一种检测氮胁迫下雨生红球藻中β-胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法与流程

一种检测氮胁迫下雨生红球藻中
β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法
技术领域
1.本发明涉及太赫兹波段的远红外光谱的技术领域，特别涉及一种检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法。


背景技术：

2.雨生红球藻(haematococcus pluvialis)是绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属的一种淡水单细胞绿藻，自然界中天然虾青素含量最高的生物。该细胞在不利环境下，如缺氮、高光照等环境，能够迅速积累酮类胡萝卜素虾青素(3，3
‑
二羟基
‑
β，β
‑
胡萝卜素
‑
4，4
‑
二酮)。天然虾青素具有极强的抗氧化，能通过消除活性氧来保护微藻细胞免受光氧化损伤。几乎所有的类胡萝卜素都具有来自共轭双键的抗氧化特性，但天然虾青素的抗氧化活性却优于其他类胡萝卜素。目前天然虾青素已被美国、中国、日本和一些欧洲国家的监管机构批准用于水产养殖饲料，也被批准用于膳食补充剂、化妆品成分等用途。比如，在水产养殖业中虾青素作为饲料添加剂不仅可以增加水生动物的颜色，还可以增加鱼类卵子的质量；在化妆品中添加虾青素还可以有效地延缓皮肤衰老；在临床医药上虾青素能够有效地促进癌细胞凋亡，抑制心血管疾病引发的炎症，其对于由糖尿病引起的眼病也有很好的预防作用。人工虾青素相较于天然虾青素在结构、功能、应用以及安全性等方面存在明显的不足，天然虾青素的生产倾向于从生物来源中提取。因此，作为天然虾青素含量最高的生物，雨生红球藻用来提取虾青素已经成为国内外虾青素研究的热点。
3.雨生红球藻积累虾青素的过程中，除了绿色有鞭毛的细胞转变成红色的大包囊等细胞形态的变化，大量代谢成分也会发生改变。如图 1所示，雨生红球藻合成虾青素的代谢过程中会涉及许多物质成分合成和分解，比如β
‑
胡萝卜素、叶绿素、脂类、蛋白质、淀粉等。其中，淀粉是植物碳水化合物储备的主要形式，叶绿素作为微藻光合作用的主要参与者，具有传递和转换光能的能力，其含量变化可以直接反应微藻的光合效率、生理活动。β
‑
胡萝卜素作为合成虾青素的前身，也与雨生红球藻中虾青素合成息息相关。因此，对雨生红球藻积累虾青素过程中代谢成分的研究，如β
‑
胡萝卜素和淀粉等，这将为天然虾青素合成机制的掌控以及工业大规模生产有重要意义。
4.远红外光有较强的渗透力和辐射力，具有显著的温控效应和共振效应，它易被物体吸收并转化为物体的内能。远红外光被人体吸收后，可使体内水分子产生共振，使水分子活化，增强其分子间的结合力，从而活化蛋白质等生物大分子，使生物体细胞处于最高振动能级。
5.太赫兹波是对一个特定波段的电磁福射的统称，其频率范围在 0.1
‑
10hz，太赫兹波具有瞬时性、相干性、低能型、透视性以及水吸收特性。通常生物分子内化学键的振动吸收频率主要在红外波段，但对于分子间的弱相互作用，如氨键、分子的旋转和晶体的声子振动等则对应于太赫兹波段，使得太赫兹技术可用于研究生物分子的结构、构型等问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法，解决了目前通过物理和化学方法预处理，具有破坏性，同时解决了物理和化学方法难以实现多种代谢产物的同步实时监测。为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，提供了一种检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑ꢀ
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法，包括以下步骤：
7.s1、利用傅里叶红外光谱仪获得雨生红球藻在胁迫环境下的太赫兹以及远红外波段谱图；
8.s2、利用傅里叶红外光谱仪获得β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉标准品的光谱，并对比步骤s1获取雨生红球藻在胁迫环境下的光谱，找到两种标准品与雨生红球藻在胁迫的环境下对应的吸收峰频率；
