瑞德西韦及其核苷的组合制剂在抗猪流行性腹泻病毒中的应用的制作方法

1.本发明涉及兽药领域，具体地涉及瑞德西韦及其核苷的组合制剂在抗猪流行性腹泻病毒(pdev)中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒是目前较为广泛常见的一类病毒，可以感染多种哺乳动物，包括蝙蝠、猪、犬、猫、鼠、牛、马、骆驼等，这些病毒多为α、β属。猪流行性腹泻病毒(pedv)是一种能引起猪急性肠道传染病的冠状病毒，各种年龄的猪都能感染发病，其中，尤以哺乳猪、新生仔猪受害最为严重，养殖业常因pedv的爆发而蒙受重大损失。
3.猪流行性腹泻(ped)是由猪流行性腹泻病毒(pedv)引起的一种猪的急性、高度接触性肠道传染病，其传播快、流行广、仔猪致死率高，对我国及世界养猪业来说，都是一个巨大的威胁。pedv是一种rna病毒，属于属套式病毒目α冠状病毒属，于上世纪七十年代，在国外被首次发现。我国在上世纪八十年代确定了pedv在国内的流行，自此，猪流行性腹泻(ped)成为猪场病毒性腹泻的常见疾病。2010年，由pedv变异毒株导致的ped大规模爆发，给养猪业带来了重大的损失。
4.pedv对不同年龄阶段的猪均可造成感染，但该病毒对哺乳仔猪的危害最大，7日龄以内的仔猪感染后主要表现为水样腹泻、呕吐、脱水，死亡率高达100％。针对该病，目前没有特效药物，临床上主要以接种疫苗的方式来防控该病的发生。
5.综上所述，本领域迫切需要开发抑制猪流行性腹泻病毒(pdev)复制的抑制剂以用于治疗由猪流行性腹泻病毒引起的相关疾病。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种可有效抑制猪流行性腹泻病毒(pdev)复制的活性成分及其在猪流行性腹泻病毒(pdev)感染引起的相关疾病中的新用途。
7.在本发明的第一方面，提供了一种活性成分或含所述活性成分的制剂的用途，所述的活性成分为化合物gs-441524(瑞德西韦核苷)或gs-5734(瑞德西韦)，或其药学上可接受的盐或其水合物或其溶剂化物或其前药：
[0008][0009]
并且，所述的活性成分或含所述活性成分的制剂被用于制备(a)抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)复制的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由猪流行性腹泻病毒(pedv)感
染引起的相关疾病的药物。
[0010]
在另一优选例中，所述病毒引起的相关疾病为猪流行性腹泻。
[0011]
在另一优选例中，所述制剂还含有选自下组的其他抗病毒药：
[0012]
法匹拉韦(favipiravir)、galidesivir、、nhc(eidd-1931)、eidd-2801、gc-376、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)；氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenol ic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、萘酚喹(naphthoquine)、环索奈德(ciclesonide)、利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、来氟米特(leflunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(darunavir)、阿比多尔(arbidol)、卡莫司他(camostat)、氯硝柳胺(niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(ruxolitinib)、达沙替尼(dasatinib)、沙奎那韦(saquinavir)、beclabuvir、司美匹韦(simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(motavizumab)、rsv-igivmedi-557、a-60444(rsv-604)、mdt-637、bms-433771、或其药学上可接受的盐、或其组合。
[0013]
在另一优选例中，所述的制剂为药物组合物。
[0014]
在另一优选例中，所述的制剂(或药物组合物)包括：口服制剂和非口服制剂。
[0015]
在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、吸入剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
[0016]
在本发明的第二方面，提供了一种兽药组合物，所述的兽药组合物含有：
[0017]
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分为化合物gs-441524或gs-5734，或其药学上可接受的盐或其水合物或其溶剂化物或其前药：
[0018][0019]
以及(b)药学上可接受的载体(或兽药学上可接受的载体)。
[0020]
在另一优选例中，所述的组合物还含有(a2)第二活性成分；
[0021]
