一种生物传感器系统及其应用于检测生物样品的方法与流程

1.本发明涉及生物样品检测领域，更具体地说，涉及一种生物传感器系统及用于检测生物样品的方法。


背景技术：

2.直接对生物样品的本质特性(如大小、重量、形态)进行免荧光标记下的测量，现已发展为生命科学基础研究和临床测试中必不可少的重要途径。
3.现有的以等离激元结构、片上集成光学导波结构为主要代表的免荧光标记光学传感芯片技术历经多年的发展，实现了以提取共振谱信息变化的多种工作机理，主要包括波长分辨、角度分辨下对共振峰红移的监测。然而，绝大多数方案均依赖精密设备，如窄线宽、波长可调谐激光器、光谱仪、压电驱动角位移台等，以及光路中较多的分立器件。光谱扫描、角度扫描等测量过程也限制了测量的时间分辨率，在此过程中伴随着的潜在的因光源功率不稳定、波长偏移带来的噪声，同样限制了检测极限的提升。这些特征难以避免与生物检测所期望的便捷、稳定、高速、低成本的发展趋势相冲突。
4.因此，研发出一种生物传感器系统及其应用于检测生物样品的方法，解决现有方法存在的技术缺陷，使其满足高速、高效、高准确率、低成本的检测要求，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.本发明针对上述问题，提供了一种生物传感器系统及用于检测生物样品的方法，所述生物传感器系统基于光子集成芯片面外成像，同时以图像识别分析为路径进行生物样品浓度的检测，解决现有方法存在的技术缺陷，使其满足快速、高效、低成本的检测要求。
6.本发明的第一方面，提供了一种生物传感器系统，包括：
7.传感器芯片，所述传感器芯片上设有光波导及片上微谐振腔结构，所述光波导及片上微谐振腔结构共同形成光耦合、光传导及光共振装置；
8.微流控通道，所述微流控通道与所述传感器芯片集成在一起；
9.成像单元，用于采集经过光耦合、光传导及光共振后的散射信号。
10.优选地，所述微流控通道为聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控通道。
11.优选地，所述传感器芯片与所述微流控通道集成在一起的方法具体有：
12.采用光刻定义图案的硅或光刻胶结构作为模板，微流控通道使用道康宁sylgard184中基本组分及固化剂，在放置有模具的容器中混合，搅拌均匀，随后置于真空箱中去除气泡，静置固化，最后剥离出微流控通道；
13.微流控通道的流体输入、输出接口通过打孔器得到并插入金属连接管与外部流体泵连接；
14.在光学显微镜成像的辅助下，将传感器芯片与微流控通道置于氧等离子处理，使二者表面形成不可逆键合，以此得到微米尺度的微流控通道与传感器芯片之间的空间对准
性。
15.优选地，所述成像单元包括物镜、微透镜中任意一种和cmos图像传感器、ccd图像传感器中任意一种。
16.优选地，所述成像单元是带有光源和照相机的一体化设备。
17.优选地，所述光波导为氮化硅材料。
18.优选地，所述传感器芯片包括多个传感单元，每个传感单元为微环结构，所述微环结构为圆型、跑道型和螺旋线型中的任意一种。
19.优选地，所述传感器芯片还包括主干光波导和多模波导分束器，用于每个传感单元的光输入。
20.本发明的第二方面，提供了一种利用以上任意一项所述的生物传感器系统检测生物样品的方法，所述方法包括：
21.步骤一、对传感器芯片对外暴露部分进行表面功能化，分通道固定针对多种生物标志物的特定受体；
22.步骤二，将传感器芯片装载到成像单元中，引入光源激发光耦合入主干波导，同时在传感器芯片顶视方向进行面外散射成像；
23.步骤三，采用流体泵引入待测溶液；
24.步骤四，成像单元采集实时散射信号，得到面外散射图像；
25.步骤五，利用已建立的深度学习算法，将面外散射图像的像素矩阵作为输入进行分析，得到待测物实时浓度变化信息，最终得出动力学分析结果。
