一种富硒铁皮石斛原球茎悬浮培养方法与流程

1.本发明属于石斛栽培技术领域，具体涉及一种富硒铁皮石斛原球茎悬浮培养方法。


背景技术：

2.铁皮石斛(dendrobium officinale)为兰科多年生附生草本植物。1992年铁皮石斛在《中国植物红皮书》中被收载为濒危植物。2020年版《中华人民共和国药典》记载铁皮石斛具有主治热病津伤、口干烦渴、阴虚火旺、目暗不明等症。临床应用上铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗氧化、抗疲劳、降低血压、降血糖、抗肿瘤等方面的独特功效。现有研究表明，人体与动物体内硒元素的缺乏与多种疾病的产生有一定的关系，而含硒的各类产品对于这些疾病可以起到缓解或治愈作用。硒具有抗癌、抗氧化的功效，还具有改善免疫系统，增强免疫细胞的生物学功能。无机硒相较于有机硒的安全性和吸收率要低，而当前主要是依靠植物转化技术的途径来获取有机硒，而通过生物转化有利于提高有机硒的含量，最终进入食物链，可供人或动物食用。另外对植物进行适量的施硒同时会促进其生长发育并提高产品质量。


技术实现要素：

3.本技术的目的在于提供一种富硒铁皮石斛原球茎悬浮培养方法，可以直接从培养物中生产次级代谢产物，这些次生代谢产物具有很多生物活性，是植物药的重要成分。
4.本发明采用的技术方案是：
5.一种富硒铁皮石斛原球茎悬浮培养方法，包括以下步骤：
6.步骤1：疏松铁皮石斛原球茎的诱导；
7.步骤2：经诱导后，选择生长良好、大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎进行富硒悬浮培养。
8.优选的，在步骤1中，铁皮石斛原球茎继代于固体ms培养基中，在培养温度为25
±
2℃、光照周期为12h/d、光照强度为2000lx的条件下进行培养，连续继代3次。
9.优选的，所述固体ms培养基为ms培养基 1～2.5mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.25～1.0mg
·
l
‑1naa，ph值为5.8。
10.优选的，所述固体ms培养基为ms培养基 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa，ph值为5.8。
11.优选的，在步骤2中，富硒悬浮培养铁皮石斛原球茎包括以下步骤：
12.在步骤1连续继代3次后，选择生长良好，大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎接种到ms 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 0～0.25mg
·
l
‑1na2seo3 30g
·
l
‑1蔗糖，ph值为5.8的液体培养基中，接种量为1～5g每瓶，于恒温振荡器中进行培养生长，共培养51d；在培养第6d开始，每隔3d随机收获5瓶，重复3次；将收获的样品进行处理之后，按照测定方法，测定其鲜重(fresh weight，fw)、干重(dry weight，dw)以及增殖系数，并绘制原球茎的生长
曲线。
13.优选的，所述液体培养基为ms 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 0.05mg
·
l
‑1na2seo3 30g
·
l
‑1蔗糖，ph值为5.8。
14.优选的，所述接种量为3g每瓶，即100g
·
l
‑1。
15.优选的，培养周期为30d。
16.优选的，悬浮培养条件为：培养温度25
±
2℃，光照周期为12h/d，光照强度2000lx，转速110r/min。
17.本发明的有益效果：
18.本发明利用悬浮培养技术，可以直接从培养物中生产次级代谢产物，这些次生代谢产物具有很多生物活性，是植物药的重要成分。在铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养基为ms 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 30g
·
l
