一种布鲁氏菌a19株特异性多肽、elisa检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种布鲁氏菌a19株特异性多肽、elisa检测试剂盒及应用。
背景技术：
2.布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜兽共患传染病，动物布病防控的主要策略是检疫与净化。目前，使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌a19疫苗株和猪种布鲁氏菌s2疫苗株，以前还曾使用过羊种m5
‑
90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。a19疫苗株的毒力较弱，免疫效果好，目前在牛的免疫中广泛使用，是目前应用最广的疫苗。但其会干扰常规试剂盒的抗体诊断，不能使用现有的方法对自然感染和a19疫苗免疫动物进行抗体的鉴别，这样在免疫养殖场就不能采用抗体检测的方法进行野毒感染动物的鉴定和淘汰，使得防控布病最有效的免疫和检测相结合的方法不能有效进行。鉴于此，亟需一种特异性检测a19疫苗的免疫抗体的方法以解决目前存在的技术问题。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽、elisa检测试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，以布鲁氏菌a19株特异性多肽为抗原构建的elisa检测方法可以特异性地检测a19疫苗的免疫抗体，即可评价a19疫苗的免疫效果，又可结合其它商用布鲁氏菌抗体试剂盒在免疫动物群体中鉴别出布鲁氏菌野毒感染动物，为布病净化提供了有力的支撑。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原在制备布鲁氏菌a19抗体检测试剂盒中的应用，所述特异性多肽的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6.本发明还提供一种elisa检测试剂盒，包括中所述的特异性多肽。
7.优选的是，还包括：包被中所述的特异性多肽的酶标板、酶标抗体、封闭液、洗涤液、显色液、阴性对照和阳性对照。
8.优选的是，所述酶标抗体为hrp标记的兔抗牛igg抗体。
9.本发明还提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原构建的布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：
10.(1)以权利要求1中所述的特异性多肽包被酶标板，包被后用bsa封闭；
11.(2)待阴性血清和阳性血清稀释后与包被的特异性多肽进行孵育；
12.(3)洗涤后，加入hrp标记的兔抗牛二抗进行孵育；
13.(4)洗涤后，加入显色液显色反应，然后加入10％硫酸溶液终止反应，在450nm下测定od值，以判定布鲁氏菌a19抗体的水平。
14.优选的是，所述特异性多肽浓度为8
‑
15μg/ml。
15.优选的是，步骤(1)中，包被条件为：4℃包被过夜；封闭条件为：0.5％bsa封闭30
‑
60min。
16.优选的是，步骤(2)和步骤(3)中孵育时间均为20
‑
40min。
17.优选的是，步骤(4)中，用tmb溶液避光显色10
‑
20min。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.(1)可使用本发明在免疫猪群中批量检测野毒感染动物并将其淘汰，便于将免疫和淘汰相结合，更好地进行布病的防控。
20.(2)可使用本发明对a19免疫动物进行免疫效果的检测。
21.(3)本发明发现的多肽特异性好，可由生物公司高纯度合成，有利于保证检测结果的一致性和重复性。
22.(4)以往对布鲁氏菌野毒的鉴定，需要进行细菌培养或扩增后测序，耗时较长，并且对实验条件要求很高，本发明可以简单快速的对布鲁氏菌野毒进行鉴定。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.实施例1一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原构建的检测布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法
29.从ncbi上下载布鲁氏菌a19株和2308株的核酸和蛋白序列差异，发现特异性的多肽序列(seq id no：1)：laglgrgahh lrarrlrrrg qwcvdrlsar sglrgdawrs llrawrsafd dqrshlqqsr rsprtwqygl。
30.由生物公司合成上述的特异性多肽的氨基酸序列，采用检测布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法的步骤包被特异性多肽抗原，具体步骤如下：
31.(1)以seq id no：1所示序列的特异性多肽包被酶标板，于37℃恒温箱内放置1h进行包被过夜后，含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbst于37℃封闭30min；
32.(2)待阴性血清和阳性血清稀释2000倍后与包被的特异性多肽于37℃孵育30min；
33.(3)洗涤6次后，加入5000倍稀释的hrp标记的兔抗牛二抗于37℃孵育30min；
34.(4)洗涤6次后，加入tmb显色液显色反应，然后加入10％硫酸溶液终止反应，用酶标仪在450nm下测定od值，结果的判定阈值为0.264。当od值大于0.264时判定为阳性，否则为阴性。即：od
450
大于0.264的为阳性，表明检测动物发生了a19的感染，该动物免疫合格。反之，则表明检测动物为野毒感染，可以进行淘汰。