26.优选地，所述方法还包括在采用流体泵引入待测溶液后继续引入带有特定抗体连接的金属纳米颗粒进行标记的溶液，用于散射信号放大。
27.本发明提供一种生物传感器系统，包括传感器芯片、微流控通道、成像单元，具体涉及传感器芯片与微流控通道集成在一起的方法，光波导及微谐振腔结构的设计，本发明还提供了一种利用生物传感器系统检测生物样品的方法，包括利用已建立的深度学习算法进行散射图像数据分析，最终得到动力学分析结果。其有益效果是：
28.1、相比于传统免荧光标记的光学生物传感系统，本发明有效的避免了对多种光学精密测量的依赖，所需设备均为低成本、广泛可接触到的类别，如激光二极管，发光二极管，并极大的减少来对光学分立器件的运用。生物传感器系统高度适配于一体化设备，例如智能手机，可综合运用手机的对焦激光、相机，以及手机自身强大的存储、运算能力，使得整个传感器系统智能化、流程化、自动化。其中传感器芯片可运用cmos适配的晶圆级加工工艺完成，从而大大降低其造价。
29.2、本发明十分适合于多路复用的高通量测量，如对于复杂体液环境中多种标志物的筛查，通过合理设计传感器件版式，并不需要因多路探测而增加额外的系统组件。
30.3、本发明具有广阔的实用性，当前领域内多种多样的片上微谐振腔结构、微干涉仪、光子晶体结构均可以适用，进而以散射信号监测的方式读取信息，并通过先进的深度学习算法充分利用传感大数据。对于后端深度学习算法的迭代开发进一步降低或消除部分噪声源，相比于传统频域检测方案达到更优秀的检测极限。
附图说明
31.图1(a)是本发明实施例中生物传感器系统的无片上耦合光栅结构的结构示意图；图1(b)是本发明实施例中生物传感器系统的有片上耦合光栅结构的结构示意图；
32.图2(a)是本发明实施例中传感器芯片的截面结构示意图；图2(b)是本发明实施例中传感器芯片中光波导附近的表面功能化效果示意图；图2(c)是本发明实施例中光波导附近的三种在局部引入散射增强效应的结构顶视示意图；
33.图3是本发明实施例中传感器芯片中的传感单元的四种微环结构示意图；
34.图4是本发明实施例中多路复用的传感器芯片整体顶视结构示意图；
35.图5是本发明实施例中生物传感器系统检测生物样品的方法流程示意图；
36.图6(a)是本发明实施例中生物传感器系统工作时光谱受外部吸附扰动产生改变的示意图；图6(b)是本发明实施例中利用生物传感器系统测量得到的光谱响应图；图6(c)是本发明实施例中利用生物传感器系统得到的散射成像图；
37.图7(a)是本发明实施例中深度学习算法示意图；图7(b)是本发明实施例中通过深度学习算法得到的两种典型测量结果示意图；
38.其中，100、传感器芯片；101、片上微谐振腔结构；102、微流控通道；103、物镜或微透镜；104、cmos或ccd图像传感器；105、片上耦合光栅结构；106、一体化设备；107、光源；108、照相机；109、聚合物微流控通道层；110、待测体液或缓冲溶液；111、光波导；112、包层；113、基底层；114、单分子层；115、受体；116、待测抗原；117、纳米金属颗粒；118、1
×
2分束器；119、1
×
4分束器；120、传感单元及独立微流控通道；121另一组传感单元及独立微流控通道。
具体实施方式
39.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.本发明的一种生物传感器系统，如图1
‑
4所示，包括传感器芯片100、微流控通道102、成像单元，所述成像单元有两种，一种成像单元包括物镜或微透镜103、cmos或ccd图像传感器104，另一种成像单元为一体化设备106，一体化设备106上携带有光源107和自带的具备微距成像能力的照相机108，传感器芯片100上设有片上耦合光栅结构105、光波导111及片上微谐振腔结构101，片上耦合光栅结构105、光波导111及片上微谐振腔结构101共同形成光接收、光耦合及光传导装置；传感器芯片100与微流控通道102集成在一起。
