一种少量细胞的透射电镜样品制备方法与流程

1.本发明涉及透射电镜技术领域，尤其涉及一种少量细胞的透射电镜样品制备方法。
2.

背景技术：

3.透射电镜(transmission electron microscopy，tem)是ic行业观测微观结构非常重要的工具和手段。在线检测的很多关键尺寸都需要和透射电镜的测量值做比较，同时也是解决在线检测很多问题的一个重要方式。
4.常规的透射电镜包埋方法对细胞样品的数量要求较高，基本采取离心取沉淀物进行样品处理与包埋的方法。而离心次数过多会造成样品有形物质形貌发生改变，操作步骤比较繁琐，比较消耗时间。当细胞样品数量不足够多的话，多次离心和后续的操作会造成细胞不同程度的丢失，很难进行包埋，包埋后对后期进行超薄切片和电镜观察造成诸多不便。
5.

技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决现有技术中细胞需要量太多，且容易丢失的缺陷。
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，包含以下步骤：s1：准备细胞，将细胞加入到ep管中，s2：标本固定：将s1中收集的细胞加入预冷的戊二醛固定液中，使用ep管离心，取出上清液，加入1%琼脂糖凝胶，挑起ep管底部的细胞团块包裹在琼脂糖凝胶中，冷却至固定状态后，切割并重新加入戊二醛固定液，再使用二甲坤酸钠缓冲液清洗多次，然后使用纯水清洗；s3：使用乙醇逐级脱水；s4：使用环氧丙烷、环氧丙烷及纯epon
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812溶液的混合液及epon
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812环氧树脂分别对细胞浸透；s5：将s4中的细胞样品逐步加温聚合，形成包埋块；s6：对s5中的包埋块进行观察，对细胞密集块区域进行打磨并切割成树脂小块；s7：对树脂小块进行切片形成半薄切片，并对细胞区域进行染色定位，然后根据半薄切片图像提示选取目标区域，对半薄切片进行修块及打磨，只剩目标区域后以目标区域以中心用钻石刀切厚度为70
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90nm的超薄切片，得到目标区域细胞断面，即为透射电镜样品。
8.优选的，所述s1具体包含以下步骤：将培养在培养皿或者培养瓶中的细胞使用pbs清洗，并将清洗后的细胞加入到1.5ml的ep管中，并经过离心后，细胞聚集在管底。
9.优选的，所述s2中将s1中的细胞加入预冷的戊二醛固定液1ml，加入过程中稳定ep
管，并在加入完成后，在4℃条件下固定2h或者过夜。
10.优选的，所述s2中琼脂糖凝胶提前配置，并在加入前进行加热然后自然冷却至40
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50℃，琼脂糖凝胶加入量为100 ul，自然冷却至琼脂糖凝胶至固定状态后，切割呈1：1：1的小方块。
11.优选的，所述s2中使用的二甲坤酸钠缓冲液清洗6次，每次15min，然后使用1%锇酸固定2h，再使用纯水清洗6次每次5min，在4℃条件下进行。
12.优选的，乙醇逐级脱水使用浓度为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇分别脱水一次，然后使用无水乙醇脱水两次。
13.优选的，所述s4具体包含以下步骤：b1：使用环氧丙烷置换两次；b2：使用环氧丙烷和纯epon
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812按2：1的比例混合溶液对细胞浸透；b3：使用环氧丙烷和纯epon
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812按1：2的比例混合溶液对细胞浸透；b4：使用epon
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812环氧树脂对细胞浸透，浸透温度37℃ ，浸透时间7h，得到细胞样品。
14.优选的，所述s5中的逐步加温聚合顺序为：首先放入37℃烘箱24h；然后放入45℃烘箱24h；再放入60℃烘箱24h；最后放入37℃烘箱。
15.优选的，所述s7中使用醋酸铀
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柠檬酸铅对细胞区域进行双重染色，并在染色完成后使用纯水冲洗，并使用红外灯照射烘干。
16.优选的，所述醋酸铀为醋酸双氧铀，使用25%饱和醋酸铀，用50
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70%乙醇配制得到，所述柠檬酸铅的配方为硝酸铅1.33克，柠檬酸纳1.76克，蒸馏水30毫升；震荡半小时，加入1n 氢氧化钠5毫升，加蒸馏水配制50毫升。
17.上述所述的一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，可以避免多次离心影响细胞形貌发生改变，能够真实反映细胞内部物质真实的形貌，且对细胞样品的数量没有太多的要求，在实际操作中，可以应用于各种细胞样品或者类似于细胞等体积过小，容易松散样品的透射电镜观察。
18.附图说明
19.图1为利用本发明方法得到的透射电镜细胞样品epon
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812环氧树脂包埋块示意图；图2为利用常规方法得到的透射电镜细胞样品epon
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812环氧树脂包埋块示意图。
20.具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
22.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
23.一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，包含以下步骤：s1：细胞准备：具体的，将培养在培养皿或者培养瓶中的细胞使用pbs漂洗，在一实施方式中，所述pbs的ph值为7.2，漂洗次数为3次，每次漂洗时间为0.5min；然后将清洗后的细胞加入到1.5ml的ep管中，在一实施方式中，使用胰酶消化法将细胞加入到1.5ml的ep管中，在一实施方式中，胰酶消化法使用的胰酶浓度为2.5%，消化时间根据细胞状态来确定。经过离心后，细胞聚集在管底，在一实施方式中，离心转速为1500r/min，离心5min。在其他实施方式中，可以根据实验要求使用刮片法或者其他方法将细胞加入到1.5ml的ep管中。
