一种酱油渣来源的发酵大豆膳食纤维的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于酱油渣资源化利用领域和保健食品领域，尤其涉及一种酱油渣来源的发酵大豆膳食纤维及其制备方法和应用。


背景技术：

2.酱油渣是酱醪抽油或压榨后剩下的深棕色残渣，作为酱油加工的主要副产物，每年生产约200万吨(干重)，产量很大。酱油渣中存在丰富的营养成分，酱油发酵时原料中仅有蛋白质、淀粉被部分利用，酱油渣中仍含有粗蛋白、粗脂肪、膳食纤维、亲脂性维生素和黄酮类小分子活性物等营养成分。但未处理的酱油渣盐含量达10％～25％，易引起食盐中毒；且未被发酵利用的油脂中所含的大量不饱和脂肪酸极易在高水、高酸的环境中变质为过氧化脂质，有很强的细胞毒性，无法直接食用。因此对酱油渣的合理开发利用具有重要意义。
3.膳食纤维能够提供多种生理健康功能，如减少餐后血糖，降低胰岛素反应；降低胆固醇水平，预防心脑血管疾病；增加饱腹感，减轻体重。同时膳食纤维能够调节肠道微生物群使其向有益的方向转变，从而调节代谢反应。哺乳动物胃肠道包含500～1000种细菌，这些微生物群的基因约是哺乳动物基因组中基因数的100倍，并可能为哺乳动物增加许多宿主缺乏的生物活性。例如，在肠道中定殖的微生物能够降解各种宿主自身无法消化分解的多糖，并提供各种代谢物，如胆汁酸、胆碱和短链脂肪酸等对宿主健康至关重要的小分子活性物。
4.酱油渣中含丰富的膳食纤维成分，并且是一种经微生物体外发酵的特殊膳食纤维，其物化性质发生了一定的改变，因此对酱油渣中可食用膳食纤维的制备及研究利用具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种以酱油渣为原料经连续相变萃取技术高效环保制备膳食纤维的方法及其研究应用。脱油后的酱油渣原料粉碎、干燥，用中等极性溶剂进行连续相变萃取后，去除其中的风味成分，即得发酵大豆膳食纤维。该膳食纤维含盐量低，膳食纤维含量丰富(约占60％～70％)，且含有大豆蛋白，营养丰富。动物实验研究表明，用该方法制备得到的发酵大豆膳食纤维在一定程度上改变了母猪的调节肠道菌群结构，并促使肠道微生物群产生了更多对机体有益的短链脂肪酸。该提取工艺流程高效、成本低、可重复性和可操作性高，且绿色环保，能够对提取溶剂回收再利用，并能最大程度保护膳食纤维中的活性成分，可实现大规模工业化生产。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一种酱油渣来源的发酵大豆膳食纤维的制备包括以下步骤：
8.1)取经过干燥、脱油处理的脱油酱油渣，粉碎至20目～60目。
9.2)将脱油酱油渣装入萃取釜中，萃取条件为：萃取温度40℃～60℃，萃取压力为0.1mpa～5.0mpa，连续萃取60min～200min，流速100l/h～300l/h，解析温度50℃～95℃，解
析压力
‑
0.1mpa～0.5mpa，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，高压泵将萃取剂压缩为液体，以一定流速流经萃取釜萃取茶油，进入解析釜中，通过加热、减压使萃取剂相变为气体，再通过即时压缩，变为液体流经萃取釜，对物料再次萃取，如此循环多次，所述萃取剂是指50～90％乙醇、乙酸乙酯。
10.3)将萃取釜中残渣取出，置于50℃～60℃烘箱中干燥，使其水分含量≦10％，即为发酵大豆膳食纤维。
11.优选的，步骤2)中所述萃取剂为75％乙醇，萃取条件为：萃取温度60℃，萃取压力为0.5mpa，连续萃取120min，流速100l/h，解析温度75℃，解析压力0.2mpa。
12.优选的，步骤2)所述萃取剂为80％乙醇，萃取条件为：萃取温度50℃，萃取压力为0.5mpa，连续萃取100min，流速120l/h，解析温度70℃，解析压力0.2mpa。
13.优选的，步骤2)所述萃取剂为乙酸乙酯，萃取条件为：萃取温度55℃，萃取压力为0.5mpa，连续萃取110min，流速100l/h，解析温度70℃，解析压力0.5mpa。
