靶向线粒体的异缩酮/ISOLEVUGLANDIN清除剂的制作方法

靶向线粒体的异缩酮/isolevuglandin清除剂
1.政府支持
2.无。
3.发明背景
4.本发明涉及源自花生四烯酸和其它多不饱和脂肪酸的高反应性脂质二羰基化物(lipid dicarbonyl)isolevuglandins(isolg，也称为异缩酮(isoketal)或γ
‑
酮醛)的靶向线粒体的清除剂、包含这种化合物的药物组合物，以及治疗包括炎症、氧化应激和/或线粒体功能障碍的病症的方法。
5.本发明的一方面是新的靶向线粒体的化合物。不受机制或理论的束缚，这些化合物不是典型的抗氧化剂，但它们清除炎症产物并保护内皮依赖性舒张。
6.高反应性脂质二羰基化物(如isolg)导致细胞功能障碍、细胞毒性和免疫原性，促进心血管疾病、高血压、癌症和神经变性中的炎症和组织损伤。
7.心血管疾病和癌症是西方社会的主要死因。在2002年，超过450,000名低于85岁的美国人死于癌症和心脏病。基于氧化应激在心血管疾病和癌症中的作用，本发明满足了长期以来对这两种病症的治疗需求。
8.美国大约有5000万人患有明显的高血压，高达60％的人口处于高血压前期。这是一个重要的医疗保健问题，因为高血压显著增加了死于卒中、缺血性心脏病和其它血管疾病的风险。一个重要的介质是激素血管紧张素ii，其增加口渴感，促进肾脏对盐的保留，引起血管收缩，及增强神经和肾上腺释放儿茶酚胺。血管紧张素ii还直接促进炎症和动脉粥样硬化的进展。高血压与血管氧化应激和反应性脂质二羰基化物(如isolg)的积累有关。在动物研究中，用水杨胺(2
‑
hoba)清除反应性脂质二羰基化物可减轻高血压，预防炎症及保护内皮依赖性舒张。
9.发明概述
10.本发明的一个实施方案是脂质二羰基化物的靶向线粒体的清除剂。
11.在一个实施方案中，所述化合物具有下式：
[0012][0013]
其中：
[0014]
x是键、
–
o
–
或
–
ch2–
；及
[0015]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。
[0016]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0017][0018]
其中：
[0019]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。
[0020]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0021][0022]
其中：
[0023]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。
[0024]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0025][0026]
其中：
[0027]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。
[0028]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0029][0030]
其中：
[0031]
x是键、
–
o
–
或
–
ch2–
；
[0032]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0033]
r1是取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐。
[0034]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0035][0036]
其中：
[0037]
各个r是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0038]
各个r1是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐。
[0039]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0040][0041]
其中：
[0042]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；r2选自
–
p
–
ph3；或
[0043]
及其立体异构体和药用盐。
[0044]
在另一个实施方案中，所述化合物具有下式：
[0045][0046]
及其立体异构体和药用盐。
[0047]
在本发明的另一个实施方案中，提供治疗、预防和改善个体的高血压的方法，其包括施用有效量的本发明的靶向线粒体的清除剂或其药学上可接受的盐。
[0048]
在本发明的另一个实施方案中，提供治疗、预防和改善个体的血管氧化应激的方法，其包括施用有效量的本发明的靶向线粒体的清除剂或其药学上可接受的盐。
[0049]
本发明的另一个实施方案是治疗、预防和改善血管氧化应激、改善血管功能和/或降低高血压中至少之一的方法，其包括向个体施用靶向线粒体cypd的化合物以抑制血管氧化应激、改善血管功能和/或降低高血压。
[0050]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0051][0052]
其中：
[0053]
x是键、
–
o
–
或
–
ch2–
；及
[0054]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐；所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0055]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0056]
[0057]
其中：
[0058]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐，所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0059]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0060][0061]
其中：
[0062]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐；所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0063]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0064][0065]
其中：
[0066]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐，所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0067]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0068][0069]