24.s2：标本固定：a1：标本的初始固定：将s1中收集好的细胞加入到预冷的戊二醛固定液1ml，加入过程中稳定1.5ml的ep管，以免造成细胞分散后不成团块，加入完成后，在4℃条件下固定2h或者过夜。
25.a2：琼脂糖凝胶包裹：提前配置好1%琼脂糖凝胶，加入微波炉中进行加热，然后自然冷却至40
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50℃，在一实施方式中，使用的琼脂糖凝胶为浓度1%不含eb的琼脂糖。
26.对a1中的ep管进行离心，弃去上清液，加入100 ul的琼脂糖凝胶，然后挑起ep管底部的细胞团块包裹在琼脂凝胶糖中，挑起过程中需要动作轻柔，防止细胞团块损坏，自然冷却至琼脂糖凝胶至固定状态，进行切割呈1：1：1的小方块，且在不破坏凝胶包裹细胞的前提下尽可能的切小，然后重新加入4%戊二醛固定液1ml，在4℃下放置。
27.a3：标本后固定：使用0.1mol/l的二甲坤酸钠缓冲液清洗6次，每次15min，然后使用1%锇酸固定2h，再使用纯水清洗6次每次5min，在4℃条件下进行。
28.s3：乙醇脱水：使用浓度为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇分别脱水一次，每次脱水15min，然后使用无水乙醇脱水两次，每次30min。
29.在另一实施方式中，使用70%的乙醇脱水时长为过夜。
30.s4：浸透：b1：使用环氧丙烷置换两次，每次30min，温度28℃。
31.b2：使用环氧丙烷和纯epon
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812按2：1的比例混合溶液对细胞浸透，浸透温度30℃ ，浸透时间4h。
32.b3：使用环氧丙烷和纯epon
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812按1：2的比例混合溶液对细胞浸透，浸透温度35℃ ，浸透时间5h。
33.b4：使用epon
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812环氧树脂对细胞浸透，浸透温度37℃ ，浸透时间7h，得到细胞样品，在一实施方式中，浸透操作在机器上进行，浸透过程中需要将细胞样品来回晃动，以使epon
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812环氧树脂逐步的完全取代样品中的脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被纯epon
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812环氧树脂填充。所述epon
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812环氧树脂配方为：ddsa（十二烯基丁二酸酐、固化剂），mna(甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐、固化剂)，dmp
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30(加速剂)。
34.s5：包埋：具体的，将s4中得到的细胞样品，放入到灌满纯epon
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812环氧树脂包埋剂的模具中，然后加温聚合，进行加温聚合，在一实施方式中，首先放入37℃烘箱24h；然后放入45℃烘箱24h；再放入60℃烘箱24h；最后放入37℃烘箱，形成包埋块。纯epon
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812环氧树脂包埋
剂在聚合前为液体，能够渗入到细胞内，经加温聚合成固体，以便后续进行超薄切片。
35.s6：修块：首先对s5中的包埋块进行观察， 挑选出细胞密集块区域，在一实施方式中，包埋块上黑色区域为细胞密集块区域，对细胞密集块进行打磨并切割呈梯形体或长方体形的树脂小块。其中细胞密集块区域变成黑色，是由于锇酸氧化造成的结果。
36.s7：切片、染色：具体的，在一实施方式中，分别包含以下步骤：切片：将切割好的树脂小块，使用半薄切片机切片，切成厚度为1
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2 um的半薄切片；染色：染色定位细胞区域，使用醋酸铀
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柠檬酸铅双重染色，然后使用纯水冲洗、红外灯照射烘干；在一实施方式中，使用的醋酸铀为醋酸双氧铀，使用铀染色液为2
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5%饱和醋酸铀，用50
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70%乙醇配制；所述柠檬酸铅染色液的配方为：硝酸铅1.33克，柠檬酸纳1.76克，蒸馏水30毫升；震荡半小时，加入1n 氢氧化钠5毫升，加蒸馏水配制50毫升。
37.打磨：根据半薄切片图像提示选取目标区域，再次对包埋块进行修块打磨，只剩目标区域，然后以目标区域以中心用钻石刀切厚度为70
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90nm的超薄切片，得到目标区域细胞断面，即为透射电镜样品。
38.请参阅图1和图2，图1为利用本发明方法得到的透射电镜细胞样品epon
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812环氧树脂包埋块示意图,所需要的细胞数量明显比图2要少得多，而且细胞团块容易集聚，不易分散，易于电镜下观察。
39.本技术提供的一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，可以避免多次离心影响细胞形貌发生改变，能够真实反映细胞内部物质真实的形貌，且对细胞样品的数量没有太多的要求，在实际操作中，可以应用于各种细胞样品或者类似于细胞等体积过小，容易松散样品的透射电镜观察。
40.以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。