其中，所述的第二活性成分为抗病毒药物，其选自下组：干扰素、rna依赖的rna聚合酶抑制剂(如法匹拉韦(favipiravir)、galidesivir、nhc(eidd-1931)、eidd-2801)、3cl蛋白酶抑制剂(如gc-376)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)；氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、萘酚喹(naphthoquine)、环索奈德(ciclesonide)、利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、来氟米特
(leflunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(darunavir)、阿比多尔(arbidol)、卡莫司他(camostat)、氯硝柳胺(niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(ruxolitinib)、达沙替尼(dasatinib)、沙奎那韦(saquinavir)、beclabuvir、司美匹韦(simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(motavizumab)、rsv-igivmedi-557、a-60444(rsv-604)、mdt-637、bms-433771、或其药学上可接受的盐、或其组合；
[0022]
和/或所述的第二活性成分选自下组：锌(zinc)、芬戈莫德(fingolimod)、维生素c(vitamin c)、奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)、缬沙坦(valsartan)、氯沙坦(losartan)、沙利度胺(thalidomide)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、青蒿素(artemisinin)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)、青蒿琥酯(artesunate)、青蒿酮(artemisone)、阿奇霉素(azithromycin)、七叶皂苷(escin)、萘普生(naproxen)、或其组合。
[0023]
在另一优选例中，所述的组合物还含有饲料添加剂和/或消毒剂。
[0024]
在另一优选例中，所述的第二活性成分选自下组：(y1)rna复制酶抑制剂(如法匹拉韦(favipiravir)、galidesivir、nhc、eidd-2801)；(y2)洛匹那韦(lopinavir)；(y3)利托那韦(ritonavir)；(y4)氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(y5)奈非那韦(nelfinavir)；(y6)上述y1～y5的任意组合。
[0025]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)复制。
[0026]
在本发明的第三方面，提供了一种本发明第二方面所述的兽药组合物的用途，用于制备(a)抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由猪流行性腹泻病毒(pedv)感染引起的相关疾病的药物。
[0027]
在本发明的第四方面，提供了一种抑制猪流行性腹泻病毒复制的方法，包括步骤：
[0028]
将第一活性成分或含所述第一活性成分的制剂与猪流行性腹泻病毒(pedv)接触，从而抑制所述病毒的复制；
[0029]
其中，所述的第一活性成分为化合物gs-441524或gs-5734，或其药学上可接受的盐或其结晶水合物或其溶剂化物或其前药：
[0030][0031]
在本发明的第五方面，提供了一种(a)抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)复制和/或(b)治疗和/或预防、缓解由猪流行性腹泻病毒(pedv)感染引起的相关疾病的方法，包括步骤：向待处理的环境或给需要的对象施用第一活性成分；其中第一活性成分为化合物gs-441524或gs-5734，或其药学上可接受的盐或其水合物或其溶剂化物或其前药：
[0032][0033]
在另一优选例中，所述的疾病为猪流行性腹泻病毒(pedv)引起的猪流行性腹泻。
[0034]
在另一优选例中，所述的对象为猪。
[0035]
在另一优选例中，所述方法是体外方法。
[0036]
在另一优选例中，所述方法是非治疗性和非诊断性的。
[0037]
在另一优选例中，所述的待处理的环境为猪的养殖场所。
[0038]
在另一优选例中，所述的方法为治疗方法。
[0039]
在另一优选例中，所述的施用量为抑制病毒复制的有效量。
[0040]
在另一优选中，所述的方法，还包括步骤：向待处理的环境施用消毒剂或第二活性成分，或给需要的对象施用第二活性成分；其中所述的第二活性成分选自下组：
[0041]
法匹拉韦(favipiravir)、nhc(eidd-1931)、eidd-2801、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、奈非那韦(nelfinavir)。
[0042]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0043]
图1是化合物gs-441524(a)和化合物gs-5734(b)对vero细胞的毒性试验结果。
[0044]
图2是利用cpe法(细胞病变效应)评价化合物gs-441524抗猪流行性腹泻病毒(pedv)作用的显微图片。
[0045]
图3是利用cpe法(细胞病变效应)评价化合物gs-5734抗猪流行性腹泻病毒(pedv)作用的显微图片。