其中：
[0070]
x是键、
–
o
–
或
–
ch2–
；
[0071]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0072]
r1是取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐；所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0073]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0074][0075]
其中：
[0076]
各个r是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0077]
各个r1是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐；所述化合物用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0078]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0079][0080]
其中：
[0081]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；r2选自
–
p
–
ph3；或及其立体异构体和药用盐；其用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0082]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0083][0084]
及其立体异构体和药用盐；其用于治疗、预防和改善个体的高血压。
[0085]
附图简述
[0086]
图1是示出cypd高度乙酰化、血管氧化应激和高血压的示意图。本发明人已发现cypd高度乙酰化促进血管氧化应激并导致高血压，降低cypd乙酰化的措施和cypd抑制作用会改善血管功能及减轻高血压。
[0087]
图2a
‑
2d是一组图表，示出血管紧张素ii诱导的高血压(a)、血管线粒体和乙酰胆碱(c)或no供体snp(d)的主动脉血管舒张作用。通过遥测术测量血压。在输注盐水或ang ii(0.7mg/kg/天)14天后，处死小鼠以分离主动脉，以研究线粒体和血管舒张。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs wt ang ii，***p<0.01vs wt(n＝8)。
[0088]
图3a
‑
3d是一组图表，示出在高血压中靶向cypd的示例。在ang ii诱导的高血压(ang ii sfa)发生后，输注盐水(假处理组)、ang ii(0.7mg/kg/天)或用cypd阻断剂sanglifehrin a(sfa)治疗的c57bl/6j小鼠的血压。通过尾袖法测量血压(a)。3在盐水或ang ii输注14天后，处死小鼠以分离主动脉，以使用mitosox和hplc研究线粒体或者研究血管舒张。结果是平均值
±
sem(n＝6
‑
8)。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii，***p<0.01vs ang ii sfa(n＝8)。
[0089]
图4a
‑
4d是一组图表，示出用ang ii(10nm)、il17a(10ng/ml)和tnfα(1ng/ml)的组合离体处理24小时(ati)的血管中的线粒体和血管舒张(b，c，d)。主动脉分离自c57bl/6j(wt)、cypd
‑
/
‑
、tg
sod2
或mcat小鼠。通过mitosox和hplc测量线粒体3结果为平均值
±
sem(n＝8)。*p<0.01vs wt，**p<0.05vs wt ati。
[0090]
图5示出与血压正常的个体相比，原发性高血压患者的sirt3表达和线粒体蛋白(mito ac
‑
k)乙酰化的蛋白质印迹。结果是平均值
±
sem(n＝6)。*p<0.01vs正常血压的，**p<0.001vs正常血压的。
[0091]
图6示出高血压中的线粒体高度乙酰化和cypd
‑
/
‑
乙酰化。从输注ang ii的c57bl/6j和cypd
‑
/
‑
小鼠中切下的主动脉中分离的线粒体的蛋白质印迹。cypd乙酰化通过cypd免疫沉淀和使用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹测定。图6还示出来自三个实验的代表性印迹。
[0092]
图7示出cypd或gcn5l1乙酰化酶的消耗阻止刺激线粒体但sirt3消耗导致过量产生。将haec用ang ii(10ng/ml)和tnfα(1ng/ml)处理24小时，通过mitosox和hplc测量线粒体该图还示出了典型的cypd蛋白质印迹分析。结果是平均值
±
sem(n＝6)。*p<0.01vs假处理组，**p<0.05vs ns，***p<0.05vs ns，
§
p<0.05vs假处理组。
[0093]
图8示出isolg或isolg
‑
pe诱导的线粒体溶胀(a)和呼吸受损(b)。在加入adp(50μm)及测量耗氧量之前，将具有谷氨酸盐和苹果酸盐的完整小鼠肾线粒体与作为载体的乙醇、isolg(1μm)或isolg
‑
pe(1μm)一起温育(5分钟)。*p<0.001vs对照组，**p<0.03vs isolg。
[0094]
图9示出mito2hoba对线粒体氧化应激的抑制作用。在使用hplc通过mitosox测量线粒体和通过lc/ms测量心磷脂氧化(b)之前，将haec用mito2hoba(50nm)、2hoba或isolg失活的4hoba处理，并与ang ii(100nm)和tnfα(10nm)一起温育24小时。*p<0.001vs对照组，**p<0.01vs angii/tnfα。
[0095]
图10示出mito2hoba对于ang ii诱导的高血压、主动脉线粒体中的isolg加合物和cypd乙酰化的影响。(a)输注盐水(假处理组)或ang ii(0.7mg/kg/ml)的c57bl/6j小鼠的血压。在饮用水中补加mito2hoba(0.1g/l)。(b)主动脉线粒体isolg加合物(d11抗体)、cypd、gcn5l1、sirt3和cypd乙酰化(cypd i.p.和抗
‑
乙酰基
‑
k wb)的蛋白质印迹。结果是平均值
±
sem。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝8)。
[0096]
图11a
‑
11b示出线粒体isolg
‑
lys
‑
内酰胺蛋白质加合物的ls/ms/ms分析。(a)代表性lc/ms/ms谱图；(b)分离自饮水(假处理组)、mito2hoba(0.1g/l)和输注ang ii(0.7mg/kg/天)的小鼠的肾脏的线粒体中isolg
‑
lys
‑
内酰胺水平。结果是平均值
±
sem(n＝3)。*p<0.05vs ang ii。
