鸡白痢沙门菌脂多糖的提取及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及鸡白痢沙门菌脂多糖的提取及其应用。


背景技术：

2.鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种鸡的常见细菌性传染病，主要引起鸡的败血症和雏鸡白痢。雏鸡感染呈急性败血症，发病率和死亡率都较高；成年鸡感染多表现为慢性或隐性感染，死亡率不高，但成为带菌者，导致产量率下降，孵化率降低，可对养禽业造成严重的经济损失。随着家禽产业的飞速发展，沙门菌病已经成为最重要的蛋媒细菌病之一，北美和欧盟的诸多国家都开展了禽群沙门菌病的净化工作，且成功控制了鸡白痢和禽伤寒沙门菌感染。美国1935年起实施国家家禽改良计划，到1967年即基本根除了种禽鸡白痢，1978年至今种禽和商品禽群中几乎未检出鸡白痢沙门菌，到1985年有30个州扑灭了鸡和火鸡的白痢和伤寒。世界动物卫生组织wahis系统显示，截止2015年，鸡白痢仍在中国、韩国、印度、巴西、阿根廷、英国、美国等亚洲、非洲、南美洲、欧洲、北美洲的19个国家中存在和流行，禽伤寒仍在亚洲、非洲、南美洲、东欧的28个发展中国家中存在和流行。
3.鸡白痢沙门菌目前尚无获得批准的有效疫苗可用于预防，禽场普遍采用药物控制该病，但常年大量使用抗菌药物造成多重耐药现象明显，无法获得满意的疗效。而经卵垂直传播又是沙门菌在禽群中的重要传播方式，因此对种鸡群实施沙门菌感染净化是当前最为有效的防控方法，《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》要求到2020年全国所有种鸡场沙门菌病达到净化标准。监测种鸡场的沙门菌感染情况是净化工作的基础，需要敏感性、特异性好的检测方法鉴定沙门菌阳性种鸡，进而采取淘汰措施。目前国内使用的检测方法是oie《陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐的鸡白痢沙门菌抗体检测方法:平板凝集试验，但该方法敏感性、特异性有限，容易出现假阴性、假阳性结果，且国产检测试剂批次间差异较大，导致在实际应用中严重影响淘汰阳性鸡的鉴定和净化效果的评估。因此国内迫切需要一种敏感性、特异性较好的鸡白痢沙门菌抗体检测方法。
4.根据沙门菌o抗原谱的不同，沙门菌被分为多个血清群，鸡白痢沙门菌o抗原的抗原式为o1、o9和o12，属于d血清群，d群沙门菌中还有临床上常见的另一种沙门菌-肠炎沙门菌。o抗原为菌体细胞壁的耐热多糖抗原，其主要成分是含有脂质a、o－多糖侧链和核心寡糖的脂多糖(lps)，具有种、型、特异性，相较于全菌抗原来说，抗原种类单一，抗原纯净度高。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供鸡白痢沙门菌脂多糖的用途。
6.本发明提供鸡白痢沙门菌脂多糖在如下1)-7)中至少一种中的应用：
7.1)制备检测鸡白痢沙门菌产品；
8.2)制备检测鸡白痢沙门菌抗体产品；
9.3)制备检测待测样品中是否感染或含有鸡白痢沙门菌的产品；
10.4)制备检测待测样品中是否感染或含有鸡白痢沙门菌抗体的产品；
11.5)检测鸡白痢沙门菌；
12.6)检测鸡白痢沙门菌抗体；
13.7)作为检测鸡白痢沙门菌或其抗体的抗原中的应用。
14.上述应用中，所述鸡白痢沙门菌脂多糖中蛋白含量大于等于200μg/ml。
15.上述应用中，所述鸡白痢沙门菌脂多糖中多糖含量大于等于500μg/ml。
16.上述应用中，所述鸡白痢沙门菌脂多糖源自鸡白痢沙门菌标准株和鸡白痢沙门菌变异株。
17.上述应用中，所述鸡白痢沙门菌标准株为cvcc526；所述鸡白痢沙门菌变异株为cvcc530。
18.上述应用中，所述鸡白痢沙门菌脂多糖按照如下方法制备：用热酚水法提取鸡白痢沙门菌标准株和鸡白痢沙门菌变异株混合后菌体，得到脂多糖；
19.具体步骤如下：
20.1)培养鸡白痢沙门菌标准株cvcc526和鸡白痢沙门菌变异株cvcc530，混合两种菌培养液后，收集菌体；
21.2)将所述菌体用苯酚抽提，收集酚相；
22.3)再用含有饱和醋酸钠的甲醇溶液沉淀酚相，收集沉淀，得到脂多糖粗提液；
23.4)再将所述脂多糖粗提液依次用三氯乙酸沉淀蛋白杂质、超速离心去除蛋白质、透析袋透析，得到脂多糖。
24.上述应用中，所述产品为间接elisa检测试剂盒、化学发光法检测试剂盒或荧光微球定量层析检测试剂盒。
25.本发明另一个目的是提供如下试剂盒：
26.本发明提供了一种检测鸡白痢沙门菌或其抗体的间接elisa检测试剂盒，其抗原为上述鸡白痢沙门菌脂多糖。
27.本发明还提供了一种检测鸡白痢沙门菌或其抗体的化学发光法检测试剂盒，其抗原为上述鸡白痢沙门菌脂多糖。
28.本发明还提供了一种检测鸡白痢沙门菌或其抗体的荧光微球定量层析检测试剂盒，其检测线由上述鸡白痢沙门菌脂多糖形成。
29.本发明还有一个目的是提供一种制备脂多糖的方法。
30.本发明提供的方法，用热酚水法提取鸡白痢沙门菌标准株和鸡白痢沙门菌变异株混合后菌体，得到脂多糖。
31.所述用热酚水法提取鸡白痢沙门菌标准株cvcc526和鸡白痢沙门菌变异株cvcc530混合后菌体，得到脂多糖的方法包括如下步骤：
32.具体步骤如下：
33.1)培养鸡白痢沙门菌标准株cvcc526和鸡白痢沙门菌变异株cvcc530，混合两种菌培养液后，收集菌体；