[0046]
图4是化合物gs-441524(左)和化合物gs-5734(右)体外72h抗猪流行性腹泻病毒(pedv)活性的ec
50
测定曲线。
[0047]
图5是化合物gs-441524(a)和化合物gs-5734(b)体外48h抗猪流行性腹泻病毒(pedv)活性的测定结果。
[0048]
图6是化合物gs-441524抗猪流行性腹泻病毒(pedv)活性的间接免疫荧光测定结果。
[0049]
图7是化合物gs-5734抗猪流行性腹泻病毒(pedv)活性的间接免疫荧光测定结果。
具体实施方式
[0050]
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地发现瑞德西韦及其
核苷可有效抑制猪流行性腹泻病毒复制。实验表明，本发明的活性成分可高效地抑制猪流行性腹泻病毒的复制和活力，因此可用于抑制猪流行性腹泻病毒的复制，用于制备预防、治疗由猪流行性腹泻病毒引起的相关疾病。在此基础上完成了本发明。
[0051]
具体地，本发明揭示了化合物gs-441524(瑞德西韦核苷)或化合物gs-5734(瑞德西韦)及其药物组合物在抗猪流行性腹泻病毒(pedv)中的用途。化合物gs-441524或化合物gs-5734及其药物组合物对猪流行性腹泻病毒(pedv)的复制具有显著的抑制作用，临床应用前景良好。
[0052]
术语
[0053]
如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的活性成分”、“本发明的抑制猪流行性腹泻病毒(pdev)的活性化合物”可互换使用，指具有优异的抑制猪流行性腹泻病毒(pdev)复制的活性的化合物gs-441524(瑞德西韦核苷)和化合物gs-5734(瑞德西韦)，或其药学上可接受的盐、或其水合物(如结晶水合物)、或其溶剂合物、或其前药、或其组合:
[0054][0055]
如本文所用，“本发明的制剂”指含有本发明活性化合物的制剂,包括兽药组合物、饲料、抑制剂产品等。
[0056]
如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被理解为包括所述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0057]
猪流行性腹泻病毒(pedv)
[0058]
猪流行腹泻病毒(pedv),属于冠状病毒科冠状病毒属。猪流行性腹泻是由pedv病毒引起的仔猪和育肥猪的一种急性肠道传染病。
[0059]
pedv病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠。pedv病毒的复制可在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行。pedv可导致腹泻，属于渗透性腹泻。严重腹泻引起脱水，是导致病猪死亡的主要原因。
[0060]
本发明的活性化合物和活性成分
[0061]
本发明的化合物gs-441524或gs-5734具有如下所示的结构：
[0062][0063]
gs-441524是一种1'-氰基取代的含有非天然碱基的类核苷，该化合物最早出现在2009年公开的专利wo2009132135中，由吉利德科学公司开发，用于治疗黄病毒科病毒感染，
c6628)、羟氯喹、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、萘酚喹(naphthoquine)、环索奈德(ciclesonide)、利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、来氟米特(leflunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(darunavir)、阿比多尔(arbidol)、卡莫司他(camostat)、氯硝柳胺(niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(ruxolitinib)、达沙替尼(dasatinib)、沙奎那韦(saquinavir)、beclabuvir、司美匹韦(simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(motavizumab)、rsv-igivmedi-557、a-60444(rsv-604)、mdt-637、bms-433771或其药学上可接受的盐、或其组合。所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-1a、干扰素β-1b中的一种或多种。
[0072]
额外的治疗剂，例如通过抗炎级联机制起作用的其它抗炎剂，还可与化合物gs-441524或化合物gs-5734联用，以治疗病毒性感染。例如，应用“抗炎信号转导调节剂”(在本文中被称为aistm)比如磷酸二酯酶抑制剂(例如pde-4、pde-5或pde-7特异的)、转录因子抑制剂(例如通过ikk抑制阻断nfκb)或激酶抑制剂(例如阻断p38map、jnk、pi3k、egfr或syk)，是切断炎症的合乎逻辑的方法，因为这些小分子的目标是有限数量的常见细胞内路径-是抗炎治疗干预的关键点的那些信号转导路径(参见，由p.j.barnes,2006综述)。