41.传感器芯片100基于片上无源平面光波导回路,利用波导中传播光产生的面外弹性散射的捕获与成像，建立像素矩阵与传感器表面待测物信息的关联，实现高速、准确、简便、低成本，可复用的检测。如图1(a)所示，首先，利用片下透镜光纤与主干波导进行端面耦合，或如图1(b)所示，基于周期性片上耦合光栅结构105辅助耦合，将光源中光信号耦合到主干波导，随后以倏逝波耦合的方式将输入光从主干波导耦合至片上微谐振腔结构101。基于光波导111中不可避免的侧壁粗糙细节或特定缺陷结构，部分的导波光束与该纳米尺度结构作用，产生随机、非定向的瑞利散射。在垂直于传感器芯片100平面的面外方向，可采用
物镜或微透镜103以聚焦的方式采集，或免透镜非聚焦的方式进行远场散射信号采集。随着表面功能化下的光波导111表面对流体中待测标志物吸附的持续增加，片上微谐振腔结构101的有效折射率也随之产生对应的增长，从而改变共振条件。在输入光波长固定的前提下，片上微谐振腔结构101内的自身光场限制状况的改变将影响远场散射光的强度及分布状况。因此，通过分析面外散射图像，可建立起信号与待测物浓度的对应关系，利用高速成像的优势，可大大提高传感的时间分辨率。同时，对单传感器芯片100中多单元、多测量组进行同时拍照测量，可以自检验的方式提高精确度，也可实现面向多种待测生物标志物的多通道复用式检测。以高速成像采集得到的大量数据可供各种深度学习技术训练，最终实现自动化、流程化归类、分析过程。
42.如图2(a)所示，分别为聚合物微流控通道层109、待测体液或缓冲溶液110、高折射率的光波导111、低折射率的包层112以及基底层113。本发明的优选实施例中，可实施的工作波长范围覆盖自片上光子回路适用的可见光至中红外的广阔范围(约0.3
‑
4微米)，优选的工作波长范围为600
‑
1000nm。基于此波段采用成本低廉、灵敏度高的cmos或ccd图像传感器104，并可以无缝适配于一体化设备106，例如智能手机等个人随身设备。传感器芯片100上光波导及微谐振腔结构101主要基于成熟的自上而下的芯片微加工工艺实现，优选为硅基基底，可采用成熟的cmos兼容的半导体加工工艺实现光子回路部分的制备。
43.光导波111优选为氮化硅材料，氮化硅具有从可见光至红外范围的极宽的透明窗口，可通过化学气相沉积中调节硅元素及氮元素比重，在特定工作波长内得到极低的损耗系数。此外，氮化硅材料具有远低于硅的热光系数，有利于降低因芯片生热产生的信号噪声。其他优选方案包括基于绝缘衬底上的硅，即soi芯片所形成的硅导波器件、在玻璃或石英基底上采用离子注入形成的高折射率玻璃波导器件、以及多种优选为su8、pmma等聚合物波导器件。以上各类平台主要涉及的加工流程包括光刻或电子束曝光、干法刻蚀等。
44.本发明的优选实施例中，所述微流控通道102为聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控通道。传感器芯片100与微流控通道102集成在一起主要涉及将基于pdms的微流控通道与传感器芯片100结合，采用光刻定义图案的硅或光刻胶结构作为模板，pdms通道可使用道康宁sylgard184中基本组分及固化剂，在放置有模具的容器中混合，搅拌均匀，随后置于真空箱中去除气泡，静置固化，最后剥离。流体输入、输出接口可通过打孔器得到并插入金属连接管与外部流体泵连接，随后将传感器芯片100与pdms置于氧等离子处理，使二者两表面形成不可逆键合，该过程可在光学显微镜成像的辅助下进行，由此可以在微米尺度的微流控通道102与传感器芯片100之间得到很好的空间对准性。
45.本发明的优选实施例中，对于面向免荧光标记生物传感，表面功能化需要在光波导表面增加化学修饰物层、交联剂层和生物单分子层。光波导为氮化硅材料，光波导表面增加化学修饰物层、交联剂层和生物单分子层的制备方法如下：利用天然的二氧化硅钝化层或沉积5nm左右的二氧化硅层，可通过食人鱼溶液或氧等离子处理增加表面羟基密度，随后进行表面硅烷化工艺，将具有不同官能团的有机硅烷，如氨基(