‑1蔗糖 0.05mg
·
l
‑1na2seo3，接种量为100g
·
l
‑1，ph值为5.8，继代周期为30d,此时原球茎的硒含量最高可达4.011mg
·
kg
‑1，多糖含量为34.79％、生物碱含量为0.026％、总蛋白含量为28.25％。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1所示为不同培养基对铁皮石斛原球茎稳定生长的影响。
21.图2所示为培养天数对原球茎最佳硒浓度条件下鲜重的变化曲线。
22.图3所示为培养天数对原球茎最佳硒浓度条件下多糖含量的变化曲线。
23.图4所示为培养天数对原球茎最佳硒浓度条件下生物碱含量的变化曲线。
24.图5所示为培养天数对原球茎最佳硒浓度条件下总蛋白含量的变化曲线。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
26.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.本实施例具体提供了一种富硒铁皮石斛原球茎悬浮培养方法，包括以下步骤：
28.步骤1：疏松铁皮石斛原球茎的诱导；
29.步骤2：经诱导后，选择生长良好、大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎进行富硒悬浮培养。
30.试验内容
31.1、材料与方法
32.1.1试验材料
33.实验所用原球茎是将经过消毒灭菌处理过的铁皮石斛成熟未开裂的蒴果经种子组织培养得到的原球茎材料。铁皮石斛种子来自于浙江天目山铁皮石斛示范基地。
34.1.2试验方法
35.1.2.1疏松原球茎的诱导
36.将铁皮石斛原球茎分别继代于含不同浓度6
‑
ba、naa，ph值为5.8的固体ms培养基中。培养温度为25
±
2℃，光照周期为12h/d，光照强度为2000lx。在继代3次之后，将生长良好，大小均一且结构疏松的原球茎，继代到装有30ml培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养，培养液与培养疏松原球茎一致，只是不加琼脂。置于恒温振荡器中培养，温度25
±
2℃，光照周期为12h/d，光照强度2000lx，转速110r/min。
37.1.2.2悬浮培养接种量的确定
38.在超净工作台上，称取1、2、3、4、5g生长良好，大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎，接种到培养液中，即继代到装有30ml培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养，每组5瓶,重复3次。并置于恒温振荡器上进行培养，30d后收获，测定其鲜重(fw)、干重(dw)、增殖系数。
39.1.2.3悬浮原球茎增殖培养周期的确定
40.选择生长良好，大小均一且结构疏松的原球茎接种于ms 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 30g
·
l
‑1蔗糖培养基上，接种量为3g每瓶，于恒温振荡器中进行培养生长，共培养51d。重复3次。在培养第6d开始，每隔3d随机收获5瓶，将收获的样品进行处理之后，按照测定方法，测定其鲜重(fresh weight，fw)、干重(dry weight，dw)以及增殖系数，并绘制原球茎的生长曲线。
41.1.2.4不同硒浓度对铁皮石斛原球茎各指标含量影响测定
42.将生长良好，大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎分别接种到添加不同na2seo3浓度(硒浓度为0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25mg
·
l
‑1)的ms 2.0mg
·
l
‑16
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 30g
·
l
‑1蔗糖，ph为5.8液体培养基中。接种量为3g每瓶，每个处理接种5瓶，根据前期悬浮原球茎增殖培养周期，在恒温振荡器中培养33d之后收获。将收获的样品，测定各指标。
