一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法与流程

1.本发明属于核酸疫苗技术领域，涉及一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法。


背景技术：

2.佐剂是一类先于抗原或与抗原同时应用时能增强抗原免疫效应的物质，它的作用主要是增强机体免疫系统对抗原的特异性免疫应答反应。
3.阳离子脂质体在核酸疫苗的研制中已引起广泛的关注，探索高效内吞、有效内含体逃逸、靶向性好的核酸疫苗体系会是疫苗研发的一条有效途径。研发一种新型脂质体核酸疫苗体系，其能够使其靶向进入目标细胞、提高核酸体系的细胞内吞，增强内含体逃逸性能，促进核酸分子的高效释放，显著增强机体的免疫应答是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法，解决背景技术中提及的技术问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种脂质体核酸疫苗佐剂，包括原料有辅助脂质、阳离子脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质；
7.该脂质体核酸疫苗佐剂由如下步骤制得：
8.步骤a1，将原料溶于有机溶剂中，得到混合液a；
9.步骤a2，将混合液a采用减压旋蒸法除去有机溶剂，得到油膜；
10.步骤a3，将油膜加入分散液中，超声分散，得到脂质体悬液；
11.步骤a4，将脂质体悬液进行高压均质，得到脂质体核酸疫苗佐剂。
12.进一步，辅助脂质为胆固醇、1，2
‑
油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的任意一种。
13.进一步，聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质为1，2
‑
十八酰基
‑
sn
‑
甘油
‑
聚羧基三甲胺乙内酯、胆固醇
‑
聚羧基三甲胺乙内酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚羧基三甲胺乙内酯中的任意一种。
14.进一步，步骤a1中辅助脂质、阳离子脂质、聚羧基三甲基乙内酯的摩尔比为1：1：0.01
‑
0.5。
15.进一步，步骤a1中有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇中的任意一种。
16.进一步，步骤a3中分散液为超纯水、去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液中的任意一种。
17.进一步，步骤a4高压均质的压力为50
‑
240mpa，过压次数为1
‑
25次。
18.其中阳离子脂质由如下步骤制得：
19.步骤s1，将壳聚糖溶解在质量分数1％的醋酸溶液中，升温至35
‑
42℃，加入酶制剂，待酶解溶液粘度降至60％后，用6000截留分子量的透析膜进行透析，透析液浓缩、喷雾
干燥，得到壳聚糖粉末；
20.步骤s2，向三口烧瓶中加入壳聚糖粉末、二氯甲烷，搅拌溶解后，加入三乙胺，降温至0℃，缓慢滴加氯乙酰氯，常温下搅拌7
‑
8h，tlc检测反应完全后，浓缩，用二氯甲烷溶解，蒸馏水洗涤3
‑
4次，萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析，得到中间体1；
21.反应过程如下：
[0022][0023]
步骤s3，向三口烧瓶中加入中间体1、四氢呋喃，搅拌溶解后，加入三甲胺，常温搅拌50
‑
52h，浓缩，柱层析，得到阳离子脂质。
[0024]
反应过程如下：
[0025][0026]
进一步，步骤s1中酶制剂为壳聚糖酶、纤维素酶、糖苷酶、脂肪酶中的任意一种。
[0027]
进一步，步骤s1中酶制剂的用量为壳聚糖质量的5％。
[0028]
进一步，步骤s2中壳聚糖粉末、二氯甲烷、三乙胺、氯乙酰氯的用量比为0.5
‑
0.55g：22
‑
25ml：0.32
‑
0.35ml：0.2
‑
0.22ml。
[0029]
进一步，步骤s3中中间体1、四氢呋喃、三甲胺的用量比为0.72
‑
0.75g：42
‑
45ml：1.8
‑
2ml。
[0030]
本发明的有益效果：
[0031]