[0097]
图12示出mito2hoba降低mptp开放及防止线粒体功能障碍。c57bl/6j小鼠输注ang ii(0.7mg/kg/ml)，mito2hoba在饮用水中(0.1g/l)。在ang ii输注14天后处死动物，并分离肾脏用于线粒体研究。向线粒体添加cacl2至高于ca
2
保留能力，导致mptp开放和线粒体溶胀。由于mptp开放增加，分离自输注ang ii的小鼠的线粒体具有显著降低的ca
2
保留能力，而cypd抑制剂环孢菌素a(csa)拯救ca
2
保留能力(a)。在具有谷氨酸盐和苹果酸盐的分离的肾线粒体中测量呼吸控制率(状态3/状态4)。对照水平是100％。(b)通过基于荧光素酶的发光测定法在新鲜分离的组织中测量肾atp。结果是平均值
±
sem。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝3
‑
8)。
[0098]
图13示出mito2hoba对输注ang ii的小鼠的主动脉和内皮no(b)的影响。(a)通过dhe探针和hplc测量主动脉(b)通过esr和fe(detc)2分析内皮no。c57bl/6j小鼠输注ang ii(0.7mg/kg/ml)，mito2hoba在饮用水中提供(0.1g/l)。结果是平均值
±
sem。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝6)。
[0099]
图14是一个示意图，表明以下发现：isolevuglandins激活cypd，其导致线粒体功能障碍、血管氧化应激和高血压，以及线粒体isolg的清除会减少内皮功能障碍及降低高血压。
[0100]
图15示出isolg与蛋白质赖氨酸和磷脂酰乙醇胺(pe)的反应以及2
‑
羟基苄胺(2hoba)或靶向线粒体的类似物mito2hoba对isolg的清除。
[0101]
图16示出mito2hoba对血管紧张素ii诱导的高血压和isolg线粒体蛋白加合物蓄积的影响。(a)输注盐水(假处理组)或ang ii(0.7mg/kg/ml)的c57bl/6j野生型小鼠的血压。在饮用水中补加mito2hoba(0.1g/l)。(b)如前所述，使用d11抗体在心脏线粒体中通过蛋白质印迹测量线粒体isolg。结果是平均值
±
sem。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝8)。
[0102]
图17示出高血压中的线粒体氧化应激。(a)输注盐水(假处理组)或ang ii(0.3mg/kg/天)的c57bl/6j野生型(wt)小鼠和mcat小鼠的收缩期血压。(b)通过lc
‑
ms测量心磷脂氧化。
36
在盐水或ang ii输注14天后处死小鼠以分离心脏用于测量心磷脂氧化。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝6)。
[0103]
图18是对分离自主动脉的线粒体中isolg蛋白质加合物的蛋白质印迹分析，所述主动脉从输注ang ii以及用mito2hoba处理的c57bl/6j小鼠切下(a)。通过cypd免疫沉淀和使用抗isolgd11抗体的蛋白质印迹确定cypd
‑
isolg修饰(b)。该图示出三个实验的代表性印迹。
[0104]
图19示出mito2hoba减轻线粒体功能障碍。(a)在具有谷氨酸盐和苹果酸盐的分离的肾线粒体中测量呼吸控制率(状态3/状态4)。对照水平是100％。(b)通过基于荧光素酶的发光测定法在新鲜分离的组织中测量肾atp。为c57bl/6j小鼠输注ang ii(0.7mg/kg/ml)，mito2hoba在饮用水中提供(0.1g/l)。在ang ii输注14天后处死动物，并分离肾脏用于线粒体和atp研究。结果是平均值
±
sem。*p<0.01vs假处理组，**p<0.01vs ang ii(n＝3
‑
8)。
[0105]
发明描述
[0106]
在公开和描述本发明化合物、组合物、制品、系统、装置和/或方法之前，应理解，除非另有说明，否则它们不限于特定的合成方法，或除非另有说明，否则不限于特定的试剂，因此当然可能会变化。还应当理解，本文使用的术语只为了描述特定方面，而不意在限制。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述示例性方法和材料。
[0107]
本文提及的所有出版物通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。本文论述的出版物仅是为了它们在本技术的提交日期之前公开而提供的。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，本文提供的出版日期可能不同于实际出版日期，可能需要单独确认。
[0108]
如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两个或更多个这样的官能团、烷基或残基的混合物等。
[0109]
本文可将范围表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一方面。还应理解的是，每个范围的端值不论是与另一个端值相关，还是与另一个端值不相关，都是有意义的。还应该理解，本文公开了许多数值，并且每个数值在本文中也被公开为“约”该特定数值以及该数值本身。例如，如果公开了数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解为特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0110]
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可
以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。
[0111]
如本文所用，术语“个体”是指给药对象。本文公开的方法的个体可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的个体可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不指具体的年龄或性别。因此，不论是雄性的还是雌性的成年和新生个体及胎儿都被涵盖。患者是指患有疾病或病症的个体。术语“患者”包括人和兽类个体。
[0112]
如本文所用，术语“治疗”是指患者的医学管理，其旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即特别地旨在改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即旨在消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症形成的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。
[0113]
