一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法与流程

一种检测sars
‑
cov
‑
2中和抗体的试剂盒及方法
技术领域
1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种检测sars
‑
cov
‑
2中和抗体的试剂盒及方法。


背景技术：

2.sars
‑
cov
‑
2表面刺突蛋白(spike protein)是冠状病毒表面重要的受体结合位点，其可与细胞表面病毒特异性受体结合、介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附及穿膜；冠状病毒s蛋白受体结合域(receptor binding domain，rbd)可与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin
‑
converting enzyme2，ace2)结合，并使病毒进入宿主细胞。
3.当sars
‑
cov
‑
2侵入机体时，会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，具有识别病毒表面蛋白、阻断其与人体细胞表面特异性受体结合的功能，从而发挥抗病毒作用。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。
4.现有的对sars
‑
cov
‑
2的检测方法主要有核酸检测和抗体检测，主要方法有荧光pcr法、酶联免疫吸附法、胶体金层析法、化学发光法，其中核酸检测灵敏度高，特异性强，准确度高，但是对操作要求相对较高，检测时间长。抗体检测灵敏度较高，特异性较强，但是需要在被感染7
‑
14天后才能出现igm/igg抗体。而且目前这些方法只能检测是否处于感染期，并不能针对治愈后患者是否存在再感染风险，以及普通大众是否存在暴露及感染风险等进行确认。因此迫切需要新的检测sars
‑
cov
‑
2的方法。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种检测sars
‑
cov
‑
2中和抗体的试剂盒及方法，其具有下列性质中的一种或多种：1)rbd、ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc融合后，与天然结构的蛋白相比，具有更好的稳定性和反应性；2)提高了检测灵敏度；3)可以判断covid
‑
19疫苗的临床疗效，并评价个体自身免疫效果；4)可以判断是否存在sars
‑
cov
‑
2再次感染的风险；和5)参比抗体具有良好的中和效果，能很好地模拟人体内中和抗体的天然形式。
6.一方面，本技术提供了一种sars
‑
cov
‑
2中和抗体的检测试剂盒，其包含：
7.1)sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
8.2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述sars
‑
cov
‑
2中和抗体竞争结合所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
9.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd。
10.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
11.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
12.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd，且所述rbd与fc区直接或间接连接。
13.在某些实施方式中，所述rbd与所述fc在框内融合。
14.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
15.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:6
‑
11中任一项所示的氨基酸序列。
16.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
17.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段固定在固体支持物上。
18.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
19.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
20.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ecd。
21.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连接。
22.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
23.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
24.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含seq id no:1
‑
5中任一项所示的氨基酸序列。
25.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
26.在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
27.在某些实施方式中，所述竞争结合剂的浓度为100ng/ml
‑
2000ng/ml。
28.在某些实施方式中，所述的试剂盒还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
29.在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
30.在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
31.在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
32.在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；所
述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
33.在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
34.在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
35.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
36.在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
37.另一方面，本技术提供了一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：使用所述的试剂盒。
38.另一方面，本技术提供了一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：
39.1)包被sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段于固相支持物中；
40.2)将待测样品加入步骤1)中与所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段反应；
41.3)将竞争结合剂加入步骤2)中；
42.4)检测所述待测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体；
43.其中，所述竞争结合剂包含能够与所述sars
‑
cov
‑
2中和抗体竞争结合所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd；所述竞争结合剂包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
44.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
45.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
46.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd，且所述rbd与fc区直接或间接连接。
47.在某些实施方式中，所述rbd与所述fc在框内融合。
48.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
49.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:6
‑
11中任一项所示的氨基酸序列。
50.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
51.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段固定在固体支持物上。
52.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
53.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
54.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ecd。
55.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连
接。
56.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
57.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
58.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含seq id no:1
‑
5中任一项所示的氨基酸序列。
59.在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
60.在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
61.在某些实施方式中，所述竞争结合剂的浓度为100ng/ml
‑
2000ng/ml。
62.在某些实施方式中，所述的试剂盒还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
63.在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
64.在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
65.在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