1)采用将核酸分子与阳离子脂质体通过正负电荷作用相互吸引负载大量核酸抗原；辅助脂质和聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质结合有利于该剂型在未达到免疫前保护核酸疫苗免于酶降解，而在进入免疫细胞后辅助核酸的内涵体逃逸，提高核酸药物进入细胞核进行表达的有效剂量，使得核酸疫苗作为内源性抗原由主要组织相容复合体提呈给t细胞，显著提高机体的免疫应答；同时，该剂型具有抗原储库效应，可以长期在宿主细胞内控制表达抗原蛋白，具有长期持续的免疫作用。
[0032]
2)同时制备工艺简化，脂质体的剂型与细胞膜具有最为类似的结构，因而该剂型生物安全性好。
[0033]
3)基于以下理论，带正电的阳离子脂质与带负电的dna通过静电作用形成脂质体
‑
dna复合物，复合物经细胞内吞摄入后，阳离子脂质体复合物使内体膜去稳定化，从而触发磷脂重组，这些磷脂然后扩散到脂质体中，并和脂质体相互作用，从而dna从载体系统中解离而进入细胞质中，部分dna进入细胞核并成功表达，补偿或替代病变基因，从而达到治疗疾病的目的。阳离子脂质体包括三个部分：亲水性的阳离子头部、疏水性尾部和连接两部分
的连接臂，这里我们合成一种新型的壳聚糖类阳离子脂质体，首先壳聚糖粉末结构中的氨基与氯乙酰氯反应生成中间体1，中间体1与三甲胺反应生成阳离子脂质，壳寡糖能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
实施例1
[0036]
制备阳离子脂质：
[0037]
步骤s1，将壳聚糖溶解在质量分数1％的醋酸溶液中，升温至35℃，加入纤维素酶，待酶解溶液粘度降至60％后，用6000截留分子量的透析膜进行透析，透析液浓缩、喷雾干燥，得到壳聚糖粉末，其中纤维素酶的用量为壳聚糖质量的5％；
[0038]
步骤s2，向三口烧瓶中加入0.5g壳聚糖粉末、22ml二氯甲烷，搅拌溶解后，加入0.32ml三乙胺，降温至0℃，缓慢滴加0.2ml氯乙酰氯，常温下搅拌7h，tlc检测反应完全后，浓缩，用二氯甲烷溶解，蒸馏水洗涤3次，萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析，得到中间体1；
[0039]
步骤s3，向三口烧瓶中加入0.72g中间体1、42ml四氢呋喃，搅拌溶解后，加入1.8ml三甲胺，常温搅拌50h，浓缩，柱层析，得到阳离子脂质。
[0040]
实施例2
[0041]
制备阳离子脂质：
[0042]
步骤s1，将壳聚糖溶解在质量分数1％的醋酸溶液中，升温至38℃，加入壳聚糖酶，待酶解溶液粘度降至60％后，用6000截留分子量的透析膜进行透析，透析液浓缩、喷雾干燥，得到壳聚糖粉末，其中壳聚糖酶的用量为壳聚糖质量的5％；
[0043]
步骤s2，向三口烧瓶中加入0.52g壳聚糖粉末、24ml二氯甲烷，搅拌溶解后，加入0.33ml三乙胺，降温至0℃，缓慢滴加0.21ml氯乙酰氯，常温下搅拌7h，tlc检测反应完全后，浓缩，用二氯甲烷溶解，蒸馏水洗涤3次，萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析，得到中间体1；
[0044]
步骤s3，向三口烧瓶中加入0.74g中间体1、43ml四氢呋喃，搅拌溶解后，加入1.9ml三甲胺，常温搅拌51h，浓缩，柱层析，得到阳离子脂质。
[0045]
实施例3
[0046]
制备阳离子脂质：
[0047]
步骤s1，将壳聚糖溶解在质量分数1％的醋酸溶液中，升温至42℃，加入糖苷酶，待酶解溶液粘度降至60％后，用6000截留分子量的透析膜进行透析，透析液浓缩、喷雾干燥，得到壳聚糖粉末，其中糖苷酶的用量为壳聚糖质量的5％；
[0048]
步骤s2，向三口烧瓶中加入0.55g壳聚糖粉末、25ml二氯甲烷，搅拌溶解后，加入0.35ml三乙胺，降温至0℃，缓慢滴加0.22ml氯乙酰氯，常温下搅拌8h，tlc检测反应完全后，
浓缩，用二氯甲烷溶解，蒸馏水洗涤4次，萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析，得到中间体1；
[0049]
步骤s3，向三口烧瓶中加入0.75g中间体1、45ml四氢呋喃，搅拌溶解后，加入2ml三甲胺，常温搅拌52h，浓缩，柱层析，得到阳离子脂质。
[0050]
实施例4
[0051]
一种脂质体核酸疫苗佐剂，包括原料有辅助脂质、阳离子脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质；
[0052]
该脂质体核酸疫苗佐剂由如下步骤制得：
[0053]
步骤a1，将1mol胆固醇、1mol实施例1制备的阳离子脂质、0.01mol1，2
‑
十八酰基
‑
sn
‑
甘油
‑
聚羧基三甲胺乙内酯溶于二氯甲烷中，得到混合液a；
[0054]
步骤a2，将混合液a采用减压旋蒸法除去有机溶剂，得到油膜；