如本文所使用的，术语“预防(prevent)”或“防止(preventing)”是指排除、阻止、避免、防止、预防或阻碍某事发生，尤其是通过提前行动。应当理解，除非另有明确说明，在本文使用减少、抑制或预防的情况下，也明确公开了其他两个词的使用。如本文中所见，治疗和预防的定义存在重叠。
[0114]
如本文所用，术语“经诊断的”意指已经由本领域技术人员(例如，医师)进行身体检查，并且发现其具有可被诊断或通过本文所公开的化合物、组合物或方法治疗的病症。如本文所用，短语“鉴定为需要治疗病症”等是指基于对治疗病症的需要选择个体。例如，基于本领域技术人员的早期诊断可以将个体鉴定为需要治疗病症(例如，与炎症有关的病症)，然后接受该病症的治疗。在一个方面，预期鉴别可以由与进行诊断的人不同的人来执行。在另一方面，还预期可由随后进行给药的人来给药。
[0115]
如本文所用，术语“施用(administering)”和“给药(administration)”是指向个体提供药物制剂的任何方法。这些方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于口服给药、透皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼科给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射，例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地给药制剂；即给药以治疗现有的疾病或病症。在其他各个方面，可以预防性地给药制剂；即给药以预防疾病或病症。
[0116]
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需结果或对不希望的病症具有效力的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不希望的症状具有效力，但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的特定化合物的排泄速度；治疗的持续时间；与所用特定化合物联合或同时使用的药物以及医学领域熟知的相似因素。例如，在本领域的技术范围内是：以低于达到期望的治疗效果所需的剂量的水平开始化合物的剂量，逐步增加剂量，直至达到期望的治疗效果。无需要，可将有效日剂量分为多个剂量用于给药。所以，单剂量组合物可含有这样的量或者其约数以达到每日剂量。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天以一或多次剂量给药施用，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。在其他各个方面，
制剂可以“预防有效量”给药；即，有效预防疾病或病症的量。
[0117]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在使用前重建成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或载剂包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素和它们合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如，可通过以下方式来维持合适的流动性：使用包衣材料例如卵磷脂，对于分散剂通过维持所需的粒径，以及使用表面活性剂。这些组合物也可以包含辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物的作用的预防可通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。也可能需要包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。通过形成药物在生物可降解聚合物(例如聚乳酸
‑
乙醇酸、聚(原酸酯)和聚酸酐)中的微胶囊基质，制成可注射的“储库”形式。取决于药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。通过将药物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中也制得贮库型可注射制剂。例如通过用留住细菌的滤器进行过滤，或在临使用之前通过掺入可以溶于或分散于无菌水或其他的无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂，将可注射的制剂灭菌。合适的惰性载体可包括糖，例如乳糖。以重量计，期望的是，至少95重量％的活性成份的颗粒具有0.01至10μm的有效粒径。
[0118]
如本文所用，术语“清除剂”或“清除”是指可以被给药以将杂质或不需要的反应产物除去或灭活的化学物质。例如，异缩酮不可逆地与蛋白质上的赖氨酸残基特异性加合。本发明的异缩酮清除剂在异缩酮与赖氨酸残基加合之前与异缩酮反应。因此，本发明化合物“清除”异缩酮，从而防止它们与蛋白质加合。
[0119]
如本文所使用，术语“取代的”旨在包括有机化合物所有可允许的取代基。在一个概括的方面，可运许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的或无支链的、碳环的和杂环的、芳香性的和非芳香性的取代基。示例性的取代基包括例如下面所述的那些取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可为一个或多个并其可相同或不同。为了本发明目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的、符合杂原子化合价的、有机化合物的任何可允许的取代基。不欲以任何方式通过有机化合物的可允许的取代基限制本发明。而且，术语“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即此类取代符合被取代的原子及取代基的允许的化合价，并且该取代形成稳定的化合物，例如不会通过诸如重排、环化、消去等自发进行转变的化合物。
[0120]
本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链的。烷基也可以是取代的或未取代的。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。“低级烷基”基团是含有1至6个(例如，1至4个)碳原子的烷基。
[0121]
在整个说明书中，“烷基”通常用于表示未取代的烷基和取代的烷基二者；然而，取代的烷基在本文中也通过鉴定该烷基上的特定取代基而被具体提及。例如，术语“卤代烷
基”具体是指被一个或多个卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个如下所述的烷氧基取代的烷基。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个如下所述的氨基取代的烷基，等等。当在一种情况下使用“烷基”并且在另一种情况下使用例如“烷基醇”的特定术语时，并不表示意指术语“烷基”也不是指例如“烷基醇”之类的特定术语等。