66.在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；所述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
67.在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
68.在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
69.在某些实施方式中，所述样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
70.在某些实施方式中，所述样品源自受试者。
71.在某些实施方式中，所述受试者为covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
72.另一方面，本技术一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：
73.1)包被ace2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
74.2)将待测样品与sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后产物；
75.3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
76.4)检测所述待测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体；
77.其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd，且所述rbd包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述rbd的存在和/或含量的信号。
78.在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
79.在某些实施方式中，所述rbd与fc区直接或间接连接。
80.在某些实施方式中，所述rbd与所述fc在框内融合。
81.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
82.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
83.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:8所示的氨基酸序列。
84.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
85.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
86.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
87.在某些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
88.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连接。
89.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
90.在某些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
91.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
92.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
93.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
94.在某些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml
‑
2000ng/ml。
95.在某些实施方式中，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph为6.0
‑
9.6。
96.在某些实施方式中，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl，其中：所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、
hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
97.在某些实施方式中，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；所述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
98.在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
99.在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
100.在某些实施方式中，所述待测样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
101.在某些实施方式中，所述待测样品源自受试者。
102.在某些实施方式中，所述受试者为covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
103.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
104.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
105.图1显示的是本技术所述校准品模拟出的中和抗体在人体内含量变化的趋势。
106.图2显示的是本技术所述cutoff值的roc曲线。
具体实施方式
107.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
108.术语定义
109.在本技术中，术语“样品”通常是指含有或假定含有抗体，尤其是包含sars
‑
cov
‑
2中和抗体的任何物质。“样品”可以是天然或合成来源的，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式获得。“样品”可以是从受试者分离的组织或液体样品，包括但不限于尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。样品可以是研究样品和临床样品。样品也可以是用于输血或治疗的血液样品。样品也可以是合成的并且包括但不限于体外细胞培养成分，包括但不限于条件培养基、重组细胞和细胞组分。在本技术中，术语“样品”和“样
本”可以互换使用。
110.在本技术中，术语“检测”通常是指发现某物的存在或出现。
111.在本技术中，术语“抗原”通常是指促使抗体产生并且可以引起免疫反应的物质。它们还可以用于诊断或患者选择或表征目的。
112.在本技术中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scfv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，fab、fab’和(fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(vh)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(vl)和轻链恒定区构成。vh和vl区可进一步被区分为称为互补决定区(cdr)的高变区，它们散布在称为构架区(fr)的更保守的区域中。每个vh和vl可由三个cdr和四个fr区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
113.在本技术中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下片段来实现：包括fv、scfv、dsfv、fab、fab’或f(ab’)2的片段的重链，或者，包括fv、scfv、dsfv、fab、fab’或f(ab’)2的片段的轻链。(1)fab片段，即由vl、vh、cl和ch结构域组成的一价片段；(2)f(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(3)由vh和ch结构域组成的fd片段；(4)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(5)由vh结构域组成的dab片段(ward等，(1989)nature 341：544
‑
546)；(6)分离的互补决定区(cdr)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的cdr的组合。此外，还可包括由vl和vh配对形成的一价单链分子fv(scfv)(参见bird等(1988)science 242：423
‑
426；以及huston等(1988)proc.natl.acad.sci.85：5879
‑
5883)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链ch2恒定区；和(3)与ch2恒定区融合的免疫球蛋白重链ch3恒定区。
114.在本技术中，术语“受试者”通常是指任何生物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在本技术中，受试者可以是人类、宠物或家畜。在本技术中，受试者可以是covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
115.在本技术中，术语“rbd”是指sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域。在本技术中，所述rbd可为sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白(s蛋白)的突变体或截短体。在本技术中，所述截短体通常是指少于整体的任何事物。例如，截短体少于参比序列至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在本技术中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本技术中，截短体或突变体可以天然存在或非天然存在。可以用本领域已知的技术来生成非天然存在的截短体或突变体。
116.在本技术中，术语“sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段”通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。sars
‑
cov
‑