这些非限制性的额外的治疗剂包括：5-(2,4-二氟-苯氧基)-1-异丁基-1h-吲唑-6-甲酸(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺(p38map激酶抑制剂arry-797)；3-环丙基甲氧基-n-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-4-二氟甲氧基-苯甲酰胺(pde-4抑制剂罗氟司特)；4-[2-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-乙基]-吡啶(pde-4抑制剂cdp-840)；n-(3,5-二氯-4-吡啶基)-4-(二氟甲氧基)-8-[(甲基磺酰基)氨基]-1-二苯并呋喃甲酰胺(pde-4抑制剂奥米斯特)；n-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-2-[1-(4-氟苄基)-5-羟基-1h-吲哚-3-基]-2-氧代-乙酰胺(pde-4抑制剂awd12-281)；8-甲氧基-2-三氟甲基-喹啉-5-甲酸(3,5-二氯-1-氧基-吡啶-4-基)-酰胺(pde-4抑制剂sch351591)；4-[5-(4-氟苯基)-2-(4-甲亚磺酰基-苯基)-1h-咪唑-4-基]-吡啶(p38抑制剂sb-203850)；4-[4-(4-氟-苯基)-1-(3-苯基-丙基)-5-吡啶-4-基-1h-咪唑-2-基]-丁-3-炔-1-醇(p38抑制剂rwj-67657)；4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基-苯基)-环己烷甲酸2-二乙基氨基-乙酯(西洛司特的2-二乙基-乙酯前药、pde-4抑制剂)；(3-氯-4-氟苯基)-[7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺(吉非替尼，egfr抑制剂)；和4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-n-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(伊马替尼，egfr抑制剂)。
[0073]
本发明的活性成分可抑制猪流行性腹泻病毒的感染活性。因此，当在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制猪流行性腹泻病毒的感染，进而达到抗病毒作用。
[0074]
还可使本发明的任意化合物与一种或多种另外活性治疗剂相组合在单位剂型中，用于同时或依次施用给患者。组合治疗可以作为同时或依次方案来施用。当依次施用时，可以在两次或更多次施用中施用该组合。
[0075]
本发明化合物与一种或多种另外活性治疗剂的共同施用一般是指，同时或依次施用本发明的化合物与一种或多种另外活性治疗剂，使得治疗有效量的本发明化合物和一种
或多种另外活性治疗剂均存在于患者体内。
[0076]
共同施用包括在施用单位剂量的一种或多种另外活性治疗剂之前或之后施用单位剂量的本发明的化合物，例如，在施用一种或多种另外活性治疗剂的数秒、数分钟或数小时内，施用本发明的化合物。例如，可以首先施用单位剂量的本发明的化合物，随后在数秒或数分钟内，施用单位剂量的一种或多种另外活性治疗剂。或者，可以首先施用单位剂量的一种或多种其它治疗剂，随后在数秒或数分钟内，施用单位剂量的本发明的化合物。在有些情况下，可能需要首先施用单位剂量的本发明的化合物，在数小时时期(例如1-12小时)后，施用单位剂量的一种或多种另外活性治疗剂。在其它情况下，可能需要首先施用单位剂量的一种或多种另外活性治疗剂，在数小时时期(例如1-12小时)后，施用单位剂量的本发明的化合物。
[0077]
组合治疗可提供“增效作用”和“协同作用”，即，当活性成分一起使用时获得的效果大于分开使用化合物所得效果之和。当活性成分：(1)被共同配制并以组合制剂形式同时施用或递送；(2)作为单独的制剂交替施用或平行递送；或(3)通过一些其它施用方案递送时，可获得协同作用。当以交替治疗递送时，当化合物依次施用或递送时，例如以单独的片剂、丸剂或胶囊剂，或通过单独注射器的不同注射，可获得协同作用。通常，在交替治疗期间，有效剂量的每种活性成分被依次施用，即连续地施用，而在组合治疗中，有效剂量的两种或多种活性成分被一起施用。协同的抗病毒作用表示，大于所述组合中的单个化合物的预测的纯累加效应的抗病毒作用。
[0078]
药物组合物和应用
[0079]
本发明还提供了以本发明的抑制病毒复制的活性化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药的一种或多种的混合物为有效成分，在制备治疗和/或预防、缓解由猪流行性腹泻病毒(pedv)感染引起的猪流行性腹泻的药物(或兽药)中的用途。
[0080]
本发明所提供的药物组合物(或兽药组合物)优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是本发明的活性化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％或1wt％～50wt％，其余部分为药学上可接受的载体(或兽药学上可接受的载体)、稀释液或溶液或盐溶液。
[0081]
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0082]
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
[0083]
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-1000mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。
[0084]