‑
nh2)、羧基(
‑
cooh)和硫醇(
‑
sh)用于蛋白质、酶或核酸的结合，优选实例为修饰物层使用化学试剂为aptes，所述交联剂层为edc/nhs。对于多通道传感系统，每一个微流控通道可以单独完成特异的表面功能化。实际测试中待测溶液可为体液(如血清、唾液等)或配制的磷酸缓冲盐溶液(pbs)，溶液中特定标志物与表面受体因较强的结构互补性及亲和性实现高相互作用力，得到特异性结
合，进而对倏逝波光场产生扰动。在完成对待测标记物的吸附后，也可采用连接有特定受体的金属纳米颗粒117进行二次信号放大步骤。如图2(b)所示，分别为表面硅烷化后形成的自组装单分子层114、固定后的受体115、待测抗原116、用于信号放大的表面联结了特定抗体的纳米金属颗粒117。
46.本发明的优选实施例中，如图2(c)所示，光波导或微谐振腔结构中内在光场信号，以及因待测物造成的光场分布改变可通过散射信号间接测量。可依靠自身因光刻曝光、刻蚀等工艺带来的不可避免的侧壁粗糙形状造成随机散射，也可在局域引入少量凹凸结构作为缺陷，定点增强局域的散射效应。该缺陷设计不宜过多，过大，否则会大大增加光学损耗，降低光学共振的品质因子，影响传感性能。
47.本发明的优选实施例中，传感器芯片包括多个传感单元，每个传感单元为微环结构，所述微环结构为圆型、跑道型和螺旋线型中的任意一种，如图3所示，为避免造成光波导弯曲损耗并考虑微型化设计，典型的传感单元微环半径为10
‑
100微米。此外，可选用狭槽型模式(slot
‑
mode)微环设计，以增强倏逝波比重，提高灵敏度。另外，双微环耦合设计同样可以采用，由于两个微环结构的尺寸差异，不同阶数的共振模式将会出现选择性耦合，实现部分弱耦合效率的模式作为强耦合效率模式的自校准，实现更好的噪声免疫效果。
48.本发明的优选实施例中，针对单个生物标志物传感的一组传感器包括单个或多个微环传感单元及独立的微流控通道，包含多个传感单元优选为2
‑
4个的一组传感器可设置一个用于校准的单元(即留有上方包层，不与溶液中待测物相互作用)，剩余多个器件可用于实时多次测量，减低测量信号误差。
49.进一步的，传感器芯片还包括主干光波导和多模波导分束器，用于每个传感单元的光输入，传感器芯片可集成多组传感器优选为8或16组，以配合多组微流控通道实现面向多种不同的生物标志物的同时测量。每组传感器的光输入由主干波导及多模波导分束器完成，如图4所示，分别为片上1
×
2分束器118；基于多模干涉波导的片上1
×
4分束器119、基于四个微环结构的传感单元及独立微流控通道120、另一组基于四个微环结构的传感单元及独立微流控通道121。
50.本发明提供的一种利用以上任意一项所述的生物传感器系统检测生物样品的方法，如图5所示，具体实施例如下：
51.步骤一，对传感器芯片对外暴露部分进行表面功能化，分通道固定针对多种生物标志物的特定受体；
52.步骤二，将传感器芯片装载到成像单元中，引入光源激发光耦合入主干波导，同时在传感器芯片顶视方向进行面外散射成像；
53.步骤三，采用流体泵引入待测溶液；
54.步骤四，成像单元采集实时散射信号，得到面外散射图像；
55.步骤五，利用已建立的深度学习算法，将面外散射图像的像素矩阵作为输入进行分析，得到待测物实时浓度变化信息，最终得出动力学分析结果，具体如图5所示，首先基于训练算法分析像素矩阵，进行信号属性归类，然后判断浓度动态变化并进行动力学分析。
56.优选地，所述方法还包括在采用流体泵引入待测溶液后继续引入带有特定抗体连接的金属纳米颗粒进行标记的溶液，用于散射信号放大。
57.具体实施过程中，散射成像主要为面外垂直方向对散射光的采集，如图1(a)、1(b)