2通过sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白与ace2受体结合并侵入细胞。sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从n端起或从第14位氨基酸起至少到1213氨基酸片段，或者来自其它sas病毒的相应区域。在本技术中，sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白可以是三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。在本技术中，sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白可以是全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
117.在本技术中，术语“ace2受体蛋白或其功能活性片段”通常是指冠状病毒刺突蛋白的功能受体。在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白可以是人ace2受体蛋白。例如，ace2受体蛋白序列可以在uniprot登录号q9byf1中找到。
118.在本技术中，术语“功能活性片段”通常是指保留与其更大对应物相同活性或能力的较大多肽或多核苷酸的片段。功能活性片段的活性水平可以与所述更大对应物的活性相同，或比它更小或更大。例如，sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白的功能活性片段可以是这样的多肽，其由比全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白更少的氨基酸组成，但是仍然可以保留全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白的活性。又例如，人ace2受体蛋白的功能活性片段可以是这样的多肽，其由比全长人ace2受体蛋白更少的氨基酸组成，但是仍可以保留全长人ace2受体蛋白的活性。
119.在本技术中，术语“fc区”或“fc”通常是指免疫球蛋白重链的c末端区，其含有恒定区的至少一部分。fc区包括天然序列fc区和变体fc区。在一些实施方式中，所述fc区可以与sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白直接或间接连接。在一些实施方式中，所述fc区可以与sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白在框内融合。在一些实施方式中，所述fc区可与ace2受体蛋白直接或间接连接。在一些实施方式中，所述fc区可与ace2受体蛋白在框内融合。在本技术中，fc区包括人或非人(例如大鼠、小鼠、兔)的fc区。例如，fc区可以包括兔fc区(rfc)。例如，fc区可包括小鼠的fc区(mfc)。例如，fc区可包括人fc区(hfc)。
120.在本技术中，“框内融合(in
‑
frame fusion)”通常是指以维持原始orf正确阅读框的方式，将两个或多个开放阅读框(orf)连接起来以形成连续的较长orf。因此，所得的“融合多肽”是包含两个或更多个片段的单一蛋白质，所述两个或更多个片段对应于原始orf编码的多肽(该片段通常在自然界中不是这样连接的)。“融合位点”是指两个或更多个片段连接在一起的序列。在某些情况下，融合位点可以是与两个或更多个要连接的片段中的序列相同的序列。在一些情况下，融合位点可以进一步包含与被连接的两个或更多个片段的序列中的任一个都不相同的空位片段。
121.发明详述
122.检测试剂盒
123.一方面，本技术提供一种sars
‑
cov
‑
2中和抗体的检测试剂盒，其可包含：
124.1)sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
125.2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述sars
‑
cov
‑
2中和抗体竞争结合所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
126.在本技术中，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含受体结合区rbd。
127.在本技术中，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
128.在本技术中，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
129.例如，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含seq id no:10所示的氨基酸序列。例如，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
130.在本技术中，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含受体结合区rbd，且所述rbd可与fc区直接或间接连接。
131.在本技术中，所述rbd可与所述fc在框内融合。在本技术中，所述fc可选自下组：rfc、mfc和hfc。
132.在本技术中，所述rbd可与fc区直接或间接连接。在本技术中，所述fc可为rfc。
133.在本技术中，所述rbd可与fc区直接或间接连接。在本技术中，所述fc可为mfc。
134.在本技术中，所述rbd可与fc区直接或间接连接。在本技术中，所述fc可为hfc。
135.例如，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含seq id no:7所示的氨基酸序列。例如，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含seq id no:8所示的氨基酸序列。例如，所述的sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
136.在本技术中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可为50ng/ml
‑
4000ng/ml。例如，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml或4000ng/ml。
137.在本技术中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可固定在固体支持物上。
138.在本技术中，所述固体支持物可以是反应板或酶标板(适应于elisa测定的反应板或酶标板)。
139.在本技术中，所述竞争结合剂可包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
140.在本技术中，所述竞争结合剂可包含已知的rbd中和抗体。
141.在本技术中，所述ace2受体蛋白可包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
142.在本技术中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含胞外域ecd。
143.在本技术中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与fc区直接或间接连接。
144.在本技术中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与所述fc区在框内融合。
145.在本技术中，所述fc区可选自下组：rfc、mfc和hfc。
146.在本技术中，所述fc区可以为rfc。在本技术中，所述fc区可以为mfc。在本技术中，所述fc区可以为hfc。
147.在本技术中，所述竞争结合剂可包含seq id no:1
‑
5中任一项所示的氨基酸序列。
148.例如，所述的竞争结合剂以包含seq id no:2所示的氨基酸序列。例如，所述的竞争结合剂可以包含seq id no:3所示的氨基酸序列。例如，所述的竞争结合剂可以包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
149.在本技术中，所述竞争结合剂可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。例如，所述标记物可包含辣根过氧
化物酶(hrp)或hrp类似的酶。例如，所述标记物可以是辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、葡萄糖氧化酶或β半乳糖苷酶β
‑
galactosidase。在一些实施方案中，所述标记物可以是辣根过氧化物酶(hrp)。
150.在本技术中，所述竞争结合剂可包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶以及选自下组的一种或多种标记物：avi标签、生物素，荧光素和链霉亲和素。
151.例如，所述竞争结合剂可包含hrp、avi标签、链霉亲和素。
152.在本技术中，所述竞争结合剂的浓度可为100ng/ml
‑
2000ng/ml。例如，所述竞争结合剂的浓度可为100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、1800ng/ml、1900ng/ml或2000ng/ml。
153.在本技术中，所述试剂盒可包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph可为6.0
‑
9.6。例如，所述样本稀释液的ph可为6.0、6.1、6.2、6.3、6.5、7.0、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5或9.6。
154.例如，所述样本稀释液的ph可为6.0。
155.在本技术中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
156.在本技术中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
157.在本技术中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
158.另一方面，本技术提供一种sars
‑
cov
‑
2中和抗体的检测试剂盒，其与前述试剂盒的区别在于所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含一种或多种标记物，所述标记物可以直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。例如，所述竞争结合剂可以不含标记物。
159.参比抗体
160.在本技术中，所述参比抗体可包括抗体32
‑
1、12
‑
5和12
‑
8。
161.例如，本技术所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述vh包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl可包含lcdr1、lcdr2和lcdr3。其中，所述hcdr1可包含seq id no:30所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr2可包含seq id no:31所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr3可包含seq id no:32所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr1可包含seq id no:33所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr2可包含seq id no:34所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr3可包含seq id no:35所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32