9.s3、通过多轮采集氮胁迫环境下(0、2、4、6、8、10、12天) 雨生红球藻体内不同物质含量变化信息，制备多个标准样品本；
10.s4、将步骤s3中的标准样品分别检测氮胁迫下雨生红球藻的光谱图与检测氮胁迫下雨生红球藻的代谢产物β
‑
胡萝卜素、虾青素和淀粉的光谱图；
11.s5、建立了基于特征峰位β
‑
胡萝卜素17.32thz处、虾青素 8.69thz处、淀粉16.22thz处吸光度值与对应物质成分间的相关模型，同时结合偏最小二乘法建立了基于特征峰区间吸光度值的代谢产物预测模型。
12.优选的，所述步骤s2中在对β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉标准品检测时，称取标准品虾青素15mg、淀粉20mg、β
‑
胡萝卜素15mg，压片采用4.5t进行2分钟压片。
13.优选的，所述步骤s1中傅里叶红外光谱检测过程中，使用光源为高压弧汞灯的远红外照射，背景和扫描样品次数均为64次，分辨率为4cm
‑1，样品扫描波数范围从30cm
‑1到680cm
‑1。
14.优选的，所述步骤s2中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉对应雨生红球藻吸收峰频率17.32thz,8.69thz,和16.22thz。
15.优选的，对获得的光谱数据还包括：处理过程中将取得的光谱除去对应厚度，然后进行平滑、去基线baseline以及二阶求导处理，这种处理可以校正基线波动并提高信噪比。
16.优选的，所述步骤s4中采用傅里叶红外光谱仪对雨生红球藻代谢产物标准品进行测量，系统的光谱范围30cm
‑
1～4000cm
‑
1。因此太赫兹/远红外光谱区域有效覆盖30～680cm
‑
1，信噪比(snr)优于10000：1。
17.优选的，所述步骤s5中使用特征峰位代谢产物得到的预测模型精度为0.938，0.985，0.924；使用偏最小二乘法进行预测模型得到的特征峰区间的吸光度值与代谢产物β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的预测模型，模型精度分别为0.991，0.995，0.998。
18.本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明实现了基于使用太赫兹波段的远红外光谱指纹技术检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法，我们发现传统的检测方法需要进行物理或化学方法预处理，具有破坏性，同时难以实现多种代谢产物的同步实时监测，使用太赫兹技术检测方法就可以实现多种代谢产物的同时检测。从拿到样品直到光谱采出配合软件分析差不多20分钟就可以得到雨生红球藻代谢产物含量的数据，简化了繁琐的程序。
附图说明
19.图1为根据本发明的检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法为氮胁迫下不同时间雨生红球藻远红外太赫兹波段光谱图；
20.图2为根据本发明的检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法为β
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胡萝卜素对比雨生红球藻远红外太赫兹波段光谱图；
21.图3为根据本发明的检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法为虾青素对比雨生红球藻远红外太赫兹波段光谱图；
22.图4为根据本发明的检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法为淀粉对比雨生红球藻远红外太赫兹波段光谱图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明提供的检测氮胁迫下雨生红球藻的太赫兹谱图以及氮胁迫下雨生红球藻中代谢产物标准品β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法采用布鲁克vertex 70v傅里叶红外光谱仪，室温保持在20摄氏度的外界条件。取氮胁迫下雨生红球藻烘干后的均匀半透明藻膜,以及氮胁迫下雨生红球藻代谢产物标准品的圆形样本，进行测量。红外光谱仪采用高压弧汞灯为光源的远红外波段，分辨率为4cm