34.2)将所述菌体用苯酚抽提，收集酚相；
35.3)再用含有饱和醋酸钠的甲醇溶液沉淀酚相，收集沉淀，得到脂多糖粗提液；
36.4)再将所述脂多糖粗提液依次用三氯乙酸沉淀蛋白杂质、超速离心去除蛋白质、
透析袋透析，得到脂多糖。
37.上述4)具体为：向3)得到的粗提液中加入终浓度为5％(体积百分含量)的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min，弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析(透析袋截留分子量为3500道尔顿)过夜，换液2次(每一次至少4000ml)，收集透析袋内容物，此即纯化的lps(热酚水法)。
38.本发明提取了鸡白痢沙门菌脂多糖，以鸡白痢沙门菌脂多糖作为抗原检测抗体会提高体系的敏感性和特异性，将假阳性、假阴性的检测情况大大降低。国内外开展了检测沙门菌抗体elisa方法的研制工作，但主要针对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌。本发明首次采用世界动物卫生组织《陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐的热酚水法提取了鸡白痢沙门菌脂多糖作为抗原，建立并优化了鸡白痢沙门菌抗体的间接elisa方法、荧光微球定量层析法、化学发光法，可为临床检测鸡白痢沙门菌感染鸡和种鸡群净化工作奠定基础。
附图说明
39.图1为鸡白痢沙门菌脂多糖染图。
具体实施方式
40.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
41.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.下述实施例中所用的部分菌株如下：鸡白痢沙门菌标准株cvcc526和变异株cvcc530均购自中国兽医药品监察所，spf鸡阴性血清购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，鸡大肠杆菌o78阳性血清，新城疫阳性血清(nd)，禽流感h5阳性血清(aiv h5)，禽流感h7阳性血清(aiv h7)，禽流感h9阳性血清(aiv h9)，禽脑脊髓炎(aev)阳性血清，禽腺病毒3型阳性血清，传染性支气管炎阳性血(ibv)，鸡传染性贫血病毒阳性血清和禽白血病j亚群阳性血清均购自荷兰gd公司，588份临床血清来自全国各省种鸡场。
43.鸡白痢沙门菌感染阳性血清由本实验室制备保存，具体方法如下：将活化的鸡白痢沙门菌标准株cvcc526菌液(浓度为4
×
109cfu/ml)和变异株cvcc530菌液(浓度为4
×
109cfu/ml)体积比1:1混匀后稀释至感染接种所需浓度(每个菌的终浓度2
×
109cfu/ml)，4℃保存备用；接种确定无沙门氏菌抗体的21日龄spf鸡，5只肌注，5只口服。接种后每日观察鸡精神及发育状态，采食饮水情况及有无腹泻等不良反应，并在接种后5、8、12、15、19、26、33、40、48、55、61、89和103天翅静脉采集全血，分离血清，4℃保存备用。
44.下述实施例中所用的部分试剂如下：荷兰biochek d群沙门菌(group d)抗体检测试剂盒购自北京天之泰生物有限公司。苯酚，三氯乙酸，甲醇，硝酸银，冰醋酸，甲醛，乙醇，碳酸钠均来自国产分析纯。明胶，吐温20，牛血清白蛋白(bsa)，tmb双组分显色液，新生犊牛血清，透析袋等购自索莱宝公司。辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗鸡igg抗体(a9046-1ml)购自sigma。高吸附elisa平底酶标板购自thermo公司。
45.下述实施例中所用的部分仪器设备如下：epoch biotek酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，电热恒温水浴锅(blue pard)购自上海蓝豹试验设备有限公司,台式高速冷冻离心机(legend micro 21r)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,超高速离心机(l-100xp)购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司,电泳仪(powerp ac tm basic)购自伯乐生命医学
产品(中国)有限公司。
46.下述实施例中所用的主要溶液的配制：
47.主要试剂有包被液、封闭液、洗涤液、血清抗体稀释液、酶标二抗稀释液，底物缓冲液、底物使用液、终止液等,按参考文献进行配制。
48.pbs(ph 7.4)溶液的配制：称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g，去离子水溶解，定容至1l，调至ph7.4，高压灭菌。
49.pbst溶液的配制：在1l的pbs中加入500μl吐温-20。
50.包被液(0.05mol/l碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph9.6)：na2co3 1.5g，nahco3 2.93g，加入双蒸水定容至1l，调至ph9.6，高压灭菌后保存于4℃。