‑
1或与其具有相同的hcdr1
‑
3及lcdr1
‑
3的抗体。在本技术中，所述vh可包含seq id no:21所示的氨基酸序列或其变体；且所述vl可包含seq id no:22所示的氨基酸序列或其变体。在本技术中，所述编码vh的核酸序列可包含seq id no:12所示的序列；且所述编码vl的核酸序列可包含seq id no:13所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32
‑
1或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，本技术所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链恒定区ch和轻链恒定区cl。在本技术中，所述ch可包含seq id no:29所示的氨基酸序列或其变体；且所述cl可包含seq id no:23所示的氨基酸序列或其变体。在本技术中，所述编码ch的核酸序列
可包含seq id no:20所示的序列；且所述编码cl的核酸序列可包含seq id no:14所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32
‑
1或与其具有相同的重链恒定区及轻链恒定区的抗体。
162.在一些实施方式中，本技术所述的抗体可以为32
‑
1。抗体32
‑
1的hcdr1、hcdr2和hcdr3可分别包含seq id no:30、seq id no:31和seq id no:32所示的氨基酸序列；vh可包含seq id no:21所示的氨基酸序列；lcdr1、lcdr2和lcdr3可分别包含seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35所示的氨基酸序列；vl可包含seq id no:22所示的氨基酸序列。
163.例如，本技术所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述vh可包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl可包含lcdr1、lcdr2和lcdr3。其中，所述hcdr1可包含seq id no:36所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr2可包含seq id no:37所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr3可包含seq id no:38所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr1可包含seq id no:39所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr2可包含seq id no:40所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr3可包含seq id no:41所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包含抗体12
‑
5或与其具有相同的hcdr1
‑
3及lcdr1
‑
3的抗体。在本技术中，所述vh可包含seq id no:24所示的氨基酸序列或其变体；且所述vl可包含seq id no:25所示的氨基酸序列或其变体。在本技术中，所述编码vh的核酸序列可包含seq id no:15所示的序列；且所述编码vl的核酸序列可包含seq id no:16所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12
‑
5或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，本技术所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链恒定区ch和轻链恒定区cl。在本技术中，所述ch可包含seq id no:29所示的氨基酸序列或其变体；且所述cl可包含seq id no:26所示的氨基酸序列或其变体。在本技术中，所述编码ch的核酸序列可包含seq id no:20所示的序列；且所述编码cl的核酸序列可包含seq id no:17所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12
‑
5或与其具有相同的重链恒定区及轻链恒定区的抗体。
164.在一些实施方式中，本技术所述的抗体可以为12
‑
5。抗体12
‑
5的hcdr1、hcdr2和hcdr3可分别包含seq id no:36、seq id no:37和seq id no:38所示的氨基酸序列；vh可包含seq id no:24所示的氨基酸序列；lcdr1、lcdr2和lcdr3可分别包含seq id no:39、seq id no:40和seq id no:41所示的氨基酸序列；vl可包含seq id no:25所示的氨基酸序列。
165.例如，本技术所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述vh包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl可包含lcdr1、lcdr2和lcdr3。其中，所述hcdr1可包含seq id no:42所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr2可包含seq id no:43所示的氨基酸序列或其变体；所述hcdr3可包含seq id no:44所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr1可包含seq id no:45所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr2可包含seq id no:46所示的氨基酸序列或其变体；所述lcdr3可包含seq id no:47所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包含抗体12
‑
8或与其具有相同的hcdr1
‑
3及lcdr1
‑
3的抗体。在本技术中，所述vh可包含seq id no:27所示的氨基酸序列或其变体；且所述vl可包含seq id no:28所示的氨基酸序列或其变体。在本技术中，所述编码vh的核酸序列可包含seq id no:18所示的序列；且所述编码vl的核酸序列可包含seq id no:19所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12
‑
8或与其具有相同的轻链可变区及重链
no:10所示的氨基酸序列。
184.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
185.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可为50ng/ml
‑
4000ng/ml。例如可以是50ng/ml
‑
3500ng/ml、50ng/ml
‑
3000ng/ml、50ng/ml
‑
2000ng/ml、50ng/ml
‑
1500ng/ml、50ng/ml
‑
1000ng/ml、50ng/ml
‑
900ng/ml或50ng/ml
‑
800ng/ml。例如，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml或4000ng/ml。
186.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
187.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含胞外域ecd。
188.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与fc区直接或间接连接。
189.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与所述fc区在框内融合。
190.在一些实施方式中，所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。例如，是rfc。例如，是mfc。例如，是hfc。
191.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
192.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
193.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
194.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
195.在一些实施方式中，所述标记物可包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
196.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的反应浓度可以为100ng/ml
‑
2000ng/ml。例如可以是100ng/ml
‑
1500ng/ml、100ng/ml
‑
1000ng/ml、100ng/ml
‑
800ng/ml、500ng/ml
‑
2000ng/ml、500ng/ml
‑
1500ng/ml、500ng/ml
‑
1000ng/ml或500ng/ml
‑
800ng/ml。例如可以是200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml或2000ng/ml。
197.在一些实施方式中，所述rbd的包被浓度可以为50ng/ml
‑
4000ng/ml。例如可以是50ng/ml
‑
3500ng/ml、50ng/ml
‑
3000ng/ml、50ng/ml
‑
2000ng/ml、50ng/ml
‑
1500ng/ml、50ng/ml
‑
1000ng/ml、50ng/ml
‑
900ng/ml或50ng/ml
‑
800ng/ml。例如可以是50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml或1000ng/ml。
198.在一些实施方式中，当所述rbd的包被浓度可以为50ng/ml
‑
4000ng/ml时，所述
ace2受体蛋白或其功能活性片段的反应浓度可以为500ng/ml
‑
1500ng/ml。
199.在一些实施方式中，其可包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph可为6.0
‑
9.6。