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物(如猪)临床使用，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
[0085]
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
[0086]
典型地，本发明活性成分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、直肠等。
[0087]
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0088]
本发明活性成分可以被制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0089]
为了将本发明活性成分被制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0090]
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
[0091]
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明活性成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明的胶囊剂。
[0092]
为将本发明活性成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、ph调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；ph调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
[0093]
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
[0094]
本发明的活性成分或组合物可单独施用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
[0095]
当本发明的活性成分与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的
剂量。
[0096]
本发明的主要优点包括：
[0097]
(a)本发明活性化合物可高效地抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)的复制，化合物gs-441524和化合物gs-5734抗pedv的半数效应浓度(ec
50
)分别为0.31μm和0.74μm，治疗指数(si)分别大于1600和600。
[0098]
(b)本发明活性化合物的毒副作用低，成药性好。这提示着本发明的活性化合物(化合物gs-441524、化合物gs-5734)在治疗猪流行性腹泻领域有很好的应用前景。
[0099]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0100]
实施例1，化合物gs-441524、化合物gs-5734的细胞毒性试验
[0101]
1.1方法
[0102]
1)取生长状态良好的vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1
×
105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
[0103]
2)24h后，弃去孔中培养基，1
×
pbs洗三次，甩干后用细胞维持液对化合物进行2倍倍比稀释，使测试化合物终浓度为500μm、250μm、125μm、62.5μm、31.25μm，同时设置细胞对照；
[0104]
3)72h后，用cck-8试剂进行细胞活力检测。得到图1。
[0105]
1.2结果
[0106]
由图1可知，化合物gs-441524(图a)和化合物gs-5734(图b)都能够抑制vero细胞的毒性，且vero细胞毒性随化合浓度增加而减小。但是本发明化合物对vero细胞的毒性抑制作用较小，两个化合物的半数细胞毒性浓度(cc
50
)都大于500μm。
[0107]
实施例2，化合物gs-441524、化合物gs-5734体外抗病毒试验(cpe法)
[0108]
2.1方法
[0109]
1)取生长状态良好的vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1
×
105/ml接种于96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
[0110]
2)24h后，弃去孔中培养基，1
×
pbs洗三次，甩干后用细胞维持液对测试化合物进行2倍倍比稀释，同时每孔加入0.01moi猪流行性腹泻病毒(pedv)。使测试化合物终浓度为125μm、62.5μm、31.25μm，同时设置细胞对照，病毒对照；
[0111]
3)待病毒对照病变70％时，显微镜观察化合物与病毒共同作用后的细胞状态变化并拍照保存。
[0112]
2.2结果
[0113]
结果见图2(化合物gs-441524)和图3(化合物gs-5734)。从图中显微镜图片可以观察到正常的vero细胞生长状态良好，细胞形态完整，细胞边界清晰；而用病毒感染的细胞出现大片膜融合，核聚集现象，无完整的细胞形态，病变很明显；但是加入化合物gs-441524或化合物gs-5734处理细胞后，细胞病变程度明显降低。由此可见，化合物gs-441524和化合物gs-5734在细胞水平对pedv都有明显的抑制效果。