35.检测沈阳农业大学动物科学与医学学院实验室制备并保存的16野毒感染的血清样品和15份a19疫苗抗体免疫的血清样品，其利用上述方法检测的结果如表1所示：
36.表1不同血清样品检测结果
37.血清野毒感染及阴性(16份)免疫(15份)p值显著性x
±
sd0.2357
±
0.11170.3656
±
0.062210.005差异显著
38.从表1的结果可以看出，本发明公开的特异性多肽为抗原建立的elisa检测方法，可以用以检测布鲁氏菌a19抗体，结合其它抗体试剂盒实现野毒和疫苗抗体的鉴别。
39.实施例2免疫养殖场a19免疫效果的检测
40.(1)在进行了a19疫苗免疫的养殖场(辽宁辉山乳业集团有限公司下属奶牛场)，采集了50份动物血液，离心分离血清。
41.(2)在96孔微量板中加入100μl含10ug/ml多肽的碳酸盐缓冲溶液，于37℃恒温箱内放置1h进行包被。然后加入200μl含1％牛血清白蛋白的pbst于37℃封闭30min。随后依次分别加入2000倍稀释的待检血清或标准阴阳性血清，5000倍稀释的标记有辣根过氧化物酶的兔抗牛igg抗体各100μl于37℃孵育30min。每步孵育后用pbst洗板6次，最后100μl tmb溶液避光反应至溶液出现明显蓝色。加入50μl 10％硫酸溶液终止反应后，用酶标仪读取od450值。od
450
大于0.264的为阳性，表明免疫动物产生了a19的抗体，该动物免疫合格。结果有46份血清的od450大于0.264，免疫合格，检测样品的抗体阳性率达到92％(46/50)，免疫效果良好。
42.实例3免疫养殖场布鲁氏菌野毒感染动物的检测
43.(1)在进行了a19疫苗免疫的奶牛场，采集了104份动物的血液，离心分离血清。
44.(2)对这些血清样品采用牛布鲁氏菌抗体elisa试剂盒(bionote，korea)进行了抗体检测，结果97头牛抗体阳性。
45.(3)对这些阳性的血清样品采用本试剂盒进行检测。在96孔微量板中加入100μl含10ug/ml多肽的碳酸盐缓冲溶液，于37℃恒温箱内放置1h进行包被。然后加入200μl含1％牛血清白蛋白的pbst于37℃封闭30min。随后依次分别加入含2000倍稀释的标准阴阳性血清，5000倍稀释的标记有辣根过氧化物酶的兔抗牛igg抗体各100μl于37℃孵育30min。每步孵育后用pbst洗板6次，最后100μl tmb溶液避光反应至溶液出现明显蓝色。加入50μl 10％硫酸溶液终止反应后，用酶标仪读取od
450
值。od
450
大于0.264的为阳性，表明检测动物产生了布鲁氏菌a19的抗体。结果在97份布病抗体阳性的血清中，94份在本试剂盒的检测中为阳性，表明在本试剂盒的检测中为阴性的3份血清有可能是野毒感染，可以进行淘汰。
46.以上所述的实施例仅对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种布鲁氏菌a19株特异性多肽、elisa检测试剂盒及应用。
背景技术：
2.布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜兽共患传染病，动物布病防控的主要策略是检疫与净化。目前，使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌a19疫苗株和猪种布鲁氏菌s2疫苗株，以前还曾使用过羊种m5
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90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。a19疫苗株的毒力较弱，免疫效果好，目前在牛的免疫中广泛使用，是目前应用最广的疫苗。但其会干扰常规试剂盒的抗体诊断，不能使用现有的方法对自然感染和a19疫苗免疫动物进行抗体的鉴别，这样在免疫养殖场就不能采用抗体检测的方法进行野毒感染动物的鉴定和淘汰，使得防控布病最有效的免疫和检测相结合的方法不能有效进行。鉴于此，亟需一种特异性检测a19疫苗的免疫抗体的方法以解决目前存在的技术问题。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽、elisa检测试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，以布鲁氏菌a19株特异性多肽为抗原构建的elisa检测方法可以特异性地检测a19疫苗的免疫抗体，即可评价a19疫苗的免疫效果，又可结合其它商用布鲁氏菌抗体试剂盒在免疫动物群体中鉴别出布鲁氏菌野毒感染动物，为布病净化提供了有力的支撑。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原在制备布鲁氏菌a19抗体检测试剂盒中的应用，所述特异性多肽的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6.本发明还提供一种elisa检测试剂盒，包括中所述的特异性多肽。
7.优选的是，还包括：包被中所述的特异性多肽的酶标板、酶标抗体、封闭液、洗涤液、显色液、阴性对照和阳性对照。
8.优选的是，所述酶标抗体为hrp标记的兔抗牛igg抗体。
9.本发明还提供一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原构建的布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：
10.(1)以权利要求1中所述的特异性多肽包被酶标板，包被后用bsa封闭；
11.(2)待阴性血清和阳性血清稀释后与包被的特异性多肽进行孵育；
12.(3)洗涤后，加入hrp标记的兔抗牛二抗进行孵育；
13.(4)洗涤后，加入显色液显色反应，然后加入10％硫酸溶液终止反应，在450nm下测定od值，以判定布鲁氏菌a19抗体的水平。