200.在一些实施方式中，其还可以包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
201.在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
202.在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
203.在一些实施方式中，所述参比抗体可以包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
204.在一些实施方式中，所述参比抗体的浓度可为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
205.在另一方面，本技术提供了一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其可包括：
206.1)包被ace2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
207.2)将待测样品与sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后产物；
208.3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
209.4)检测所述待测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体；
210.其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含受体结合区rbd，且所述rbd可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述rbd的存在和/或含量的信号。
211.在一些实施方式中，所述标记物可包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
212.在一些实施方式中，所述rbd可与fc区直接或间接连接。
213.在一些实施方式中，所述rbd可与所述fc在框内融合。
214.在一些实施方式中，所述fc区可选自下组：rfc、mfc和hfc。
215.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
216.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:8所示的氨基酸序列。
217.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
218.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
219.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
220.在一些实施方式中，所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
221.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与fc区直接或间接连接。
222.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可与所述fc区在框内融
合。
223.在一些实施方式中，所述fc区可选自下组：rfc、mfc和hfc。
224.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
225.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
226.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段可包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
227.在一些实施方式中，所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为1μg/ml
‑
20μg/ml。例如可以是1μg/ml
‑
15μg/ml、1μg/ml
‑
10μg/ml、1μg/ml
‑
8μg/ml、1μg/ml
‑
7μg/ml、1μg/ml
‑
6μg/ml或1μg/ml
‑
5μg/ml。例如可以是2μg/ml
‑
10μg/ml、2μg/ml
‑
8μg/ml、2μg/ml
‑
6μg/ml、3μg/ml
‑
10μg/ml、3μg/ml
‑
8μg/ml或3μg/ml
‑
6μg/ml。例如可以是1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、15μg/ml或20μg/ml。
228.在一些实施方式中，所述rbd的反应浓度可以为10ng/ml
‑
200ng/ml。例如可以是10ng/ml
‑
150ng/ml、10ng/ml
‑
100ng/ml、10ng/ml
‑
80ng/ml、10ng/ml
‑
50ng/ml、10ng/ml
‑
40ng/ml、10ng/ml
‑
30ng/ml或10ng/ml
‑
20ng/ml。例如可以是20ng/ml
‑
150ng/ml、20ng/ml
‑
100ng/ml、20ng/ml
‑
80ng/ml、20ng/ml
‑
50ng/ml、20ng/ml
‑
40ng/ml或20ng/ml
‑
30ng/ml。例如可以是10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、400ng/ml、90ng/ml或100ng/ml。
229.在一些实施方式中，当所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为1μg/ml
‑
10μg/ml时，所述rbd的反应浓度可为20ng/ml
‑
150ng/ml。
230.在一些实施方式中，当所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为3μg/ml
‑
6μg/ml时，所述rbd的反应浓度可以为20ng/ml
‑
40ng/ml。
231.在一些实施方式中，其可包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph可为6.0
‑
9.6。
232.在一些实施方式中，其还可以包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
233.在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
234.在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
235.在一些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
236.在一些实施方式中，所述参比抗体的浓度可以为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
237.在本技术中，所述样品可以是天然或合成来源的，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式获得。例如，所述样品可以是从受试者分离的组织或液体样品，包括但不限于尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。例如，所述样品可以是研究样品和临床样品。例如，所述样品也可以是用于输血或治疗的血液样品。例如，所述样品也可以是合成的并且包括但不限于体外细胞培养成分，包括但不限于条件培养基、重组细胞和细胞组分。在本技术中，术语“样品”和“样本”可以互换使用。
238.在本技术中，所述样品源自受试者。在本技术中，所述受试者通常是指任何生物，
包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在本技术中，受试者可以是人类、宠物或家畜。在本技术中，所述受试者可以为covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
239.在一些实施方式中，所述的方法可包括以下步骤：
240.步骤一，包被抗原：用包被液稀释sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段，将sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段稀释液加入到反应板酶标孔中。
241.步骤二，加待测样品，孵育30
‑
60分钟(例如，孵育30分钟、孵育35分钟、孵育40分钟、孵育45分钟、孵育50分钟、孵育55分钟或孵育60分钟)。
242.步骤三，加竞争结合剂，孵育30
‑
60分钟(例如孵育30分钟、孵育35分钟、孵育40分钟、孵育45分钟、孵育50分钟、孵育55分钟或孵育60分钟)。
243.步骤四，显色，终止读数。
244.在一些实施方式中，待测样品可在35℃
‑
40℃环境中孵育(例如，孵育温度可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
245.在一些实施方式中，竞争结合剂可在35℃
‑
40℃环境中孵育(例如，孵育温度可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
246.在一些实施方式中，显色过程可在35℃
‑
40℃环境中进行(例如，可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
247.本发明的一些实施方案：
248.1.一种sars
‑
cov
‑
2中和抗体的检测试剂盒，其包含：
249.1)sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
250.2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述sars
‑
cov
‑
2中和抗体竞争结合所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
251.2.根据实施方案1所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd。
252.3.根据实施方案1
‑
2中任一项所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
253.4.根据实施方案1
‑
3中任一项所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
254.5.根据实施方案2
‑
4中任一项所述的试剂盒，其中所述rbd与fc直接或间接连接。
255.6.根据实施方案5所述的试剂盒，其中所述rbd与所述fc在框内融合。
256.7.根据实施方案5
‑
6中任一项所述的试剂盒，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
257.8.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
258.9.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:8所示的氨基酸序列。