[0122]
本发明的实施方案包括治疗、预防和改善个体的高血压的方法。
[0123]
本发明的其它实施方案包括治疗、预防和改善个体的血管氧化应激的方法。
[0124]
本发明的其它实施方案包括靶向线粒体cypd以抑制血管氧化应激、改善血管功能和/或降低高血压的方法。
[0125]
本发明首次将cypd明确为治疗高血压的靶点。在过去的30年里，没有针对这种疾病的在机制上新颖的治疗。本发明的靶向cypd的抗高血压药剂可以加入目前可用的治疗设备中以改善高血压的治疗。
[0126]
花生四烯酸的自由基氧化产生高反应性isolevuglandins(isolg)，其通过开放线粒体通透性转换孔(mptp)导致线粒体功能障碍。对mptp调节亚基亲环蛋白d的抑制减少isolg诱导的线粒体功能障碍(free radic biol med 2010；49(4):567
‑
79)。本发明人发现亲环蛋白d的消耗减少线粒体改善血管舒张及降低高血压(hypertension 2016；67(6):1218
‑
27)。本发明人测试了其假设，即高血压与线粒体isolg的累积有关，而靶向线粒体的isolg清除剂降低血管氧化应激并减轻高血压。本发明人通过将亲脂性阳离子三苯基甲基鏻与2
‑
羟基苄胺(2hoba)缀合，开发了新型靶向线粒体的isolg清除剂化合物，包括4
‑
(氨基甲基)
‑3‑
羟基苯氧基)丁基)三苯基鏻(mito2hoba)化合物。mito2hoba是一种水溶性化合物，其被培养的人主动脉内皮细胞(haec)和接受含有其的饮用水的小鼠很好地耐受。已发现在与tnfα 血管紧张素ii一起温育的heac中，mito2hoba(50nm)抑制线粒体产生(mitosox/hplc)及防止心磷脂氧化(ls
‑
ms)，而2hoba(50nm)则无效。使用高血压的血管紧张素ii模型在体内测试了线粒体isolg的功能性作用。c57bl/6j小鼠输注ang ii(0.7mg/kg/天)或盐水(假处理组)，并且接受在饮用水中的mito2hoba(0.1g/l)。还发现mito2hoba显著减轻血管紧张素ii诱导的高血压。通过使用d11抗体进行心脏线粒体的蛋白质印迹分析来测量，高血压与增加的线粒体isolg形成有关，mito2hoba降低输注血管紧张素ii的小鼠的心脏线粒体中isolg加合物的蓄积。no的减少是血管氧化应激所致高血压中内皮功能障碍的标志。
[0127]
本发明人通过使用荧光探针dhe和hplc测量主动脉以及使用电子自旋共振和特异性no自旋捕捉剂fe(detc)2分析内皮no，检验了血管氧化应激。发现mito2hoba降低输注血管紧张素ii的小鼠中血管及保留内皮no。
[0128]
以2
‑
羟基苄胺(2
‑
hoba，水杨胺)为例的2
‑
氨基甲基苯酚对于导致疾病的二羰基化物表现出非凡的反应性。
[0129][0130]
线粒体是氧化的部位，可能会被氧化应激的产物破坏，其归因于许多疾病，包括多发性硬化症。虽然可以预期2
‑
hoba清除这些反应性分子并提供保护，但需要对其进行修饰才能进入线粒体。过去已经成功地使用某些阳离子连接物(attachment)来实现这一点。
[0131]
本发明的实施方案包括一系列靶向线粒体的化合物。本发明的一个实施方案是下式的化合物：
[0132][0133]
其中：
[0134]
x是键/
–
o
–
或
–
ch2–
；及
[0135]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0136][0137]
其中：
[0138]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0139][0140]
其中：
[0141]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。本发明的另一个实施
方案是下式的化合物：
[0142][0143]
其中：
[0144]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及其立体异构体和药用盐。本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0145][0146]
其中：
[0147]
x是键、
–
o
–
或
–
ch2–
键；
[0148]
r是取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0149]
r1是取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐。
[0150]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0151][0152]
其中：
[0153]
各个r是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基；及
[0154]
各个r1是独立的并且选自取代或未取代的c1至c
12
烷基或乙酰氧甲基；及其立体异构体和药用盐。
[0155]
本发明的另一个实施方案是使用亲脂性酯(优选乙酰氧甲基)将“前药”运输穿过
膜并通过细胞内酯酶水解释放被截留在细胞区室内的离子酸。
[0156][0157]
本发明的另一方面是在水解时增加所得的2
‑
hoba的离子性质的其它化合物。
[0158][0159]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0160][0161]
及其立体异构体和药用盐。
[0162]
本发明的实例包括以下化合物：
[0163][0164]
及其立体异构体和药用盐。
[0165]
i.高血压
[0166]
高血压是西方社会的主要健康问题，也是卒中、心肌梗塞和心力衰竭的危险因素。尽管使用多种药物，仍有三分之一的患者血压控制不佳，这可能是由于导致高血压的机制不受当前治疗的影响。在过去的几年里，我们已经证明线粒体在高血压中功能异常，并明确了线粒体超氧化物在这种疾病中的新作用。本发明人已表明线粒体亲环蛋白d(cypd)在通过血管紧张素ii和细胞因子刺激线粒体中的关键作用。cypd是线粒体通透性转换孔(mptp)的调节亚基。本发明人发现，遗传性cypd消耗减弱了高血压，而在高血压发生后用cypd抑制剂治疗降低了血压。本发明的一个方面是确定血管cypd的作用及靶向cypd在血管功能障碍和高血压中的治疗潜力。本发明人在患有原发性高血压的动物和人类个体中的研究表明k166乙酰化激活cypd，这是由于gcn5l1乙酰转移酶和降低的sirt3脱乙酰酶活性之间的不平衡。sirt3水平在高血压中降低，剩余的sirt3被高反应性的线粒体脂质二羰基化物isolevuglandins(isolg)阻断，而isolg清除防止了cypd高度乙酰化并降低高血压(图1)。
[0167]