‑1，波数选择范围从30cm
‑1到680cm
‑1，选用64次采集次数，多次采集并使用 matlab进行去趋势和平滑处理，采集光谱前用空液体池取背景参考。同时，用分析天平称量虾青素15mg、淀粉20mg、β
‑
胡萝卜素15mg 放入红外压片磨具中，使用4.5t压力进行2mins压片，取片后，采用空气为背景去噪，同上述使用红外光谱仪参数为依据进行对标准品，虾青素，淀粉，β
‑
胡萝卜素的光谱采集。由于本实验采用的红外光谱仪为抽真空光路，用空光路采集背景单光束光谱，这时扣除的背景单光束光谱主要是扣除光路仪器各种因素的影响。得到雨生红球藻光谱，β
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胡萝卜素光谱与雨生红球藻光谱后对比得到光谱频率为 17.32thz，虾青素与余生红球藻对应光谱频率为16.22thz，淀粉与雨生红球藻对应光谱频率为8.69thz。
25.参照图1
‑
4，一种检测氮胁迫下雨生红球藻中β
‑
胡萝卜素、虾青素、淀粉的方法，包括以下步骤：s1、利用傅里叶红外光谱仪获得雨生红球藻在胁迫环境下的太赫兹以及远红外波段谱图；
26.s2、利用傅里叶红外光谱仪获得β
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胡萝卜素、虾青素、淀粉标准品的光谱，并对比步骤s1获取雨生红球藻在胁迫环境下的光谱，找到两种标准品与雨生红球藻在胁迫的环境下对应的吸收峰频率；
27.s3、通过多轮采集氮胁迫环境下(0、2、4、6、8、10、12天) 雨生红球藻体内不同物质含量变化信息，制备多个标准样品本；
28.s4、将步骤s3中的标准样品分别检测氮胁迫下雨生红球藻的光谱图与检测氮胁迫下雨生红球藻的代谢产物β
‑
胡萝卜素、虾青素和淀粉的光谱图；
29.s5、建立了基于特征峰位β
‑
胡萝卜素17.32thz处、虾青素 8.69thz处、淀粉
16.22thz处吸光度值与对应物质成分间的相关模型，同时结合偏最小二乘法建立了基于特征峰区间吸光度值的代谢产物预测模型。
30.进一步的，所述步骤s2中在对β
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胡萝卜素、虾青素、淀粉标准品检测时，称取标准品虾青素15mg、淀粉20mg、β
‑
胡萝卜素15mg，压片采用4.5t进行2分钟压片。
31.进一步的，所述步骤s1中傅里叶红外光谱检测过程中，使用光源为高压弧汞灯的远红外照射，背景和扫描样品次数均为64次，分辨率为4cm
‑1，样品扫描波数范围从30cm
‑1到680cm
‑1。
32.进一步的，所述步骤s2中β
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胡萝卜素、虾青素、淀粉对应雨生红球藻吸收峰频率17.32thz,8.69thz,和16.22thz。
33.进一步的，对获得的光谱数据还包括：处理过程中将取得的光谱除去对应厚度，然后进行平滑、去基线baseline以及二阶求导处理，这种处理可以校正基线波动并提高信噪比。
34.进一步的于，所述步骤s4中采用傅里叶红外光谱仪对雨生红球藻代谢产物标准品进行测量，系统的光谱范围30cm
‑
1～4000cm
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1。因此太赫兹/远红外光谱区域有效覆盖30～680cm
‑
1，信噪比(snr) 优于10000：1。
35.进一步的，所述步骤s5中使用特征峰位代谢产物得到的预测模型精度为0.938，0.985，0.924；使用偏最小二乘法进行预测模型得到的特征峰区间的吸光度值与代谢产物β
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胡萝卜素、虾青素、淀粉的预测模型，模型精度分别为0.991，0.995，0.998。
36.实施例1
37.(1)太赫兹样品制备
38.纯品样品制备：称取标准虾青素15mg、淀粉20mg、β