259.10.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
260.11.根据实施方案3所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
261.12.根据实施方案4所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
262.13.根据实施方案1
‑
12中任一项所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
263.14.根据实施方案13所述的试剂盒，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
264.15.根据实施方案13
‑
14中任一项所述的试剂盒，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ecd。
265.16.根据实施方案13
‑
15中任一项所述的试剂盒，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连接。
266.17.根据实施方案16所述的试剂盒，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
267.18.根据实施方案16
‑
17中任一项所述的试剂盒，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
268.19.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
269.20.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
270.21.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
271.22.根据实施方案13所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
272.23.根据实施方案22所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
273.24.根据实施方案1
‑
23中任一项所述的试剂盒，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph为6.0
‑
9.6。
274.25.根据实施方案1
‑
24中任一项所述的试剂盒，其还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
275.26.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
276.27.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
277.28.根据实施方案25
‑
27中任一项所述的试剂盒，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：
278.所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
279.所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
280.所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
281.29.根据实施方案25
‑
28中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：
282.所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；
283.所述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或
284.所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
285.30.根据实施方案25
‑
29中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
286.31.根据实施方案25
‑
30中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
287.32.根据实施方案1
‑
31中任一项所述的试剂盒，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
288.33.根据实施方案32所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
289.34.一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：
290.使用实施方案1或13所述的试剂盒。
291.35.一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：
292.1)包被sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
293.2)将待测样品加入步骤1)中与所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段反应；
294.3)将竞争结合剂加入步骤2)中；
295.4)检测所述待测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体；
296.其中，所述竞争结合剂包含能够与所述sars
‑
cov
‑
2中和抗体竞争结合所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；
297.所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd；所述竞争结合剂包含ace2受体蛋白或其功能活性片段。
298.36.根据实施方案35所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
299.37.根据实施方案35
‑
36中任一项所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其
功能活性片段包含三聚体全长sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白。
300.38.根据实施方案35
‑
37中任一项所述的方法，其中所述rbd与fc区直接或间接连接。
301.39.根据实施方案38所述的方法，其中所述rbd与所述fc在框内融合。
302.40.根据实施方案38
‑
39中任一项所述的方法，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
303.41.根据实施方案40所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
304.42.根据实施方案40所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:8所示的氨基酸序列。
305.43.根据实施方案40所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
306.44.根据实施方案36所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
307.45.根据实施方案37所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
308.46.根据实施方案35
‑
45中任一项所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
309.47.根据实施方案35
‑
46任一项所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含人ace2受体蛋白或其功能活性片段。
310.48.根据实施方案47所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ecd。
311.49.根据实施方案47
‑
48中任一项所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连接。
312.50.根据实施方案49所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
313.51.根据实施方案49
‑
50中任一项所述的方法，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
314.52.根据实施方案51所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
315.53.根据实施方案51所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
316.54.根据实施方案51所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
317.55.根据实施方案35
‑
54中任一项所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
318.56.根据实施方案55所述的方法，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
319.57.根据实施方案35
‑
56中任一项所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml
‑
2000ng/ml。
320.58.根据实施方案35
‑
57中任一项所述的方法，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph为6.0
‑
9.6。
321.59.根据实施方案35
‑
58中任一项所述的方法，其还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
322.60.根据实施方案59所述的方法，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
323.61.根据实施方案59所述的方法，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
324.62.根据实施方案59
‑
61中任一项所述的方法，所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：
325.所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
326.所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
327.所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