51.含有3％明胶的pbst作为封闭液：称取3g明胶加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
52.血清抗体稀释液：(0.5％蔗糖的pbs)称取0.5g蔗糖，加入100mlpbs中。
53.实施例1、鸡白痢沙门菌脂多糖的提取及检测
54.一、热酚水法提取鸡白痢沙门菌脂多糖
55.具体如下：
56.1)菌悬液获得
57.将-20℃冻存的鸡白痢沙门菌标准株cvcc526和变异株cvcc530室温活化，然后在沙门氏菌显色培养基(购自上海欣中生物工程有限公司，法国科玛嘉公司生产，产品货号sa130)上划线，放置37度温箱孵育，直至出现紫色菌落。挑取紫色菌落，放入3ml bhi培养基(购自北京莱伯沃德科技有限公司，产品货号cm917b-05)中，放入摇床进行培养过夜。将3ml新鲜的鸡白痢沙门菌标准株cvcc526菌液和鸡白痢沙门菌变异株cvcc530菌液分别放入300mlbhi培养基中(每种菌株菌液和培养基的体积比均为1：100)，过夜培养，得到cvcc526菌悬液和cvcc530菌悬液，菌悬液含菌量分别为4
×
109cfu/ml菌液。
58.2)破碎
59.将上述cvcc526菌悬液和cvcc530菌悬液灭菌按照体积比1:1混合(混合后每个菌的终浓度为2
×
109cfu/ml)；以10000g离心20min，收集沉淀，即为菌体。
60.称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3质量比(菌体湿重：水质量)加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热至66℃；然后加入等体积66℃预热的90％(体积百分含量)苯酚水溶液，在此温度下(66℃)持续搅拌15min，置室温自然冷却后，置4℃以10000g离心15min；用一长管吸取下层棕红色的酚相，用whatman 1号滤纸过滤去除大菌体碎片；用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积2～8℃预冷的甲醇溶液(含质量百分含量1％饱和醋酸钠的冷甲醇：溶质为质量百分比是1％的饱和醋酸钠，溶剂为甲醇)沉淀脂多糖，4℃孵育2h，置4℃以10000g离心10min，弃上清，将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，放在有瓷转子的烧杯中，搅拌18小时，搅拌结束后，4℃以10000g离心10min。收集上清溶液于4℃保存。将沉淀再用等体积灭菌蒸馏水重悬，4℃再搅拌2h，依上法离心获上清液，并与前述上清液混合，得到上清液(脂多糖粗提液)。
61.3)纯化
62.随后，在上述2)得到的上清液中加入终浓度为5％(体积百分含量)的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min，弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析(透析袋截留分子量为3500道尔顿)过夜，换液2次(每一次至少4000ml)，收集透析袋内容物，此即纯化的lps(热酚
水法)。
63.将该lps冻干后称重，重80mg。
64.二、商品化脂多糖提取试剂盒提取鸡白痢沙门菌脂多糖
65.将上述一的1)的cvcc526菌悬液(4
×
109cfu/ml)和cvcc530菌悬液(4
×
109cfu/ml)灭菌按照体积比1:1混合(混合后每个菌的终浓度为2
×
109cfu/ml)后，用商品化脂多糖提取试剂盒按照说明书提取，得到鸡白痢沙门菌lps。
66.上述商品化脂多糖提取试剂盒为脂多糖提取试剂盒购自北京贝洛生物科技有限公司，产品货号bb-31302-50t。
67.三、检测
68.1、脂多糖sds-page和银染鉴定
69.sds-page:浓缩胶为5％，分离胶为12％，采用10μg上样量(上述一得到的纯化的lps或上述二得到的鸡白痢沙门菌lps)，40ma电泳至溴酚蓝迁移至分离胶低端。
70.银染方法参考文献，用30％乙醇、10％冰醋酸和7g/l高碘酸22℃固定氧化凝胶20min，用ddh2o清洗凝胶5min，重复3次；30℃下用1g/l硝酸银染色30min，用ddh2o清洗凝胶10s；用30g/l碳酸钠和0.02％甲醛显色20min；用10％冰醋酸终止显色反应，用ddh2o清洗凝胶拍照。
71.结果如图1所示,m.10-180kd marker、1.1000μg/ml商品化肠炎沙门菌脂多糖(sigma)、2.1000μg/ml商品化鼠伤寒沙门菌脂多糖(sigma)、3.1000μg/ml上述一得到的纯化的lps、4.100μg/ml上述一得到的纯化的lps；可以看出，上述一得到的鸡白痢沙门菌脂多糖sds-page电泳呈典型的阶梯状条带在10kd-30kd之间都有分布，其中在10kd-15kd有大量集中分布，15kd-20kd有部分分布。
72.2、脂多糖浓度的测定
73.采用蒽酮-硫酸法测定待测样品脂多糖浓度(具体方法参考文献：张艳红,杜元钊,吴延功,等.肠炎沙门氏菌脂多糖的提取与制备[j].动物医学进展,2001(03):79-80.)。以葡萄糖(购自北京索莱宝科技有限公司，产品货号id0200-50mg)为标准品绘制标准曲线。
[0074]
上述待测样品为上述一得到的纯化的lps(热酚水法)和上述二得到的鸡白痢沙门菌lps(试剂盒)。
[0075]