43.1.2.5富硒悬浮培养原球茎生长曲线及各指标测定
44.选择生长良好，大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎接种于ms 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 0.05mg
·
l
‑1na2seo3 30g
·
l
‑1蔗糖，ph值为5.8的液体培养基中，接种量为3g每瓶，于恒温振荡器中进行培养生长，观察其生长状态，共培养了39d，从培养第3d开始，每隔3d收获5瓶，重复3次。将收获的样品进行处理之后，按照测定方法，测定各指标含量并绘制各生理指标的变化曲线。
45.1.3各指标测定方法
46.1.3.1原球茎生长量测定
47.(1)鲜重(fw)测定
48.用不锈钢筛网过滤收集原球茎，蒸馏水清洗两次，再用滤纸吸收多余水分，称量得鲜重。
49.(2)干重(dw)测定
50.把收获的原球茎置于105℃的恒温鼓风干燥箱中杀青30min，之后60℃烘12
‑
24h至恒重，得到干重。
51.(3)增殖系数测定
52.增殖系数＝(培养后的鲜重
‑
接种量)/接种量
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
53.1.3.2多糖含量测定
54.采用改进的蒽酮
‑
硫酸法测定3次，取平均值。
55.多糖含量(μg/g
·
dw)＝[(c/v
s
)
×
n
×
v
t
×
100％]/w
×
106ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0056]
式中：c为查标准曲线数值(μg)；v
s
:测定时取用多糖提取液体积(ml)；n:稀释倍数:v
t
:提取液总体积(ml)；w:样品干重dw(g)
[0057]
1.3.3生物碱含量测定
[0058]
用溴甲酚绿酸性染料比色法进行测定，对每组数据测定3次，取平均值。
[0059]
单位培养基生物碱产量(g/dw
·
flask)＝c
×
v
t
×
n
×
10
‑6/(v
s
×
dw)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0060]
式中:c为待测样品对应的标准曲线值(μg)；v
t
为提取液总体积(ml)；dw为样品干重(g)；v
s
为测定时加样量(ml)；n为样品稀释倍数。
[0061]
1.3.4总蛋白含量测定
[0062]
利用分光光度法，测定3次，取平均值。
[0063]
总蛋白质含量＝(1.45
×
d
280nm
‑
0.74
×
d
260nm
)/v/1000/m
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0064]
式中:d
280nm
代表蛋白质提取液在280nm处测得的吸光度；d
260nm
代表蛋白质提取液在260nm处测得的吸光度；v代表将所有样品提取液稀释成测量液浓度后的总体积(ml)；m代表样品质量(g)。
[0065]
1.3.5硒含量测定
[0066]
用icp
‑
oes测定硒含量。测定3次，取平均值。
[0067]
1.4统计分析
[0068]
用excel2016统计数据，ibm spss statistics 23软件对实验数据进行方差分析并进行重复检验(p<0.05)，数据分析结果以平均数
±
标准偏差来表示。
[0069]
2结果与分析
[0070]
2.1不同激素组合对疏松原球茎诱导的影响
[0071]
植物激素的合理组合是获得疏松原球茎的关键，而获得生长良好，大小均一且结构疏松的细胞是植物细胞悬浮培养的基础。从表1中可以看出，添加不同激素浓度的培养基所获得的铁皮石斛原球茎的生长情况存在较大的差异。实验中，在无激素的培养基中，原球茎褐化无法正常生长，如图1。当6
‑
ba浓度越高，诱导的原球茎就越紧密，且原球茎发绿，不适合细胞悬浮培养，如图1中第9、10图。实验中，6
‑
ba浓度为2.0mg
·
l
‑1和naa浓度为0.5mg
·
l