[0114]
实施例3，化合物gs-441524、化合物gs-5734体外抗病毒活性(ec
50
)试验(72h)
[0115]
3.1方法
[0116]
1)将vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1
×
105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
[0117]
2)24h后，用细胞维持液稀释pedv至每孔0.01moi，稀释液中分别加入终浓度为125μm、62.5μm、31.2μm、15.6μm、7.8μm、3.9μm、2.0μm、1.0μm、0.5μm、0.2μm、0.1μm的测试化合物，置于37℃、5％co2培养箱孵育1h；
[0118]
3)处理完毕后，取出96孔板，弃去孔中培养基，用1
×
pbs清洗三次，甩干后加入各组病毒液，于37℃、5％co2培养箱培养，同时设置病毒对照与细胞对照；
[0119]
4)72h后，收集细胞样品，测定不同处理组病毒含量变化。
[0120]
3.2结果
[0121]
结果见图4。通过计算药物对病毒的抑制率来反应化合物对pedv的抑制效果，从图中可以看出，化合物gs-441524和化合物gs-5734对pedv的抑制效果都呈剂量依耐性。化合物gs-441524和化合物gs-5734的半数效应浓度(ec
50
)分别为0.31μm和0.74μm。
[0122]
实施例4，化合物gs-441524、化合物gs-5734体外抗病毒活性试验(48h)
[0123]
4.1方法
[0124]
1)将vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1
×
105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
[0125]
2)24h后，用细胞维持液稀释pedv至每孔0.01moi，稀释液中分别加入终浓度为125μm、62.5μm、31.2μm、15.6μm、7.8μm、3.9μm、2.0μm、1.0μm、0.5μm、0.2μm、0.1μm的测试化合物，置于37℃、5％co2培养箱孵育1h；
[0126]
3)处理完毕后，取出96孔板，弃去孔中培养基，用1
×
pbs清洗三次，甩干后加入各组病毒液，于37℃、5％co2培养箱培养，同时设置病毒对照与细胞对照；
[0127]
5)48h后，收集细胞样品，测定不同处理组病毒含量变化。
[0128]
4.2结果
[0129]
结果见图5。从图5可知，随着测试化合物浓度增加，病毒抑制效果越明显，呈剂量依赖性。化合物gs-441524(图a)在浓度为125μm、62.5μm、31.3μm、15.6μm、7.8μm、3.9μm时，都没有检测到病毒，能完全抑制病毒的增殖；在2.0μm时，病毒滴度可以降低约2000倍；在1.0μm时，可以降低约100倍；在0.5μm时，可以降低约10倍。化合物gs-5734(图b)在浓度为125μm、62.5μm、31.3μm、15.6μm时，没有检测到病毒，能完全抑制病毒的增殖；在7.8μm时，病毒滴度可以降低约4000倍；在3.9μm时，可以降低约80倍；在2.0μm时，可以降低约10倍。
[0130]
实施例5化合物gs-441524、化合物gs-5734对病毒活性间接免疫荧光检测
[0131]
5.1方法
[0132]
1)铺细胞：将vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1
×
105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
[0133]
2)病毒感染：24h后，待细胞长满单层，取出96孔板用1
×
pbs洗三遍，用细胞维持液稀释pedv至每孔0.01moi，稀释液中分别加入终浓度为1μm的测试化合物，同时设置病毒对照和细胞对照，放置于37℃、5％co2细胞培养箱继续培养；
[0134]
3)固定细胞：待病毒对照组细胞出现70％病变(能观察到膜融合且无大片脱落)，
弃掉孔中培养基，用1
×
pbs清洗2遍，每孔加入100μl4％多聚甲醛室温固定细胞30min；弃掉多聚甲醛，用1
×
pbs清洗3遍，每孔加入100μl 1％triton100室温通透10min；
[0135]
4)封闭：将固定好的板子用1
×
pbs洗3遍，每孔加入100μl5％bsa封闭，37℃封闭30min(可4℃过夜封闭)；
[0136]
5)加一抗：弃去封闭液，1
×
pbs洗3遍，每孔加入100μl 1：1000稀释的一抗(n蛋白单克隆抗体)，37℃孵育1h；
[0137]
6)加二抗：弃掉一抗，1
×
pbs洗3遍，每孔加入100μl 1：500稀释的二抗(fitc标记的羊抗鼠igg)，37℃孵育1h(注意避光操作)；
[0138]
7)弃掉二抗，1
×
pbs洗3遍，荧光显微镜下观察并拍照保存。
[0139]
5.2结果
[0140]
结果见图6和图7，分别为加入化合物gs-441524和化合物gs-5734在1μm后的荧光显微镜照片。化合物gs-441524和化合物gs-5734在1μm时，都可以观察到的荧光明显降低，表明加入化合物gs-441524和化合物gs-5734，猪流行性腹泻病毒的表达减少了，本发明化合物能有效抑制猪流行性腹泻病毒(pdev)的复制，从而帮助缓解、预防、减轻由猪流行性腹泻病毒(pdev)引起的相关疾病。
[0141]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。