采用蒽酮一硫酸法以葡萄糖为标准品制作标准曲线:y＝0.0107x 0.0703(r2＝0.9937)，x为葡萄糖含量(μg/ml)，y为a值(od)，将各种lps的od492nm平均值带入方程，计算结果如下：
[0076]
上述一得到的纯化的lps(热酚水法)多糖浓度为834μg/ml；上述二得到的鸡白痢沙门菌lps(试剂盒)中多糖浓度为155μg/ml。
[0077]
3、脂多糖蛋白含量的测定
[0078]
采用bca法测定待测样品中蛋白含量(bca蛋白浓度检测试剂盒(碧云天)购自武汉博科明生物技术有限公司，产品货号p0012s)，以牛血清白蛋白(牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司，产品货号a8020-500g)为标准品绘制浓度标准曲线。
[0079]
待测样品为上述一得到的纯化的lps(热酚水法)和上述二得到的鸡白痢沙门菌lps(试剂盒)。
[0080]
采用bca法测定，以bsa为标准品绘制浓度标准曲线：y＝0.0002x 0.1014，r2＝
0.9946，x为a值(od)，y为蛋白含量(μg/ml)，计算得出结果如下：
[0081]
上述一得到的纯化的lps(热酚水法)中蛋白含量为328μg/ml；上述二得到的鸡白痢沙门菌lps(试剂盒)中蛋白含量为30μg/ml。
[0082]
上述结果表明，
[0083]
本发明热酚水法提取出的鸡白痢沙门菌脂多糖(上述一得到的纯化的lps(热酚法))的多糖浓度为834μg/ml，蛋白浓度为328μg/ml；现有试剂盒提取的鸡白痢沙门菌lps(试剂盒)的多糖浓度为155μg/ml，蛋白含量为30μg/ml。从上述可以看出，本发明热酚法提取出的鸡白痢沙门菌脂多糖，多糖和蛋白含量均较高，其更适于作为抗原。
[0084]
实施例2、鸡白痢沙门菌脂多糖在作为抗原用于间接elisa方法检测鸡白痢沙门菌
[0085]
一、间接elisa方法检测鸡白痢沙门菌
[0086]
使用50μg/ml实施例1中一得到的鸡白痢沙门菌脂多糖与二得到的鸡白痢沙门菌脂多糖分别作为抗原分别与鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡血清进行间接elisa反应，具体如下：
[0087]
将不同方法获得的鸡白痢沙门菌脂多糖用抗原稀释液(0.05mol/l碳酸氢钠缓冲液，ph9.6)分别稀释为10μg/ml，每孔100μl，4℃放置16h。弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入3％明胶pbst，4℃封闭12h。将2份鸡白痢沙门菌感染阳性血清和1份spf鸡阴性血清分别按照1:50稀释。每孔加入100μl，37℃反应60min，弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入100μl 1:10000稀释的hrp标记兔抗鸡igg抗体(稀释液为pbst)，37℃反应30min，弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入底物显色液(tmb双组分显色液)100μl，37℃避光显色15min，每孔加入50μl终止液(2mol/l h2so4水溶液)，用酶联读数仪450nm处读取od值。
[0088]
结果如表1所示，实施例1中一热酚法获得的lps与鸡白痢沙门菌感染阳性血清的反应效果比实施例1中二试剂盒提取的lps好，与spf鸡血清反应效果无差别。
[0089]
表1为鸡白痢沙门菌检测比较
[0090][0091]
二、热酚法获得lps作为抗原进行间接elisa反应的条件优化
[0092]
1、抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定
[0093]
采用棋盘稀释法。
[0094]
1)包被：将实施例1的一得到的纯化的lps(热酚法)用抗原稀释液(0.05mol/l碳酸氢钠缓冲液)，分别稀释为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，最后一列作为空白对照，每孔100μl，4℃放置16h进行包被；
[0095]
2)封闭：弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入含有3％明胶的pbst作为封闭液，4℃封闭12h；
[0096]
3)一抗反应
[0097]
将鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡阴性血清分别按照1:12.5、1:25
······
1:800稀释(血清抗体稀释液用pbst稀释)，按照浓度高低自上而下加入到反应板中，每孔加入100μl，最后一行作为无血清空白对照。37℃反应60min；
[0098]
4)二抗反应
[0099]
弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入100μlpbst稀释液稀释1:10000的hrp标记兔抗鸡igg(辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗鸡igg抗体(a9046-1ml)购自sigma)，37℃反应30min；
[0100]
5)显色
[0101]
弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入底物显色液(tmb双组分显色液)100μl，37℃避光显色15min，每孔加入50μl终止液(2mol/l h2so4)，用酶联读数仪450nm处读取od值。
[0102]
p值为鸡白痢沙门菌感染阳性血清的od值，n值为spf鸡阴性血清od值；p/n值最大的条件确定为最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释度。
[0103]
方阵实验结果如表2所示，在抗原包被浓度，血清作用浓度比较高时，阳性血清的od值维持在一个较高水平；依据p/n值最高时的条件确定，最佳抗原包被浓度为10μg/ml，最佳血清抗体稀释度为1:50。
[0104]
表2为鸡白痢沙门菌间接elisa方阵滴定实验
[0105][0106][0107]
2、最佳封闭液及封闭条件的确定
[0108]
按照1的方法，不同的步骤如下：
[0109]
1)采用稀释为10μg/ml的纯化的lps(热酚水法)包被；
[0110]
2)封闭：弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔分别加入1％明胶-pbst、3％明胶-pbst、2％脱脂奶粉-pbst、10％脱脂奶粉-pbst、1％新生牛血清-pbst、10％新生牛血清-pbst、1％bsa-pbst、3％bsa-pbst(质量百分含量)作为封闭液，4℃封闭1h、2h、12h、24h；
[0111]
pbs(ph 7.4)溶液的配制：称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g，去离子水溶解，定容至1l，之后调节ph为7.4，高压灭菌。
[0112]
pbst溶液的配制：在1l的pbs(ph 7.4)溶液中加入500μl吐温-20。
[0113]
1％明胶-pbst，称取1g明胶加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0114]
3％明胶-pbst，称取3g明胶加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0115]
2％脱脂奶粉-pbst，称取2g脱脂奶粉加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0116]
10％脱脂奶粉-pbst，称取10g脱脂奶粉加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0117]
1％新生牛血清-pbst：量取1ml新生牛血清加入99mlpbst中，混匀后4℃备用。
[0118]
10％新生牛血清-pbst：量取10ml新生牛血清加入90mlpbst中，混匀后4℃备用。
[0119]
1％bsa-pbst：称取1gbsa加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0120]
3％bsa-pbst：称取3gbsa加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0121]
3)一抗反应：最佳血清抗体稀释度为1:50；
[0122]
4)二抗反应；
[0123]
5)显色；
[0124]
其余步骤与1相同。
[0125]
最终检测od值后，p/n值最大的条件确定为最佳封闭液的种类与最佳封闭时间。
[0126]
结果如表3和表4所示，3％明胶-pbst作为封闭液时p/n的值最高，4℃封闭12h时检测结果的p/n值最高。
[0127]
表3为封闭液的选择
[0128][0129]
表4为封闭时间的选择
[0130][0131]
3、最佳血清抗体稀释液和血清抗体最佳作用时间的确定
[0132]
按照1的方法，不同的步骤如下：
[0133]
1)采用稀释为10μg/ml的纯化的lps(热酚水法)包被；
[0134]
2)封闭：弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔分别加入3％明胶-pbst作为封闭液时p/n的值最高，4℃封闭12h；
[0135]
3)一抗反应
[0136]
将鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡阴性血清分别按照1:50以0.5％蔗糖-pbst、5％新生牛血清-pbst、10％脱脂奶-pbst、1％bsa-pbst、5％bsa-pbst、1％bsa 5％新生牛血清-pbst、pbst作为血清抗体稀释液进行稀释；37℃反应0.5h、1h、1.5h、2h；
[0137]
pbs(ph 7.4)溶液：称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g，去离子水溶解，定容至1l，之后调节ph为7.4，高压灭菌。
[0138]
pbst溶液：在1l的pbs中加入500μl吐温-20。
[0139]
0.5％蔗糖-pbst：称取0.5g蔗糖加入100mlpbst中，混匀后4℃保存。
[0140]
5％新生牛血清-pbst：量取5ml新生牛血清加入95mlpbst中，混匀后4℃备用。
[0141]
10％脱脂奶粉-pbst，称取10g脱脂奶粉加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0142]