本发明明确了cypd为治疗高血压的新靶点。在过去的30年里，没有针对这种疾病的在机制上新颖的治疗。靶向cypd的新类型抗高血压药剂可以加入目前可用的治疗设备中以改善高血压的治疗。不受机制或理论的束缚，本发明人已发现在内皮和平滑肌中特异性cypd消耗降低血管氧化应激，保护血管舒张并减轻高血压；cypd
‑
k166乙酰化导致血管功能障碍和高血压；在高血压发生后抑制cypd及阻断cypd高度乙酰化改善血管功能。
[0168]
本发明满足了长期以来的需要，因为临床数据表明三分之一的成年人口患有高血压，估计全世界有14亿人患有高血压。这种疾病是卒中、心肌梗塞和心力衰竭的主要危险因素。尽管使用多种药物进行治疗，但仍有三分之一的高血压患者处于高血压状态，这可能是由于其机制不受当前治疗的影响；然而，在过去的30年里没有针对高血压的在机制上新颖的治疗。因此，新类型的抗高血压药剂可以加入目前可用的治疗设备中，以改善高血压的治疗。
[0169]
高血压是一种多因素病症。然而，在几乎所有的高血压实验模型中，活性氧(ros：和h2o2)的产生在多个器官中均增加。在脑中，ros促进神经元放电，增加交感神经传出。在肾中，ros在多个部位起作用以促进钠重吸收和容量保留。在脉管系统中，ros促进血管收缩和重塑，增加全身血管阻力。我们的研究小组已经揭示了导致高血压的几种ros来源，包括nadph氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶和线粒体，并确定了其相互作用。ros过量产生导致氧化应激，其促进高血压中的靶器官损伤。目前尚无抗氧化疗法，常见的抗氧化剂如抗坏血酸盐和维生素e在预防心血管疾病和高血压方面无效，但特异性靶向线粒体的疗法代表了减少靶器官损伤的有希望的策略。
[0170]
线粒体功能障碍导致高血压和心血管疾病的发病；然而，尽管线粒体在人类健康和疾病中起着核心作用，但尚无批准的直接靶向线粒体的药物。线粒体功能障碍的特征在于受损的atp产生和增加的氧化应激，导致细胞功能障碍和细胞凋亡。线粒体通透性转换孔(mptp)在线粒体功能障碍和高血压终末器官损伤中起关键作用。本发明人发现，mptp开放的调节亚基亲环蛋白d(cypd)的消耗或抑制改善血管功能并减轻高血压。先前的研究表明cypd与细胞死亡有关，而本发明人表明cypd在血管氧化应激和内皮功能障碍中至关重要。本发明人的数据表明cypd乙酰化和反应性isolevuglandins(isolg)在mptp开放和血管功能障碍中的新作用。
[0171]
本发明人先前已报道抑制分离自内皮细胞的线粒体中的cypd防止超氧化物过量产生，在这项工作中，我们提出血管cypd的遗传缺失或cypd的特异性抑制会减少血管氧化应激，改善内皮功能并降低高血压。
[0172]
本发明人已经表明与野生型c57bl/6j小鼠相比，cypd敲除小鼠中cypd缺乏(cypd
‑
/
‑
)在输注了血管紧张素ii(angii)的小鼠中防止线粒体的过度产生(图2a)，减轻高血压(图2b)，改善内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张(图2c、d)。
[0173]
本发明的一方面是在高血压发生后靶向cypd。本发明人将含有ang ii(0.7mg/kg/天)的渗透泵植入野生型小鼠，并在ang ii诱导的高血压发生后开始用sanglifehrin a治疗(图3a)。事实上，用cypd抑制剂sanglifehrin a(腹腔注射，10mg/kg/天)治疗高血压小鼠降低了血压(图3a)，使线粒体的产生正常化(图3b)并改善血管舒张(图3c、d)。
[0174]
本发明人已经发现血管紧张素ii和细胞因子协同诱导cypd依赖性血管功能障碍。il17a和tnfα是ang ii诱导的高血压所必需的。这些细胞因子通常与人类高血压有关，并有助于这种疾病的发病。本发明表明ang ii、il17a和tnfα在内皮细胞中协同诱导线粒体在分离自过表达线粒体清除剂sod2(tg
sod2
)或靶向线粒体的h2o2清除剂过氧化氢酶(mcat)的小鼠的主动脉段中测试cypd
‑
/
‑
依赖性血管氧化应激的功能作用。本发明人的数据表明用ang ii il17a tnfα(ati)处理主动脉血管导致内皮依赖性血管舒张的严重受损，这在分离自cypd
‑
/
‑
小鼠的主动脉中被阻止。令人感兴趣的是，sod2过表达或靶向线粒体的过氧化氢酶的表达显著减轻了血管舒张的受损，类似于cypd缺失提供的保护作用(图4)。
[0175]
这些数据表明，ang ii和细胞因子的促氧化环境导致严重的血管氧化应激，减少内皮no并损害血管舒张，这可以通过在来自tg
sod2
和mcat小鼠的血管中消耗cypd或清除线粒体o2·
和h2o2来阻止。此外，本发明人的数据证实cypd在调节血管氧化应激中的重要作用——cypd在高血压中在线粒体氧化应激的刺激和血管功能障碍方面的关键作用；然而，
cypd激活的具体途径尚不清楚。
[0176]
高血压随着年龄增加与sirt3表达的下降有关。本发明人发现sirt3失活导致在人高血压中线粒体高度乙酰化。本发明人分析了患有原发性高血压的人类个体中sirt3表达和乙酰化线粒体蛋白。对外周血单核细胞进行的蛋白质印迹表明在高血压个体中，sirt3蛋白水平降低1.4倍，线粒体乙酰化增加2.6倍(图5)。
[0177]
本发明人最近报道了通过质谱分析和蛋白质印迹测量的在人高血压和小鼠高血压模型中的线粒体高度乙酰化。高血压中线粒体高度乙酰化伴随着cypd乙酰化，这代表功能获益，并促进mptp开放。为了对此进行检验，本发明人测量了分离自正常血压和高血压小鼠的主动脉线粒体中线粒体蛋白质的总乙酰化和特异性cypd乙酰化。野生型和cypd
‑
/
‑
小鼠输注14天ang ii(0.7mg/kg/天)或盐水(载体)，处死小鼠并从主动脉中分离线粒体用于蛋白质印迹研究。蛋白质印迹分析显示，与假处理组野生型小鼠相比，在分离自输注ang ii的高血压小鼠的线粒体裂解物中的总赖氨酸乙酰化(ac
‑
k ab)明显增加。在cypd免疫沉淀后，蛋白质印迹未显示正常血压和高血压小鼠中cypd水平(wt cypd)的变化；然而，在分离自高血压小鼠的主动脉线粒体中cypd乙酰化显著增加。要注意的是，cypd
‑
/
‑
小鼠被保护免受高血压和内皮功能障碍的影响(图2和4)，蛋白质印迹未显示来自cypd
‑
/
‑
小鼠的样品中的cypd或cypd乙酰化，证实了蛋白质印迹的特异性。
[0178]
cypd乙酰化在内皮功能障碍中的作用尚不清楚。然而，赖氨酸166的乙酰化是一种功能获益，其促进mptp开放和线粒体sirt3使cypd
‑
k166去乙酰化。cypd抑制剂如环孢菌素a与k166结合紧密并阻止cypd介导的mptp开放。在肌细胞中，k166突变为精氨酸(cypd
‑
k166r)模拟去乙酰化并减弱mptp开放，而k166突变为谷氨酰胺((k166q)模拟乙酰化，增强mptp开放并加剧缺血
‑
再灌注损伤。gcn5l1介导的乙酰化反调节sirt3介导的去乙酰化。本发明人表明在内皮细胞中，gcn5l1的消耗减少线粒体o2·
，而sirt3脱乙酰酶的消耗增强线粒体o2·