‑1时，诱导的原球茎为浅黄绿色，质地疏松,如图1中第6图。实验表明，铁皮石斛疏松原球茎的最佳培养基为：ms培养基 2.0mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa。
[0072]
表1不同培养基对铁皮石斛原球茎生长的影响
[0073][0074][0075]
注：
‑
，表示原球茎坏死并褐化； ，表示原球茎生长状态缓慢，质地紧密； ，表示原球茎生长状态良好，质地较疏松； ，表示原球茎生长状态最优，质地最疏松。
[0076]
2.2富硒悬浮培养条件的优化研究
[0077]
2.2.1接种量对原球茎增殖的影响
[0078]
参照一般悬浮细胞培养时间周期并观察培养物，初次培养选择30天后收获原球茎。由表2可知，接种量对原球茎增殖有显著影响，合适的接种量有利于原球茎的生长。当接种量大于4g时，培养后期培养基中的营养物质不足以维持其正常生长，影响原球茎的继续增殖，此时原球茎的增殖系数反而会随着接种量的增加逐渐下降。而接种量太低也不利于原球茎增殖，接种量小于2g时，增殖系数变低，生长速度缓慢。当接种量为3g时，生长量达到最大值，且细胞生长疏松。此时的增殖系数可达到最大值0.69。
[0079]
表2接种量对原球茎增殖的影响
[0080][0081]
注：不同小写字母表示不同接种量处理间差异在p<0.05水平具有的显著性
[0082]
2.2.2培养天数对原球茎增殖系数的影响
[0083]
为了观察原球茎的生长衰亡过程，此实验过程持续总培养了51天。在培养过程中，如表3数据显示，原球茎的干、鲜重变化基本呈现先上升，再平稳，最后下降的趋势。在第6d到第18d期间，原球茎干、鲜重迅速增加并在第33d时达到最大值。在第33d到39d期间，干、鲜重基本上保持恒定，且都在第39d之后开始下降，此时，原球茎开始褐化，并伴随部分衰亡，生长活跃程度逐渐减弱。实验显示铁皮石斛原球茎增殖培养周期最宜控制在33d左右，可使其增殖系数达到最大为2.86。
[0084]
表3培养天数对原球茎增殖的影响
[0085][0086]
注：不同小写字母表示培养天数差异在p<0.05水平具有的显著性
[0087]
2.2.3富硒培养对原球茎生理指标及硒含量的影响
[0088]
在ms液体增殖培养基中添加不同浓度硒进行原球茎富硒悬浮培养，根据前期原球茎生长周期，实验富硒培养在33天后收获。由表4可知，不同硒浓度对铁皮石斛原球茎的生长、多糖含量、生物碱含量以及总蛋白含量有着不同的影响。当硒浓度为0.05mg
·
l
‑1时，原球茎富硒含量达到最大值，为4.01mg
·
kg
‑1，且原球茎的增殖系数达到最大值为1.95，多糖含量为29.07％，生物碱含量为0.025％，总蛋白含量为27.21％，而且此时原球茎颗粒大小均一且饱满，生长良好，各生理指标含量最佳。而当硒浓度大于0.10mg
·
l
‑1时，原球茎的鲜重及增殖系数开始下降，且多糖、蛋白质、石斛碱含量也降低，实验显示高浓度的硒抑制了原球茎的生长，且原球茎内次生代谢类物质含量也在降低。在培养基中添加适量的硒可促进原球茎生长及提高原球茎的多糖及蛋白等的含量，提高原球茎品质，可以达到铁皮石斛
原球茎富硒培养目标。
[0089]
表4硒浓度对原球茎富硒含量、多糖、生物碱及总蛋白含量的影响
[0090][0091]
注：不同小写字母表示硒浓度差异在p<0.05水平具有的显著性
[0092]
2.3最佳富硒浓度培养对原球茎各生理指标的影响
[0093]
2.3.1富硒原球茎生长曲线
[0094]
为了观察富硒原球茎生长，衰亡过程，此次培养周期持续了39天。铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养的生长曲线如图2所示，在39d的培养天数中，原球茎的鲜重变化也呈现先上升后逐渐下降的趋势。但在30d的时候，鲜重达到最大，之后开始缓慢下降。与未富硒培养实验所得到的培养指标变化相比较，富硒培养对原球茎生长的促进作用是显著的，使得原球茎的生长最大值提前了3d。适量的富硒是促进原球茎的生长。由于原球茎纤维化程度开始不断提高，生长的活跃程度逐渐减弱，部分的原球茎细胞开始逐渐出现褐化衰老现象，最终导致原球茎鲜重的降低。30d时收获富硒原球茎，能得到高质量的富硒原球茎细胞。