1％bsa-pbst：称取1gbsa加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0143]
5％bsa-pbst：称取5gbsa加入100ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0144]
1％bsa 5％新生牛血清-pbst：称取1gbsa和5ml加入95ml pbst中，混匀后4℃保存。
[0145]
4)二抗反应；
[0146]
5)显色。
[0147]
其余步骤与1相同。
[0148]
最终检测od值后，p/n值最大的条件确定为最佳血清抗体作用时间。
[0149]
结果如表5所示，0.5％蔗糖-pbst为最佳血清抗体稀释液，p/n值最高。如表6所示，30min时，p/n值最高，37℃30min为最佳血清抗体作用时间。
[0150]
表5为最佳血清样品稀释液的选择
[0151][0152]
表6为血清最佳作用时间的选择
[0153][0154][0155]
4、最佳酶标二抗稀释液及工作浓度与时间的确定
[0156]
按照1的方法，不同的步骤如下：
[0157]
1)采用稀释为10μg/ml的纯化的lps(热酚水法)包被；
[0158]
2)封闭：弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔分别加入3％明胶-pbst作为封闭液时p/n的值最高，4℃封闭12h；
[0159]
3)一抗反应
[0160]
将鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡阴性血清分别按照1:50以0.5％蔗糖-pbst作为血清抗体稀释液进行稀释；37℃反应0.5h；
[0161]
4)二抗反应：
[0162]
分别以5％新生牛血清、10％脱脂奶、pbst作为酶标二抗稀释液，以1:2500，1:5000，1:10000，1:20000，1:40000作为酶标二抗稀释度，以30min、60min、90min反应。
[0163]
5)显色
[0164]
其余步骤与1相同。
[0165]
最终检测od值后，p/n值最大的条件确定为最佳酶标二抗稀释液与最佳酶标二抗作用时间。
[0166]
结果如表7-9所示，最佳酶标二抗稀释液为pbst，最佳酶标二抗作用时间为0.5h，最佳酶标二抗稀释度为1:20000。
[0167]
表7为酶标二抗稀释液的选择
[0168][0169]
表8为最佳酶标二抗作用时间的选择
[0170][0171][0172]
表9为酶标二抗稀释倍数的选择
[0173][0174]
5、间接elisa检测方法阴阳性临界值的确定
[0175]
按照上述2-4摸索的条件建立间接elisa检测方法如下：
[0176]
1)包被：将实施例1的一得到的纯化的lps(热酚水法)用抗原稀释液(0.05mol/l碳酸氢钠缓冲液)，稀释为10μg/ml，最后一列作为空白对照，每孔100μl，4℃放置16h进行包被；
[0177]
2)封闭：弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入3％明胶-pbst作为封闭液，4℃封闭12h；
[0178]
3)一抗反应
[0179]
将鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡阴性血清分别按照1:50稀释(血清抗体稀释液0.5％蔗糖-pbst)，按照浓度高低自上而下加入到反应板中，每孔加入100μl，最后一行作为无血清空白对照。37℃反应30min；
[0180]
4)二抗反应：
[0181]
弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入100μlpbst稀释1:10000的hrp标记兔抗鸡igg(辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗鸡igg抗体(a9046-1ml)购自sigma)，37℃反应30min；
[0182]
5)显色
[0183]
弃去液体，用pbst洗涤3次，每孔加入底物显色液(tmb)100μl，37℃避光显色15min，每孔加入50μl终止液(2mol/l h2so4)，用酶联读数仪450nm处读取od值。
[0184]
用上述间接elisa检测方法检测91份spf鸡阴性血清，并测定od450值。计算阴性对照平均值和标准差(sd)，以(od450阴性对照值 3sd)为阴阳性临界值。
[0185]
91份spf鸡阴性血清od450值中最小值为0.104，最大值为0.466，标准差为0.065，平均值为0.248，3sd＝0.195，故本试验间接elisa方法的临界值定为阴性对照od450平均值 0.195，即血清样品的od450≥阴性对照od450平均值 0.195，判为阳性；<阴性对照od450平均值 0.195时判为阴性。
[0186]
因此，判断标准如下：
[0187]
若待测血清的od450值≥阴性对照od450平均值 0.195，则判为阳性，待测血清感染或候选感染鸡白痢沙门菌，或待测血清含有候选含有鸡白痢沙门菌抗体；
[0188]
若待测血清的od450<阴性对照od450平均值 0.195，则判为阴性，待测血清不感染或候选不感染鸡白痢沙门菌，或待测血清不含有候选不含有鸡白痢沙门菌抗体。