14.优选的是，所述特异性多肽浓度为8
‑
15μg/ml。
15.优选的是，步骤(1)中，包被条件为：4℃包被过夜；封闭条件为：0.5％bsa封闭30
‑
60min。
16.优选的是，步骤(2)和步骤(3)中孵育时间均为20
‑
40min。
17.优选的是，步骤(4)中，用tmb溶液避光显色10
‑
20min。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.(1)可使用本发明在免疫猪群中批量检测野毒感染动物并将其淘汰，便于将免疫和淘汰相结合，更好地进行布病的防控。
20.(2)可使用本发明对a19免疫动物进行免疫效果的检测。
21.(3)本发明发现的多肽特异性好，可由生物公司高纯度合成，有利于保证检测结果的一致性和重复性。
22.(4)以往对布鲁氏菌野毒的鉴定，需要进行细菌培养或扩增后测序，耗时较长，并且对实验条件要求很高，本发明可以简单快速的对布鲁氏菌野毒进行鉴定。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.实施例1一种布鲁氏菌a19株特异性多肽作为抗原构建的检测布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法
29.从ncbi上下载布鲁氏菌a19株和2308株的核酸和蛋白序列差异，发现特异性的多肽序列(seq id no：1)：laglgrgahh lrarrlrrrg qwcvdrlsar sglrgdawrs llrawrsafd dqrshlqqsr rsprtwqygl。
30.由生物公司合成上述的特异性多肽的氨基酸序列，采用检测布鲁氏菌a19抗体的elisa检测方法的步骤包被特异性多肽抗原，具体步骤如下：
31.(1)以seq id no：1所示序列的特异性多肽包被酶标板，于37℃恒温箱内放置1h进行包被过夜后，含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbst于37℃封闭30min；
32.(2)待阴性血清和阳性血清稀释2000倍后与包被的特异性多肽于37℃孵育30min；
33.(3)洗涤6次后，加入5000倍稀释的hrp标记的兔抗牛二抗于37℃孵育30min；
34.(4)洗涤6次后，加入tmb显色液显色反应，然后加入10％硫酸溶液终止反应，用酶标仪在450nm下测定od值，结果的判定阈值为0.264。当od值大于0.264时判定为阳性，否则为阴性。即：od
450
大于0.264的为阳性，表明检测动物发生了a19的感染，该动物免疫合格。反之，则表明检测动物为野毒感染，可以进行淘汰。
35.检测沈阳农业大学动物科学与医学学院实验室制备并保存的16野毒感染的血清样品和15份a19疫苗抗体免疫的血清样品，其利用上述方法检测的结果如表1所示：
36.表1不同血清样品检测结果
37.血清野毒感染及阴性(16份)免疫(15份)p值显著性x
±
sd0.2357
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0.11170.3656
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0.062210.005差异显著
38.从表1的结果可以看出，本发明公开的特异性多肽为抗原建立的elisa检测方法，可以用以检测布鲁氏菌a19抗体，结合其它抗体试剂盒实现野毒和疫苗抗体的鉴别。
39.实施例2免疫养殖场a19免疫效果的检测
40.(1)在进行了a19疫苗免疫的养殖场(辽宁辉山乳业集团有限公司下属奶牛场)，采集了50份动物血液，离心分离血清。
41.(2)在96孔微量板中加入100μl含10ug/ml多肽的碳酸盐缓冲溶液，于37℃恒温箱内放置1h进行包被。然后加入200μl含1％牛血清白蛋白的pbst于37℃封闭30min。随后依次分别加入2000倍稀释的待检血清或标准阴阳性血清，5000倍稀释的标记有辣根过氧化物酶的兔抗牛igg抗体各100μl于37℃孵育30min。每步孵育后用pbst洗板6次，最后100μl tmb溶液避光反应至溶液出现明显蓝色。加入50μl 10％硫酸溶液终止反应后，用酶标仪读取od450值。od
450
大于0.264的为阳性，表明免疫动物产生了a19的抗体，该动物免疫合格。结果有46份血清的od450大于0.264，免疫合格，检测样品的抗体阳性率达到92％(46/50)，免疫效果良好。
42.实例3免疫养殖场布鲁氏菌野毒感染动物的检测
43.(1)在进行了a19疫苗免疫的奶牛场，采集了104份动物的血液，离心分离血清。
44.(2)对这些血清样品采用牛布鲁氏菌抗体elisa试剂盒(bionote，korea)进行了抗体检测，结果97头牛抗体阳性。
45.(3)对这些阳性的血清样品采用本试剂盒进行检测。在96孔微量板中加入100μl含10ug/ml多肽的碳酸盐缓冲溶液，于37℃恒温箱内放置1h进行包被。然后加入200μl含1％牛血清白蛋白的pbst于37℃封闭30min。随后依次分别加入含2000倍稀释的标准阴阳性血清，5000倍稀释的标记有辣根过氧化物酶的兔抗牛igg抗体各100μl于37℃孵育30min。每步孵育后用pbst洗板6次，最后100μl tmb溶液避光反应至溶液出现明显蓝色。加入50μl 10％硫酸溶液终止反应后，用酶标仪读取od
450
值。od
450
大于0.264的为阳性，表明检测动物产生了布鲁氏菌a19的抗体。结果在97份布病抗体阳性的血清中，94份在本试剂盒的检测中为阳性，表明在本试剂盒的检测中为阴性的3份血清有可能是野毒感染，可以进行淘汰。
46.以上所述的实施例仅对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
