显色；当样本中无ige时，无法形成双抗体夹心形式，因此t线无显色，c线正常显色。通过有无t线判定是否有过敏性结膜炎。
70.2、示踪抗体的制备取1 ml金纳米粒子溶液加入100 μl硼酸盐缓冲液（ph=8.5），取适量浓度抗ige单克隆抗体2号加入到溶液中，震荡2 h。取100 μl 10%的bsa溶液，缓慢滴加到胶体金溶液中，
震荡1 h。12000 r/min条件下离心15 min，弃上清，沉淀用0.1 ml保存液溶解，置于4℃冰箱备用。
71.3、t、c线包被利用包被缓冲液稀释抗ige单克隆抗体1号和羊抗鸡多克隆抗体，优选浓度为：t线为1.0mg/ml、c线为0.5mg/ml。37℃干燥24h后，密封装袋备用。
72.4、金标垫制备将胶体金标记抗体以一定喷膜速度标记到聚酯膜上，最优喷膜速度为3 μl/cm。37℃干燥30min后，密封装袋备用。
73.5、样本垫制备用样品垫处理液均匀涂布，37℃干燥2h后，用裁切机将样品垫切成工作规格备用。
74.6、试纸条组装按照顺序依次将各组份组装到pvc底板上，用切条机切成3.8mm的免疫层析检测卡，然后放入卡底卡槽14内，待用。
75.7、性能测试（1）阳性符合率对10份阳性病人的样本进行测定，符合率结果100%。
76.（2）阴性符合率对10份阳性病人的样本进行测定，符合率结果95%。
77.（3）重复性对1份阳性病人反复取样10次测定，结果为阳性，且显色均一。
78.实施例3本实施例提供了实施例1中采用荧光定量法对待测眼表液样本中特异性ige抗体进行检测的方式：1、反应原理检测卡硝酸纤维素膜上预先固定抗ige单克隆抗体1号（t线）和羊抗鸡多克隆抗体（c线），荧光垫上预涂荧光微球标记的抗ige单克隆抗体2号和鸡igy。采集的待测眼表液样本进入吸样孔后，依据毛细作用待测眼表液样本流经样本垫，荧光垫及硝酸纤维素膜。当样本中含有ige时，目标物先和荧光标记的抗ige单克隆抗体2号形成反应复合物，经过t线时与其形成双抗体夹心复合物从而形成荧光条带，荧光标记的鸡igy抗体和c线反应形成荧光条带；当样本中无ige时，无法形成双抗体夹心形式，因此t线无荧光信号，c线正常。荧光条带信号的强度与目标物浓度呈正相关性。
79.2、示踪抗体的制备超纯水将荧光微球稀释10倍，用超声波清洗仪进行超声分散5min。称取50mg的n
‑
羟基琥珀酰亚胺 (nhs)用0.1m mes溶解，配制成浓度为50mg/ml的溶液（a液）和50mg的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐 (edc) 用0.1m mes溶解，配制成浓度为50mg/ml的溶液（b液）。取0.4ml的a液加入微球悬浮液中混匀，10min后加入0.4ml的b液，常温反应20min。12000r/min的转速离心30min，去上清液，加入0.01m pbs超声分散重悬后加入0.1mg抗体。2
‑
8℃搅拌2h，加终浓度为0.5%bsa封闭1h。12000r/min离心20min,去上清后用保存液重悬。
80.3、t、c线包被利用包被缓冲液稀释抗ige单克隆抗体1号和羊抗鸡多克隆抗体，优选浓度为：t线为1.0mg/ml、c线为0.5mg/ml。37℃干燥24h后，密封装袋备用。
81.4、荧光垫制备将荧光标记抗体以一定喷膜速度标记到聚酯膜上，最优喷膜速度为2.4μl/cm。37℃干燥30min后，密封装袋备用。
82.5、样本垫制备用样品垫处理液均匀涂布，37℃干燥2h后，用裁切机将样品垫切成工作规格备用。
83.6、试纸条组装按照顺序依次将各组份组装到pvc底板上，用切条机切成3.8mm的检测卡，然后放入卡底卡槽14内，待用。
84.7、性能测试（1）标准曲线建立取ige标准品使用生理盐水倍比稀释到工作浓度。取一定量工作浓度的标准品加入吸样孔，等待反应15min后，用荧光读数仪读取c、t线的荧光强度值比值。每个浓度重复3平行，曲线拟合并计算其线性回归方程和回归系数（表1和图5）。
85.表1 标准曲线信号值（2）检出限测试取生理盐水按照取样检测的要求进行空白样品测试，测试次数6次。在标准曲线下计算其空白浓度值的3倍标准差值，公式为：y=3sd。检测限结果为0.041μg/kg。
86.（3）精密度测试分别取ige标准品使用生理盐水倍比稀释到工作浓度（0.5 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg）。取按照检测方法，每个浓度测试20次，计算其空白浓度值的相对标准偏差（rsd）。3个浓度检测结果分别为：11.5%、3.9%、5.7%。
87.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。