[0189]
二、间接elisa检测方法的评价
[0190]
1、特异性试验
[0191]
用上述一建立优化的间接elisa方法，分别对大肠杆菌o78阳性血清，禽流感(ai)h5、h7、h9阳性血清，禽腺病毒(eds)阳性血清，传染性支气管炎(ibv)阳性血清，败血支原体(mg)阳性血清，禽白血病(al)阳性血清，鸡传染性贫血(cia)阳性血清、及新城疫(nd)阳性血清及已知阳性、spf鸡血清进行特异性检测。
[0192]
间接elisa方法检测结果显示如表10所示，大肠杆菌o78阳性血清，aiv h5、h7、h9阳性血清，eds阳性血清，ibv阳性血清，mg阳性血清，alv血清，cia阳性血清、nd阳性血清的od值均在0.515以下，鸡白痢阳性血清的od值为1.47，鸡白痢阴性血清的od值为0.319，表明此间接elisa具有良好的特异性。
[0193]
表10为特异性试验结果
[0194][0195]
2、重复性实验
[0196]
选取5份鸡白痢沙门菌感染阳性血清和1份spf鸡阴性血清，在一块相同的酶标版上，用上述一建立优化的间接elisa方法检测，每份血清重复5个孔。依据检测的od值结果计算每份血清样品od值的变异系数(cv)，以检测同一批次的酶标板检测血清样品的重复性。
[0197]
选取5份鸡白痢沙门菌感染阳性血清和1份spf鸡阴性血清，用3份不同批次的脂多糖包被酶标板,然后在相同的条件下用上述一建立优化的间接elisa方法检测。依据检测的od值结果计算每份血清样品od值的变异系数(cv)，以检测同一批次的酶标板检测血清样品的重复性。
[0198]
结果如表11和表12所示，批内重复试验变异系数最大值为9.48％，批间重复试验变异系数最大值为5.79％。表明该方法稳定性好，在反应条件不变的情况下，不同时间的操作具有可重复性。
[0199]
表11为间接elisa批内重复试验
[0200][0201]
表12为间接elisa批内重复试验
[0202][0203]
三、间接elisa检测临床血清
[0204]
如表13所示，对588份血清样品分别用biochek d群沙门菌elisa试剂盒(购自北京天之泰生物有限公司，产品货号ck117)检测和本方法一建立优化的间接elisa方法检测，结果如下：
[0205]
biochek d群沙门菌elisa试剂盒共检测到324份阴性血清，264份阳性血清；本方法共检测到312份阳性血清，276份阴性血清；
[0206]
故本方法与d群沙门菌elisa试剂盒的总符合率为89.90％，其中阳性符合率
84.21％，阴性符合率90.90％。
[0207]
表13为沙门菌间接elisa抗体检测方法与商品化间接试剂盒符合率统计
[0208][0209]
实施例3、以鸡白痢沙门菌脂多糖为抗原建立和优化化学发光法
[0210]
一、建立鸡白痢沙门菌脂多糖抗原化学发光法
[0211]
1、制备包被板：
[0212]
碳酸盐缓冲液(0.05mol/l碳酸氢钠缓冲液)包被实施例1的一得到的纯化的lps(热酚水法)(包被浓度为1μg/ml)，4℃包被22h，洗板2次，每孔300微升洗液(pbst)，拍干；
[0213]
再用casein封闭液(购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品货号c7078-500g配方或出售公司)封闭4℃封闭22-24h，封闭液甩掉，干燥37℃3h。
[0214]
2、确定化学发光反应条件：
[0215]
将鸡白痢沙门菌感染阳性血清及spf鸡阴性血清用pbst稀释液1/40稀释，每孔加入100微升，37℃温育30min；洗板5次，每孔300微升洗液，拍板纸上拍干；
[0216]
加pbst稀释液稀释1:10000的hrp标记兔抗鸡igg(辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗鸡igg抗体，每孔100微升，37℃温育30min；洗板5次，每孔300微升洗液，拍板纸上拍干；
[0217]
每孔加入发光底物a和b各50微升，室温避光5min读取发光值；
[0218]
发光底物a的制备：称取24.23g tris溶于800ml纯化水中，充分溶解，用hcl调节ph值至8.0。加入0.026g鲁米诺，待其完全溶解后，加入0.086g羟基香豆素，纯化水定容至1l。高压灭菌后分装，置2～8℃保存。
[0219]
发光底物b的制备：称取15.42g醋酸铵溶于800ml纯化水中，充分溶解，用冰醋酸调节ph值至5.2，加入0.021g维生素c，待其完全溶解后，加入0.066g氨基酸氧化酶，纯化水定容至1l。高压灭菌后分装，置2～8℃保存。
[0220]
3、化学发光法阴阳性临界值的确定：
[0221]
用建立并优化的化学发光法检测100份阴阳性鸡血清，确定临界值为s/p0.55，判断标准如下：
[0222]
若血清样品的s/p≥0.55，判为阳性，待测血清感染或候选感染鸡白痢沙门菌，或待测血清含有候选含有鸡白痢沙门菌抗体；
[0223]
若血清样品的s/p<0.55，判为阴性，待测血清不感染或候选不感染鸡白痢沙门菌，或待测血清不含有候选不含有鸡白痢沙门菌抗体。
[0224]
二、临床血清检测
[0225]
如表14所示，对550份血清样品分别用biochek d群沙门菌elisa试剂盒(购自北京天之泰生物有限公司，产品货号ck117)检测和本方法一建立的化学发光法检测，结果如下：