328.63.根据实施方案59
‑
62任一项所述的方法，其中所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：
329.所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；
330.所述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或
331.所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
332.64.根据实施方案59
‑
63中任一项所述的方法，其中所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
333.65.根据实施方案59
‑
64中任一项所述的方法，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
334.66.根据实施方案35所述的方法，其中所述样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
335.67.根据实施方案66所述的方法，其中所述样品源自受试者。
336.68.根据实施方案67所述的方法，其中所述受试者为covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
337.69.一种用于检测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体的方法，其包括：
338.1)包被ace2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
339.2)将待测样品与sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后
产物；
340.3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
341.4)检测所述待测样品中sars
‑
cov
‑
2中和抗体；
342.其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区rbd，且所述rbd包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述rbd的存在和/或含量的信号。
343.70.根据实施方案69所述的方法，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(hrp)或hrp类似的酶。
344.71.根据实施方案69
‑
70中任一项所述的方法，其中所述rbd与fc区直接或间接连接。
345.72.根据实施方案71所述的方法，其中所述rbd与所述fc在框内融合。
346.73.根据实施方案71
‑
72中任一项所述的方法，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
347.74.根据实施方案73所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
348.75.根据实施方案73所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:8所示的氨基酸序列。
349.76.根据实施方案73所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:9所示的氨基酸序列。
350.77.根据实施方案69所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
351.78.根据实施方案69所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段包含seq id no:11所示的氨基酸序列。
352.79.根据实施方案69
‑
78中任一项所述的方法，其中所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml
‑
4000ng/ml。
353.80.根据实施方案69
‑
79所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与fc区直接或间接连接。
354.81.根据实施方案80所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段与所述fc区在框内融合。
355.82.根据实施方案80
‑
81中任一项所述的方法，其中所述fc区选自下组：rfc、mfc和hfc。
356.83.根据实施方案82所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:2所示的氨基酸序列。
357.84.根据实施方案82所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:3所示的氨基酸序列。
358.85.根据实施方案82所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
359.86.根据实施方案69
‑
85中任一项所述的方法，其中所述ace2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml
‑
2000ng/ml。
360.87.根据实施方案69
‑
86中任一项所述的方法，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的ph为6.0
‑
9.6。
361.88.根据实施方案69
‑
87中任一项所述的方法，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl，其中：
362.所述vh包含seq id no:30
‑
32所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:33
‑
35所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
363.所述vh包含seq id no:36
‑
38所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:39
‑
41所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
364.所述vh包含seq id no:42
‑
44所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含seq id no:45
‑
47所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
365.89.根据实施方案88所述的方法，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl；其中：
366.所述vh包含seq id no:21所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:22所示的氨基酸序列；
367.所述vh包含seq id no:24所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:25所示的氨基酸序列；或
368.所述vh包含seq id no:27所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
369.90.根据实施方案88
‑
89中任一项所述的方法，其中所述参比抗体包括抗体32
‑
1,12
‑
5和12
‑
8。
370.91.根据实施方案88
‑
90中任一项所述的方法，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml
‑
1000ng/ml。
371.92.根据实施方案69所述的方法，其中所述待测样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
372.93.根据实施方案92所述的方法，其中所述待测样品源自受试者。
373.94.根据实施方案93所述的方法，其中所述受试者为covid
‑
19康复患者、健康受试者和/或接受过covid
‑
19疫苗治疗的受试者。
374.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。
375.实施例
376.实施例1 sars
‑
cov
‑
2中和抗体的elisa测试方法
377.1.1辣根过氧化物酶(hrp)的活化：将辣根过氧化物酶(hrp)粉末溶解于ddh2o中配制成10mg/ml辣根过氧化物酶(hrp)溶液，高碘酸钠粉末溶解于ddh2o中配制成0.1m高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶(hrp)溶液与高碘酸钠溶液按体积比1：0.51混匀，2
‑
8℃避光1小时；加入0.26倍辣根过氧化物酶(hrp)溶液体积的乙二醇，2
‑
8℃避光20分钟；50ml超滤管6000
‑
7500rpm离心10
‑
20分钟；1mm醋酸缓冲液，离心3
‑
5次；
‑
80℃保存。
378.1.2辣根过氧化物酶(hrp)标记人ace2受体蛋白：按质量比1：4加入人ace2受体蛋
白和活化好的辣根过氧化物酶(hrp)，加入人ace2受体蛋白与辣根过氧化物酶(hrp)体积总量1/5的碳酸钠缓冲液(ph9.6)，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(hrp)体积的还原剂，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(hrp)体积的终止剂，室温避光放置30分钟，即可使用或4℃保存。
379.1.3包被抗原：使用1x包被液(10x包被液为15.9g/l na2co3 29.3g/l nahco3，用ddh2o稀释至1x使用)将rbd抗原稀释至0.3μg/ml并充分混匀，将rbd抗原稀释液加到反应板酶标孔中，每孔100μl，将反应板加盖放于4℃过夜包被，上层为液体，包被后的rbd抗原吸附在反应板上。
380.1.4封闭：用1x洗涤液(20x洗涤液为2.4g/l kh2po4 29g/l nahpo4·
12h2o 160g/l nacl 4g/l kcl 10ml/l tween
‑
20 2.24g/l p300，用ddh2o稀释至1x使用)每孔350μl冲洗反应板一次以洗去包被液，在吸水纸上将反应板中洗涤液拍干，每孔迅速加入100～200μl封闭液(104.5g/l 10x pbs 10g/l casein 50g/l蔗糖 2.24g/l p300)，置于37℃培养箱，孵育2h；倒去封闭液，甩板机甩干或在吸水纸上拍干封闭液，即可使用反应板，如不立即使用，反应板应放于密封袋中并加入干燥包置于2～8℃保存，干燥包需位于反应板板底，不能接触反应板孔。
381.1.5加待测样品：将所有组分包括待测血清提前拿出平衡至室温，反应板平衡至室温后从密封袋中拿出，每孔加入80μl样本稀释液(0.02m pbs 0.9％nacl 0.5％bsa 0.1％tween
‑