所示，可基于普通光学物镜、微型化聚合物物镜、免透镜成像三种方式。在确定恰当的物镜或微透镜的数值孔径和照相机传感器尺寸后确保视场范围(fov)覆盖所有传感单元，保证单次曝光成像可完成对所有器件的测量。生物传感器系统可基于具有固定波长的、分离于片下的光源，可为激光二极管(ld)、超辐射发光二极管(sld)、或具有较窄线宽的发光二极管(led)。如图6(a)所示，因待测物吸附对于共振峰带来的扰动，固定激发波长的光波的透射信号强度、以及在腔内的增强效应随之改变，进而影响散射信号的强度及分布。图6(b)为一种已实施的单个氮化硅微环的透射谱的变化的实验记录。图6(c)反映了对应的散射成像的图像。对应固定工作波长a，在特定蛋白质吸附后可以观察到明显的散射信号的变化。而在固定波长b可以观察到因偏离于共振峰范围，散射信号变得非常微弱。
58.如图7(a)所示，在对得到的买内外散射图像进行数据处理中，可对单个单元形成二维像素矩阵优选50
×
50，也可挑选特定缺陷区域，形成像素数量大大降低下的简化一维像素矩阵。除微环自身散射成像以外，输入波导，输出波导散射像素矩阵也可作为参考因子并入分析过程。
59.本发明的优选实施例中，散射图像分析优选为以深度学习算法为主导的流程化检测。主要涉及预备过程中对传感器系统图像变化响应的数据训练。优选的算法为卷积神经网络，如图7(a)所示，包含多组卷积层与池化层，最后以全连接层将输出值送给分类器。
60.优选的一种学习过程包括引入不同浓度的流体样本，如不同浓度的盐水、葡萄糖溶液、折射率匹配油等，收集具有不同折射率的上盖层带下的散射图像，学习其响应。针对每个浓度样本可采集图像数百张进行训练，数百张进行验证。优选用波长可调谐激光器，进行扫频输入，形成多组高光谱图像，代入进行训练与验证。
61.进一步的，应对一个传感器芯片执行一次多标志物浓度已知的标定实验，建立起光学信号与实际浓度值的关联系数。
62.在完成训练与验证过程后，引入真实待测溶液，运用卷积神经网络算法，参见图7(b)在整个传感阶段(可为数分钟至数小时)实时输出结果包括混淆矩阵判定及时域分两类：
63.一为判断是否为正常、符合预期的响应、是否存在异常响应、是否存在局域改变响应(如单个金属纳米颗粒带来的局域散射增强)。通过调节判定阈值，可将因部分非特异性响应、局域杂质干扰的情形排除，认定为异常响应。除此之外，认定为正常响应。
64.二为判断实时表面吸附量，通过在训练过程中建立起的图像变化程度与共振红移强度的关联，推断出在特定时间、特定图像针对每个传感单元的表面吸附量，即待测物实时浓度变化信息，建立动力学过程的监测，最后在过程接近稳态时可综合分析得到生物分子间作用的亲和力系数，即动力学分析结果。
65.本发明针对片上光学传感器提出高效、流程化、实时追踪的新型工作机理，提出构建模式响应与待测物信息之间的以图像识别分析为路径的新型联络机制。基于片上无源平面光波导回路的传感器芯片，利用波导中传播光产生的面外弹性散射的捕获与成像，建立像素矩阵与传感器表面待测物信息的关联，实现高速、准确、简便、低成本，可复用的检测方案，通过分析面外散射图像，可建立起信号与待测物浓度的对应关系，利用高速成像的优势，可大大提高传感的时间分辨率。同时，对单芯片中多单元、多测量组进行同时拍照测量，可以“自检验”的方式提高精确度，也可实现面向多种待测生物标志物的多通道复用式检
测。以高速成像采集得到的大量数据可供各种深度学习技术训练，最终实现自动化、流程化归类、分析过程。
66.在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的步骤、方法不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种步骤、方法所固有的要素。
67.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。