[0226]
biochek d群沙门菌elisa试剂盒共检测到300份阴性血清，250份阳性血清；本方法共检测到284份阳性血清，266份阴性血清；故本方法与d群沙门菌elisa试剂盒的总符合率为92.73％，其中阳性符合率90.67％，阴性符合率95.2％。
[0227]
表14为鸡白痢沙门菌抗体化学发光法与商品化elisa试剂盒符合率统计
[0228][0229]
实施例4、以鸡白痢沙门菌脂多糖为抗原建立和优化荧光微球定量层析法
[0230]
一、建立鸡白痢沙门菌抗体检测荧光微球定量层析法
[0231]
1、制备鸡白痢沙门菌抗体检测试纸条(荧光微球定量层析法)
[0232]
把硝酸纤维素膜粘贴在pvc底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.4mg/ml的羊抗鸡lgy的lgg(羊抗鸡lgy的lgg购自美国jackson，稀释浓度：0.4mg/ml；稀释液配方：称取6.7g硼酸，13.4g硼砂(含10个结晶水)，溶解于800ml纯化水，定容至1l，调节ph值至8.5。)形成质控线和已稀释好的实施例1的一得到的纯化的lps(热酚水法)(稀释浓度：0.4mg/ml。稀释液配方：甲液(0.2mol/l磷酸氢二钠溶液)：称取2.84g磷酸氢二钠加纯化水定容至100ml；乙液(0.2mol/l磷酸二氢钠溶液)：称取3.12g磷酸二氢钠(含2个结晶水)加纯化水定容至100ml；分别量取甲液94.7ml和乙液5.3ml，混匀后量取25ml加入75ml纯化水，混匀。)形成检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
[0233]
制备标记有鸡lgy的镧系荧光微球(荧光微球(200nm)，购自辉质生物)和标记有实施例1得到的纯化的lps的镧系荧光微球(同上)。将镧系荧光微球标记鸡lgy的制备方法如下：将1ml的镧系荧光微球加入到50mg的mes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.1m，ph7.0；配方：称取0.2g 2-(n-吗啡啉)乙磺酸，100ml纯化水溶解，调节ph至7.0。)中，再加入10mg碳二亚胺(edc)和10mg n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mm硼酸缓冲液(ph8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡lgy，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡lgy的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记鸡白痢沙门菌脂多糖的镧系荧光微球；
[0234]
把标记有鸡lgy和标记有鸡白痢沙门菌脂多糖的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.2μg/ml和2μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
[0235]
把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在已经粘有含有检测线和质控线nc膜的pvc底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，即得到鸡白痢沙门菌抗体检测试纸条。
[0236]
2、确定鸡白痢沙门菌抗体检测试纸条使用方法
[0237]
用样本稀释液(pbst)将鸡血清(待测样本)按1:4比例稀释，混匀；吸取待检样本，
垂直而缓慢的滴加2-3滴(约60μl)到检测卡的加样孔内打开荧光免疫分析仪，静置10-15分钟，上机检测，超过20分钟的结果无效；用荧光免疫分析仪检测，获取检测线(t)和质控线(c)的荧光信号，并根据质控线(t)和检测线(c)的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中鸡白痢沙门菌抗体的含量。
[0238]
用建立并优化的荧光微球定量层析法检测100份阴阳性鸡血清，确定临界值为t/c0.015；判断标准如下：
[0239]
若血清样品的t/c≥0.015，判为阳性，待测血清感染或候选感染鸡白痢沙门菌，或待测血清含有候选含有鸡白痢沙门菌抗体；
[0240]
若血清样品的t/c<0.015，判为阴性，待测血清不感染或候选不感染鸡白痢沙门菌，或待测血清不含有候选不含有鸡白痢沙门菌抗体。
[0241]
二、临床血清检测
[0242]
如表15所示，对550份血清样品分别用biochek d群沙门菌elisa试剂盒(购自北京天之泰生物有限公司，产品货号ck117)检测和本方法一建立的荧光微球定量层析法)检测，结果如下：
[0243]
biochek d群沙门菌elisa试剂盒共检测到300份阴性血清，250份阳性血清，本方法共检测到283份阳性血清，267份阴性血清；故本方法与d群沙门菌elisa试剂盒的总符合率为91.45％，其中阳性符合率89.3％，阴性符合率94％。
[0244]
表15为鸡白痢沙门菌抗体检测试纸条与商品化elisa试剂盒符合率统计
[0245]