20 0.2％p300，ph7.4)，然后加入20μl校准品(校准品为不同浓度的抗体，浓度分别为1000ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml和50ng/ml，详见实施例6)、20μl待测血清至相应已加入样本稀释液的孔中，贴好板贴，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5小时。
382.1.6加酶标结合物：使用样本稀释液按1：3000稀释ace2
‑
hrp(初始浓度为5mg/ml)，小心揭下板贴，每孔加入100μl稀释好的ace2
‑
hrp，更换板贴并贴好，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5小时。
383.1.7洗板：小心揭下板贴，用1x洗涤液冲洗反应板六次(推荐使用洗板机，每孔加液量350μl)，最后在吸水纸上拍干或甩板机甩干。
384.1.8显色：将显色a液(2.1g/l一水合柠檬酸 8.448g/l醋酸钠 0.5g/l过氧化脲 0.08g/l edta 2ml/l p300)和b液(10ml/l 100x基础buffer(105.6g/l一水合柠檬酸 10.3g/l醋酸钠 2ml/l p300) 100ml/l甘油 0.5g/l tmb盐酸盐 1.67ml/l na2s2o3(20mg/ml) 2ml/l p300)按体积比1:1混匀成显色工作液，每孔加入显色工作液100μl，更换板贴并贴好，置于37℃避光反应10分钟。
385.1.9读数：
386.小心揭下板贴，每孔加入终止液(252.5g/l一水合柠檬酸 26.6ml/l浓硫酸)50μl终止反应，用酶标仪450nm单波长检测，测定各孔的吸光值。
387.1.10.临界值确定：利用上述方法检测待测血清，当样品抑制率>15％时判定样品为阳性，当样品抑制率<15％时判定样品为阴性，抑制率＝(1
‑
待测样品吸光值/阴性对照吸光值)x 100％，抑制率反映了待测血清中抗体的中和效率。
388.实施例2 sars
‑
cov
‑
2中和抗体的elisa测试方法
389.本实施例中未特别说明的步骤及其对应试剂，与实施例1相同。
390.1.1辣根过氧化物酶(hrp)的活化：将辣根过氧化物酶(hrp)粉末溶解于ddh2o中配制成10mg/ml辣根过氧化物酶(hrp)溶液，高碘酸钠粉末溶解于ddh2o中配制成0.1m高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶(hrp)溶液与高碘酸钠溶液按体积比1：0.51混匀，2
‑
8度避光1小时；加入0.26倍辣根过氧化物酶(hrp)溶液体积的乙二醇，2
‑
8℃避光20分钟；50ml超滤管6000
‑
7500rpm离心10
‑
20分钟；1mm醋酸缓冲液，离心3
‑
5次；
‑
80℃保存。
391.1.2辣根过氧化物酶(hrp)标记rbd蛋白：按质量比1：4加入rbd蛋白和活化好的辣根过氧化物酶(hrp)，加入rbd蛋白与辣根过氧化物酶(hrp)体积总量1/5的碳酸钠缓冲液(ph9.6)，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(hrp)体积的还原剂，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(hrp)体积的终止剂，室温避光放置30分钟，即可使用或4℃保存。
392.1.3包被蛋白：使用1x包被液将ace2蛋白稀释至0.3μg/ml并充分混匀，将ace2蛋白稀释液加到反应板酶标孔中，每孔100μl，将反应板加盖放于4℃过夜包被，上层为液体，包被后的ace2蛋白吸附在反应板上。
393.1.4封闭：用1x洗涤液每孔350μl冲洗反应板一次以洗去包被液，在吸水纸上将反应板中洗涤液拍干，每孔迅速加入100～200μl封闭液，置于37℃培养箱，孵育2h；倒去封闭液，甩板机甩干或在吸水纸上拍干封闭液，即可使用反应板，如不立即使用，反应板应放于密封袋中并加入干燥包置于2～8℃保存，干燥包需位于反应板板底，不能接触反应板孔。
394.1.5加待测样品：将所有组分包括样品提前拿出平衡至室温，反应板平衡至室温后从密封袋中拿出，样品用样本稀释液两倍梯度稀释后，每孔分别加入10μl阳性对照、阴性对照以及一系列不同稀释倍数的样品，并加入90μl样本稀释液。
395.1.6加酶标结合物：使用样本稀释液将rbd
‑
hrp稀释至所需浓度(初始浓度为5mg/ml)，每孔加入100μl稀释好的rbd
‑
hrp，贴好板贴，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5h。
396.1.7转移：小心揭开板贴，将100μl样本/对照反应液由96孔pcr板中转移至反应板对应的孔中，贴好板贴，置于37℃培养箱，孵育0.5h。
397.1.8洗板：小心揭下板贴，用1x洗涤液冲洗反应板六次(推荐使用洗板机，每孔加液量350μl)，最后在吸水纸上拍干或甩板机甩干。
398.1.9显色：将显色a液和b液按体积比1:1混匀成显色工作液，每孔加入显色工作液100μl，更换板贴并贴好，置于37℃避光反应10分钟。
399.1.10读数：小心揭下板贴，每孔加入终止液50μl终止反应，用酶标仪450nm单波长检测，测定各孔的吸光值。
400.1.11滴度值确定：利用上述方法检测样品，当在某稀释倍数下此样品的抑制率>15％，在该稀释倍数的下一稀释梯度下该样品抑制率<15％时，则该稀释度为此样品的滴度。滴度为仍能产生阳性结果的最大稀释度，反应了抗体的效价。
401.实施例3不同ph样本稀释液对检测结果的影响
402.通过改变样本稀释液的ph减少血清样本的非特异性结合。如表1所示，分别使用ph6.0、ph7.8、ph9.6样本稀释液，按照实施例1的检测步骤，使用rbd
‑
mfc包被板和辣根过氧化物酶(hrp)标记ace2
‑
mfc，检测非sars
‑
cov
‑
2感染人血清样本即阴性血清，比较不同ph的样品稀释液稀释的阳性血清的抑制率以及阴性血清的抑制率。结果表明，ph6.0的通用样本
稀释液既可以降低阴性血清中非特异性结合对反应的影响，又不会影响阳性样本的检出。
403.表1不同ph样本稀释液对检测结果的影响
[0404][0405]
实施例4 rbd和ace2不同分子形式对检测结果的影响
[0406]
按照建立好的elisa检测方法(操作步骤同实施例1或实施例2)，在ace2
‑
mfc包板上加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的rbd
‑
his和rbd
‑
mfc，在rbd
‑
his包板上加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的ace2
‑
his、ace2
‑
hfc、ace2
‑
mfc和ace2
‑
rfc。每个样品两个重复，分别检测0μg/ml rbd中和抗体和1μg/ml rbd中和抗体。结果如表2所示，选用带有fc标签的rbd和ace2，信噪比、稳定性相较于his标签的rbd和ace2都有显著提高。
[0407]
表2带不同标签的rbd和ace2对检测结果的影响
[0408][0409][0410]
实施例5 rbd和ace2用量对检测结果的影响
[0411]
5.1使用五种不同rbd
‑
mfc浓度的反应板，采用1：2000和1：4000两种稀释比例稀释ace2
‑
mfc
‑
hrp，按照实施例1的操作步骤，检测25例covid
‑
19疫苗血清即阳性血清和25例阴性血清，比较不同rbd
‑
mfc包被浓度和ace2
‑
mfc
‑
hrp稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
[0412]
5.2使用五种不同全长s蛋白浓度的反应板，操作步骤同5.1，比较不同全长s蛋白包被浓度和ace2
‑
mfc
‑
hrp稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
[0413]
5.3使用五种不同三聚体s蛋白浓度的反应板，操作步骤同5.1，比较不同三聚体s蛋白包被浓度和ace2
‑
mfc
‑
hrp稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
[0414]
结果表明，通过优化rbd
‑
mfc或者全长s蛋白或者三聚体s蛋白的包板浓度，能够显著提高检测灵敏度，如表3
‑
5所示。
[0415]
表3 rbd
‑
mfc和ace2
‑
mfc
‑
hrp用量优化结果
[0416][0417]
表4全长s蛋白和ace2
‑
mfc
‑
hrp用量优化结果
[0418][0419]
表5三聚体s蛋白和ace2
‑
mfc
‑
hrp用量优化结果
[0420][0421]
ace2
‑
mfc包被量及rbd
‑
mfc
‑
hrp用量优化
[0422]
使用三种不同ace2
‑
mfc浓度的反应板，采用500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml和30ng/ml五种稀释比例稀释rbd
‑
mfc
‑
hrp，按照实施例2的操作步骤，检测梯度稀释浓度抗体，比较不同ace2
‑
mfc包被浓度和rbd
‑
mfc
‑
hrp稀释比例下的检测线差异。
[0423]
结果表明，通过优化ace2
‑
mfc的包板浓度及rbd
‑
mfc
‑
hrp使用浓度，能够显著提高检测灵敏度，结果如表6所示。
[0424]
表6 ace2
‑
mfc包被量及rbd
‑
hrp用量优化
[0425][0426]
实施例6校准品的选择
[0427]
通过单b细胞筛选出多株天然人源中和抗体，通过真病毒验证具有良好的中和效果，能很好地模拟人体内中和抗体的天然形式。从中筛选出3株不同表位的抗体进行混合制备标准品，配制六种抗体浓度的校准品，c.1～c.6抗体浓度分别为1000ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml和50ng/ml。按照实施例1的操作步骤，检测这六种抗体浓度的标准品在450nm处的吸光值。使用graphpad 6.02版本软件，依据校准品的抗体浓度和吸光值作图。根据结果推测其反应性(反应斜率)更接近真实样本，更能真实的模拟出中和抗体在人体内的含量变化趋势，如图1所示。
[0428]
实施例7 cutoff值的确定
[0429]
cut
‑
off值是被检样本的量值，用于确定结果高于还是低于临床或分析决断点。cut
‑
off值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合。cutoff值的确定是根据27例康复患者血清、1452例非新冠感染人血清样本、72例疫苗血清(三分之一安慰剂)的评测结果，用spss软件分析得出，基于这个cutoff值，按照实施例1的操作步骤，我们的试剂盒灵敏度>90％、特异性>99％。疫苗效果评价跟真病毒实验结果一致性95％。敏感度：即灵敏度，表示阳性样本的检出率。如0.977表示99.7％的阳性样本可以正确判断为阳性结果。特异性：表示阴性样本的检出率。如0.991表示99.1％阴性样本可以正确判断为阴性结果，检测变量结果如表7所示，接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve，或者叫roc曲线)如图2所示，曲线坐标和检测结果如表8所示。
[0430]
表7检测变量结果
[0431][0432]
表8曲线坐标和检验变量结果表
[0433]
[0434]