[0055]
步骤a3，将油膜加入超纯水中，超声分散，得到脂质体悬液；
[0056]
步骤a4，将脂质体悬液加到高压均质机中，在压力50mpa下，过压均质15次，得到脂质体核酸疫苗佐剂。
[0057]
实施例5
[0058]
一种脂质体核酸疫苗佐剂，包括原料有辅助脂质、阳离子脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质；
[0059]
该脂质体核酸疫苗佐剂由如下步骤制得：
[0060]
步骤a1，将1.58mol 1，2
‑
油酰基磷脂酰乙醇胺、1.58mol实施例2制备的阳离子脂质、0.0474mol胆固醇
‑
聚羧基三甲胺乙内酯溶于三氯甲烷中，得到混合液a；
[0061]
步骤a2，将混合液a采用减压旋蒸法除去有机溶剂，得到油膜；
[0062]
步骤a3，将油膜加入磷酸盐缓冲液中，超声分散，得到脂质体悬液；
[0063]
步骤a4，将脂质体悬液加到高压均质机中，在压力150mpa下，过压均质8次，得到脂质体核酸疫苗佐剂。
[0064]
实施例6
[0065]
一种脂质体核酸疫苗佐剂，包括原料有辅助脂质、阳离子脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质；
[0066]
该脂质体核酸疫苗佐剂由如下步骤制得：
[0067]
步骤a1，将2.4mol二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、2.4mol实施例3制备的阳离子脂质、0.48mol二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚羧基三甲胺乙内酯溶于二氯甲烷中，得到混合液a；
[0068]
步骤a2，将混合液a采用减压旋蒸法除去有机溶剂，得到油膜；
[0069]
步骤a3，将油膜加入磷酸盐缓冲液中，超声分散，得到脂质体悬液；
[0070]
步骤a4，将脂质体悬液加到高压均质机中，在压力240mpa下，过压均质3次，得到脂质体核酸疫苗佐剂。
[0071]
实施例7
[0072]
考察制备得到的脂质体核酸疫苗佐剂对核酸的复合能力：
[0073]
取3nm的dna分别与9nm的上述佐剂进行复合，复合条件为：室温静置30min，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验考察其复合核酸的能力，电泳实验条件为电压110v，电泳时间30min，电泳结束后，在254nm的紫外灯下进行观察。
[0074]
观察结果为实施例4
‑
6制备的脂质体核酸疫苗佐剂均具有很强的核酸复合能力，可以负载大量的核酸抗原，增加进入免疫细胞的有效抗原量。
[0075]
实施例8
[0076]
体外考察脂质体核酸疫苗的转染效率：
[0077]
选用pgl4.51荧光素酶报告基因作为核酸模型，细胞膜表面有甘露糖受体的raw264.7细胞株为细胞模型进行体外转染水平的考察。转染前一天将raw264.7细胞按照5
×
104个细胞/孔的密度接种于24孔板中，待其生长至汇合度为80％以上时，将不同n/p比例的样品(含1μg pgl4.51)与opti
‑
mem(或dmem)混合定容至500μl加入到各孔中，5％co2，37℃条件下，孵育培养4h后换成全培养基继续培养48h。转染结束后，每孔加入100μl的glolysis缓冲液室温孵育5min，让细胞裂解，然后分两部分检测：(a)将50μl裂解液转移至化学发光仪的平板，再加入50μl的试剂，室温静置5min后，在荧光发光计中读数；(b)利用bca蛋白浓度测定试剂盒中的操作检测上述细胞裂解液中所含的蛋白量。上述两部分检测，均以自然生长的细胞组为空白对照，以lipofectamine2000为阳性对照。
[0078]
结果表明：商售试剂lipofectamine2000(lipo2k)的转染效率为0.82
×
104rlu/mg protein，实施例4
‑
6制备的脂质体核酸疫苗佐剂的转染效率分别为1.73
×
104rlu/mg protein、1.85
×
104rlu/mg protein、1.89
×
104rlu/mg protein，说明本发明所制备的脂质体核酸疫苗剂型具有很好的转染效果，能够显著增加核酸dna的蛋白表达效率，增强免疫应答作用效果。
[0079]
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0080]
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。