的产生。用非沉默sirna(ns)、gcn5l1 sirna、sirt3 sirna或cypd sirna转染人主动脉内皮细胞(haec)。转染后三天，用ang ii和tnfα刺激细胞，通过hplc分析mitosox的o2·
特异性产物mito
‑
2oh
‑
e

测量o2·
。发现类似于cypd消耗，gcn5l1的消耗消除了o2·
过量产生，而sirt3的消耗增加基础和受刺激的线粒体o2·
(图7)。这些数据支持cypd乙酰化在内皮氧化应激中的作用。
[0179]
本发明人还了解到衍生自花生四烯酸的高反应性脂质二羰基化物isolevuglandins(isolg)是致病活性氧与疾病进展之间的关联机制，发现线粒体的急性isolg暴露诱导cypd依赖性mptp开放及抑制线粒体呼吸(图8)。反应性isolg产生蛋白质
‑
赖氨酸加合物和细胞毒性isolg
‑
磷脂酰乙醇胺加合物(isolg
‑
pe)，其可以独立地导致线粒体功能障碍。事实上，用isolg
‑
pe对分离的线粒体进行急性处理使呼吸抑制达41％，而类似剂量的isolg使呼吸降低达74％，这支持了isolg
‑
pe和isolg蛋白
‑
赖氨酸加合物二者在线粒体功能障碍中的潜在作用。
[0180]
本发明人通过将亲脂性阳离子三苯基鏻与2hoba缀合，开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba。活细胞内线粒体的膜电位在内部为负(
‑
150mv)。由于该膜电位比细胞内其它细胞器高得多，因此三苯基鏻亲脂性阳离子选择性地在线粒体基质中蓄积超过五百倍。
[0181]
本发明人揭示了mito2hoba减少线粒体o2·
产生并抑制心磷脂氧化，并表明线粒体
氧化应激产生isolg而isolg的清除改善了线粒体功能。将在培养的人主动脉内皮细胞(haec)中的线粒体o2·
和心磷脂氧化(线粒体功能障碍和氧化应激的特异性标志)与ang ii和tnfα一起温育。以组合形式选择这些药剂是因为我们已经证明它们二者均导致高血压的内皮功能障碍。ang ii tnfα诱导线粒体氧化应激，如通过线粒体o2·
增加2倍和心磷脂氧化增加2.5倍所测量的。用靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba(50nm)处理减小了线粒体氧化应激(图9a)，而需要更高浓度的非靶向的2hoba以具有类似的保护作用。mito2hoba在预防心磷脂氧化方面比2hoba更有效(图9b)。这些数据支持了之前未确定的isolg在线粒体功能障碍中的作用，并证实使用非常低剂量的mito2hoba进行治疗的可行性。
[0182]
本发明人表明mito2hoba减轻高血压、减少线粒体isolg并防止cypd高度乙酰化，以及用靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba进行治疗降低血管氧化应激、保护内皮功能及减轻高血压。为假处理组小鼠或输注ang ii的小鼠补充在饮用水(0.1g/l)或清水中的mito2hoba。mito2hoba显著减轻ang ii诱导的高血压(图10a)。在输注ang ii 14天后，处死动物，分离主动脉以用于蛋白质印迹研究。通过d11抗体测量，高血压与线粒体isolg加合物的大量增加有关，而mito2hoba防止isolg加合物蓄积。cypd表达没有改变；然而，在高血压小鼠中乙酰转移酶gcn5l1增加，去乙酰化酶sirt3减少。这导致线粒体乙酰化和脱乙酰化途径之间的不平衡，导致线粒体蛋白的高度乙酰化，通过ac
‑
k和cypd高度乙酰化测得。mito2hoba纠正了gcn5l1与sirt3之间的不平衡，减少线粒体ac
‑
k并防止cypd高度乙酰化，这使线粒体isolg与cypd乙酰化有关(图10b)。
[0183]
mito2hoba防止ang ii诱导的线粒体isolg
‑
lys
‑
内酰胺蛋白加合物的蓄积，而且如前所述，本发明人在提取的蛋白质经蛋白水解消化后通过液相色谱串联质谱法(lc/ms)测量了isolg
‑
lysyl
‑
内酰胺加合物。证实高血压与线粒体isolg
‑
赖氨酰
‑
内酰胺蛋白加合物增加4倍有关；以及补充靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba消除了线粒体中isolg
‑
赖氨酰
‑
内酰胺加合物的形成(图11)。
[0184]
高血压损害线粒体功能，mito2hoba减轻线粒体功能障碍，高血压中线粒体isolg的累积促进cypd乙酰化和mptp开放，损害线粒体呼吸及减少atp。用mito2hoba清除线粒体isolg防止了这些有害影响。本发明人分析了分离自对照小鼠(假处理组)、饮用mito2hoba的小鼠、输注ang ii的小鼠及输注ang ii并补充mito2hoba的小鼠(mito2hoba ang ii)的肾组织。事实上，输注ang ii降低ca
2
保留能力，增加mptp开放、损害线粒体呼吸及减少肾atp；然而，补充mito2hoba减少cypd乙酰化，减弱mptp开放，保护线粒体呼吸并保持正常atp(图10、12)。这些数据表明线粒体isolg在线粒体功能障碍和高血压中的病理生理作用。
[0185]
因此，本发明的一个实施方案是mito2hoba化合物，其降低血管氧化应激和改善内皮功能。本发明人首次表明血管o2·
过量产生导致高血压中的内皮功能障碍。除其他作用外，o2·
使内皮一氧化氮(no)失活，促进血管收缩和血管重塑，最终增加全身血管阻力。因此，由于no氧化、no产生减少和enos解偶联，no生物利用度降低是高血压中内皮氧化应激的标志。如我们之前所述，我们使用荧光o2·
探针dhe和hplc测量了主动脉o2·
。通过电子自旋共振(esr)和特异性no自旋捕捉剂fe(detc)2量化内皮no。如图13所示，本发明人发现mito2hoba在输注ang ii的小鼠中降低血管o2·
及保持no生物利用度。这些数据证实先前未被认识的线粒体isolg在血管氧化应激和内皮功能障碍中的作用。
[0186]
ii.血管氧化应激
[0187]
本发明人已发现线粒体在高血压中功能异常，并确定了线粒体氧化应激在这种疾病中的新作用。线粒体是超氧化物自由基的主要来源，且富含不饱和脂肪酸。花生四烯酸的自由基氧化产生高反应性isolevuglandins(isolg)，本发明人已发现其通过开放线粒体通透性转换孔(mptp)而导致线粒体功能障碍，mptp调节亚基亲环蛋白d(cypd)的抑制降低isolg诱导的线粒体功能障碍。最近，我们发现通过cypd消耗或cypd抑制对mptp开放加以抑制减少线粒体改善血管舒张及降低高血压。本发明人还开发了新的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba化合物。这种新型化合物减少线粒体isolg蛋白加合物，抑制心磷脂氧化(线粒体氧化应激的特异性标志)，减少血管使内皮一氧化氮正常化及降低高血压。这些数据与线粒体氧化应激的前馈刺激一致，并显示了靶向线粒体的isolg在治疗心血管疾病中的治疗益处。isolg导致cypd介导的线粒体功能障碍，导致终末器官损伤，减少线粒体isolg的措施会减少cypd激活及改善血管功能。这一新概念可导致将线粒体isolg明确为心血管疾病治疗的新靶点的思维转变(图14)。