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胡萝卜素15mg，分别置于直径为13mm的模具中进行压制。每个标准品都准备了两个圆形样品，用于太赫兹标准品光谱测试。太赫兹样品的光谱采集容易受水分的影响，因此需要把一定浓度下的微藻样品烘干成薄膜样品，以消除水分的影响。
39.微藻样品制备：将藻液反复离心并经超纯水洗涤后得到的100mg 藻泥，加蒸馏水至1ml。将每个1ml藻液样品放入直径为20mm的光滑聚苯乙烯模具中进行烘干，设置烘干箱30～40℃烘3小时，最后制成均匀半透的藻膜，同时用千分尺测量每一份藻膜样品的厚度。薄膜的厚度范围为40
±
5μm，这个范围可以获得更好的光谱。
40.(2)太赫兹光谱采集
41.采用傅里叶变换光谱仪对藻膜以及标准样品进行太赫兹测量，测得3.0～20.0thz范围的吸收谱。雨生红球藻进行胁迫实验，连续胁迫12天，每隔一天进行数据采集，进行三轮实验。每轮每个时间点制备4个藻膜样品，每个样品采集不同位置处的12条thz吸收谱取平均作为该样本的数据，即每个时间点获取4条样本数据。采集第 0、2、4、6、8、10、12天的样本，三轮一共获得共84个样本。
42.得到数据后，由于各种因素的影响，需要对数据进行预处理才能得到最终可以使用的数据，首先在处理过程中将取得的光谱除去对应厚度，然后进行平滑、去基线baseline以及二阶求导处理，这种处理可以校正基线波动并提高信噪比。
43.处理后的光谱信息，我们用origin软件去基线做了特征峰的代谢产物预测模型和采用偏小二乘法建立特征峰区间的代谢产物预测模型。
44.关于特征峰的代谢产物的预测模型：通过对雨生红球藻吸收谱的分析，发现虾青素、淀粉和β
‑
胡萝卜素分别在8.69thz、16.22thz、 17.32thz具有较好的独立性，其他成分影响较小。根据比尔定律，一般条件下，藻谱对应峰位的吸光度值与物质浓度成线性增加的关系。因此建立这三个峰值吸光度与传统化学方法测得的成分含量间的相关模型。雨生红球藻中虾青素模型的预测结果如图4所示，β
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胡萝卜素的预测结果如图4所示，淀粉的预测结果如图4所示。其中β
ꢀ‑
胡萝卜素预测模型的相关系数rpre为0.938，rmse为0.043；虾青素的预测相关系数rpre为0.985，rmse为0.042；淀粉模型的相关系数rpre为0.924，rmse为0.045。结果显示，基于特征峰值吸光度值对三种代谢物的预测相关系数均大于0.92，说明上述峰位β
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胡萝卜素(17.32thz)、虾青素(8.69thz)和淀粉(16.22thz) 的吸光度值与成分含量有较好的相关性。
45.关于采用偏小二乘法建立特征峰区间的代谢产物预测模型：为了进一步提高检测精度，我们建立了区间偏最小二乘法回归预测模型。以线性回归模型中确定的三个特征峰为中心点，以每个中心点左右最临近的极小值点为边界。选出β
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胡萝卜素的区间为17.11～17.57thz，虾青素的区间为8.49～8.90thz，淀粉的区间为16.07～16.47thz。根据谱区间建立的pls模型及预测结果如表4所示，对三种物质模型的相关系数rpre均大于0.99，rmsep值分别为0.061、0.031和 0.040。其中β
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胡萝卜素、虾青素和淀粉模型的交叉验证显示出较高的统计准确性。rpd值均大于4，表明模型的预测准确性较高。
46.使用特征峰位代谢产物预测模型得到的模型精度为0.938，0.985，0.924；使用偏最小二乘法进行预测模型得到的特征峰区间的吸光度值与代谢产物β
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胡萝卜素、虾青素、淀粉的预测模型，模型精度分别为0.991，0.995，0.998。
47.这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的，对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。