[0095]
2.3.2富硒原球茎多糖含量的变化曲线
[0096]
由图3可知，铁皮石斛原球茎中的多糖含量呈现出先降低，再增加，最后又降低的趋势。在0
‑
9d内多糖含量有所下降，但从第12d开始，多糖含量开始增加，在30d时达到最大为34.79％，30d后的多糖含量逐渐呈现下降的趋势。多糖不仅是细胞内储存能量的物质同时也是铁皮石斛原球茎的代谢产物，在刚继代到培养基时，原球茎的自身生长需要多糖的不断分解，导致多糖含量下降，之后在原球茎适应环境后，多糖不再分解消耗，细胞积累多糖使含量上升。而在培养后期，随着培养液中营养成分减少，需要分解多糖以提供原球茎细胞的生长和合成目的产物，导致多糖含量又开始下降。
[0097]
2.3.3富硒原球茎生物碱含量的变化曲线
[0098]
在富硒培养中，铁皮石斛原球茎生物碱含量变化如图4所示，生物碱含量总体上呈现迅速上升，之后开始缓慢下降的趋势。当培养天数为30d时，生物碱含量达到最大为0.026％，之后开始下降。
[0099]
2.2.4富硒原球茎总蛋白含量的变化曲线
[0100]
铁皮石斛原球茎总蛋白含量变化如图5所示，总蛋白含量总体上呈现迅速上升后下降的趋势。随着培养时间的不断延长，蛋白质含量在逐渐减少，这可能与铁皮石斛原球茎纤维化程度不断提高、生长活跃程度逐渐减弱有关。即当培养天数为30d时，总蛋白含量达到最大为28.25％，之后含量逐渐开始下降。
[0101]
3结论
[0102]
在本实验中添加0.05mg
·
l
‑1的硒时，对原球茎生长起到促进作用，并能提高原球茎产量及产品品质，但过量硒(即≥0.1mg
·
l
‑1)又不利于原球茎的生长，会对原球茎产生不同程度的毒害作用。研究结果表明当硒浓度为0.05mg
·
l
‑1时，富硒原球茎生长最佳。徐国华等在研究中所用的培养基n6 0.5mg/lnaa 3％蔗糖，与本实验所用的培养基ms 2.0mg
·
l
‑16
‑
ba 0.5mg
·
l
‑1naa 30g
·
l
‑1蔗糖相比，在ms培养基富硒0.05mg
·
l
‑1条件下更利于原球茎富硒生长，并得到最大的硒含量4.01mg
·
kg
‑1，硒参与到原球茎的新陈代谢，同时促进了原球茎的生长，提高了产量及其品质。
[0103]
铁皮石斛原球茎多糖、生物碱、蛋白含量的多少对原球茎品质起到决定性的作用。本研究所得到的多糖含量达到了34.79％，含量高于现有人工栽植或是野生多糖含量。何铁光等在对铁皮石斛不同来源材料的研究中，用1/2ms液体培养基得到的铁皮石斛原球茎多糖含量24.32％，而孙丹通过固体培养基培养得到原球茎中多糖含量为21.42％，本研究富硒后多糖含量升高。在已有的研究表明，原球茎中生物碱含量相较于人工栽培或是野生铁皮石斛偏低，本研究中富硒悬浮培养所得生物碱含量为0.026％,相较于张本厚等由固体培养基培养所得到生物碱含量为0.018％高得多。而在实验中富硒后原球茎总蛋白含量28.25％,高于张本厚等由固体培养基培养所测得的22.19％。在尚庆茂等研究硒营养对水培生菜品质的影响，杜振宇等研究施硒对茄子品质的影响，倪蕾等研究不同浓度亚硒酸钠对水培苦苣的影响实验中，得出适量的硒元素施加是可以提高蛋白质的含量，且硒元素对蛋白质的合成是具有促进作用。本实验同样也证实了富硒原球茎悬浮培养促进了蛋白质的合成。
[0104]
对于原球茎的培养周期，无论是否富硒培养，原球茎的生长曲线均呈现先快速再缓慢上升，接着平稳生长，最后开始缓慢下降的趋势。但富硒培养原球茎后，收获期提前了3天，富硒后原球茎的增值系数从0.69提高到2.86,富硒促进了原球茎细胞的生长。
[0105]
本发明通过富硒培养对原球茎生长、富硒、多糖、生物碱、总蛋白质等含量的影响进行了初步研究。富硒后，硒参与到原球茎的新陈代谢，促进了原球茎的生长，提高了原球茎的产量及其品质，成功建立了铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养的技术体系。
[0106]
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。