[0188]
活性氧(ros：o2·
和h2o2)的产生在高血压中在多个器官均增加，包括大脑的关键中枢、脉管系统和肾。本发明人已经表明了导致高血压的ros的几种来源，包括nadph氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶和线粒体，并确定了其相互作用。同时，目前尚无抗氧化疗法，常见的抗氧化剂如抗坏血酸盐和维生素e在预防心血管疾病和高血压方面无效，因为这些药剂不可能到达产生ros的重要部位，如线粒体。此外，本发明人还发现了导致高血压中线粒体功能障碍和终末器官损伤的新的isolg依赖性机制。本发明的化合物靶向线粒体isolg以减少线粒体氧化应激、改善血管功能和降低高血压。
[0189]
为了证实在线粒体中清除isolg以改善线粒体功能的实例，开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba化合物。(例如见图15)。活细胞内线粒体的膜电位在内部为负(
‑
150mv)。由于该膜电位比细胞内其它细胞器高得多，因此亲脂性阳离子如三苯基鏻(tpp)选择性地在线粒体内蓄积。因此，与tpp缀合的分子靶向线粒体。例如，mitotempo在线粒体基质中浓缩超过五百倍。
[0190]
以上示例是一种水溶性化合物，其可以在培养基中提供给细胞，以及在饮用水中提供给动物。在我们的初步体外和体内实验中，mito2hoba在高达200nm的浓度下被培养的人主动脉内皮细胞(haec)良好地耐受，以及当在饮用水中以0.1
‑
0.3g/l的剂量施用时被良好地耐受。分离自通过饮用水接受5天mito2hoba(0.1g/l)的小鼠的肾脏和心脏线粒体的质谱分析证实线粒体部分中mito2hoba在μm水平的优势蓄积(80％)。同样，用mito2hoba(0.1μm)温育分离的线粒体导致mito2hoba在线粒体粒中大量蓄积400至600倍(图15，插入部分)。
[0191]
本发明人将具有ang ii(0.7mg/kg/天)或盐水(假处理组)的渗透微型泵植入接受在饮用水(0.1g/l)或清水中的mito2hoba的c57bl/6j小鼠中。发现补充mito2hoba明显减轻ang ii诱导的高血压(图16a)。在ang ii输注14天后，处死小鼠，分离心脏用于线粒体研究，分离主动脉用于分析血管o2·
和内皮一氧化氮。正如所预期的，通过使用d11抗体对心脏线粒体进行蛋白质印迹分析测量，高血压与增加的线粒体isolg形成有关。此外，mito2hoba减少输注ang ii的小鼠心脏线粒体中isolg加合物的蓄积(图16b)。
[0192]
为了表明高血压与线粒体氧化应激相关以及清除线粒体h2o2会减少线粒体功能障碍和减轻高血压，本发明人研究了c57bl/6j野生型(wt)小鼠和表达靶向线粒体的h2o2清除
剂过氧化氢酶的转基因小鼠(mcat)。输注低剂量的ang ii(0.3mg/kg/天)在野生型小鼠中升高血压(136mm hg)，但在mcat小鼠中不升高血压(115mm hg)(图17b)。在ang ii输注14天后，处死小鼠，分离心脏以测量线粒体氧化应激的标志，即之前我们描述的心磷脂氧化。正如所预期的，高血压与野生型小鼠的心磷脂氧化增加有关。令人感兴趣的是，在输注ang ii的mcat小鼠中，心磷脂氧化被完全消除(图17b)。
[0193]
这些数据支持了以前未被认识到的线粒体氧化应激和线粒体isolg在内皮功能障碍和高血压中的作用。如上所示，本发明人表明，与野生型c57bl/6j小鼠相比，cypd
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小鼠中cypd的缺乏减轻ang ii诱导的高血压，防止线粒体o2·
的过度产生，改善内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张(图9)。
[0194]
为了确定cypd
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isolg相互作用在血管细胞线粒体中的潜在作用，本发明人从输注ang ii的小鼠切下的主动脉分离了线粒体部分，使用抗isolgd11抗体测量了isolg
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蛋白加合物的形成。
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ang ii诱导的高血压与主动脉中线粒体isolg的大量增加有关，补充mito2hoba减弱了线粒体isolg的蓄积(图18a)。通过cypd免疫沉淀和使用抗isolgd11抗体的蛋白质印迹测定潜在的cypd
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isolg加合物形成。数据显示ang ii输注增加了线粒体中的蛋白质isolg加合物和cypd
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isolg，而mito2hoba使其减少(图18b)。
[0195]
高血压损害线粒体功能，而mito2hoba减轻线粒体功能障碍。基于上述结果，本发明人假设高血压中线粒体isolg的累积导致线粒体呼吸受损和atp产生减少，使用mito2hoba清除线粒体isolg改善线粒体呼吸并保持atp合成。为了证实这一点，本发明人分析了分离自对照小鼠(假处理组)、饮用mito2hoba的小鼠(mito2hoba)、输注ang ii的小鼠(ang ii)及输注ang ii并补充mito2hoba的小鼠(mito2hoba ang ii)的肾组织。发现在输注ang ii的高血压小鼠的肾脏中，线粒体呼吸受损，肾脏atp水平显著降低。令人感兴趣的是，向输注ang ii的小鼠补充mito2hoba保护了线粒体呼吸并保持正常的atp产生(图19)。这些数据表明线粒体isolg在与高血压相关的线粒体功能障碍中的病理生理作用。
[0196]
很明显，这样描述的本发明可以许多方式变化。对本领域技术人员来说显而易见的此类变化应被认为是本公开的旁支。
[0197]
除非另有说明，本说明书中所用的表示成分的量、诸如反应条件的性质等的所有数字应理解为在所有情形下都由术语“大约”修饰。因此，除非有相反的指示，说明书和权利要求书中所述的数值参数都是近似值，其可根据本发明寻求确定的所需性能而变化。
[0198]
虽然阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在实验部分或实例部分所给出的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值都固有地包含必然由它们各自的试验测量中存在的标准偏差造成的一定误差。