14.本发明提供了发酵大豆膳食纤维在调节母猪肠道菌群及其产物短链脂肪酸方面的作用及相关应用。
15.本发明采用的连续相变萃取技术，本发明所采用的连续相变萃取技术是指萃取剂在低于其临界压力和临界温度条件下压缩成液体，流经萃取釜对物料进行萃取后，在解析釜中相变为气体，其中萃取得到的物质落入解析釜中，解析后的气体再经过压缩成液体，再次流经萃取釜，对物料进行反复萃取的过程，可连续多次对物料进行动态、高效萃取。与传统的溶剂、超临界萃取技术及亚临界萃取技术相比，连续相变萃取既具超临界萃取与亚临界萃取的高效、产品无溶剂残留、香气成分保留率高的优点，而且萃取压力和解析压力比超临界低，同时又具有常规溶剂萃取容积大、批处理量大、生产成本低等特点。另外，连续相变萃取还存在萃取时间短，可以实现即时连续萃取的过程，溶剂需求较少，溶剂回收等优势，且整个萃取过程在密闭绝氧、低压的条件下进行，可最大程度保留物料的活性成分。
16.本发明提供了一种发酵大豆膳食纤维，它是由下述方法制备的：脱油酱油渣粉粹、干燥；连续相变溶剂萃取去除风味物质及杂质；物料过滤并干燥即得发酵大豆膳食纤维。以含该发酵大豆膳食纤维的饲料喂食的母猪作为实验组(df)，空白对照组(ck)喂食普通饲料。分别收集两组的母猪粪便样品，通过16srdna测序技术研究母猪肠道菌群结构的变化，并通过gc
‑
ms测定粪便中短链脂肪酸含量，welch’s t
‑
test差异分析结果表明，喂食发酵大豆膳食纤维后母猪肠道菌群中史雷克氏菌属(slackia)的丰度较空白对照组显著增大(p<0.05)；lefse结果发现clostridium iv和δ
‑
变形菌纲(deltaproteobacteri)为实验组中丰度较高的两个差异物种。喂食发酵大豆膳食纤维后，粪便中各短链脂肪酸含量均有不同程度的提高，尤其是丁酸含量显著增多(p<0.05)。结果表明，饲料中添加发酵大豆膳食纤维在一定程度上使母猪的肠道菌群结构发生改变，促进了肠道中产短链脂肪酸的菌群的富集，从而提高了肠道中的短链脂肪酸尤其是丁酸的含量。
附图说明
17.图1out分布venn图
18.图2母猪肠道菌群的alpha指数箱式图
19.图3属水平上采用welch’s t
‑
test进行丰度差异比较的误差线图
20.图4lefse分析图
21.图5所有样本基于out的pca图
具体实施方式
22.下面结合实施例和附图，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式不限于此。
23.实施例1发酵大豆膳食纤维的制备
24.一种高效从酱油渣中得到大豆膳食纤维的分离方法，包括以下步骤：
25.(1)将酱油渣在55℃温度下烘干，使其水分含量≦15％，粉碎至60目，得到酱油渣原料，经连续相变去油。
26.(2)将所得脱油酱油渣放入连续相变萃取装置中，萃取条件为：乙醇浓度80％，萃取温度70℃，萃取时间90min，萃取压力0.5mpa。取出萃取后的酱油渣于55℃温度下烘干，使其水分含量≦15％，得到一种特殊的大豆膳食纤维，即发酵大豆膳食纤维。
27.得到的发酵大豆膳食纤维进行化学成分测定，结果如下表：
28.表1发酵大豆膳食纤维的化学成分
[0029][0030]
实施例2发酵大豆膳食纤维的制备
[0031]
一种高效从酱油渣中得到大豆膳食纤维的分离方法，包括以下步骤：
[0032]
(1)将酱油渣在50℃温度下烘干，使其水分含量≦15％，粉碎至50目，得到酱油渣原料，经连续相变去油。
[0033]
(2)将所得脱油酱油渣放入连续相变萃取装置中，萃取条件为：乙醇浓度70％，萃取温度70℃，萃取时间90min，萃取压力0.5mpa。取出萃取后的酱油渣于55℃温度下烘干，使其水分含量≦15％，得到一种特殊的大豆膳食纤维，即发酵大豆膳食纤维。
[0034]
得到的发酵大豆膳食纤维进行化学成分测定，结果如下表：
[0035]
表2发酵大豆膳食纤维的化学成分
[0036][0037]
实施例3发酵大豆膳食纤维对母猪肠道菌群的调节
[0038]
一、动物分组及饲养
[0039]
选用妊娠期母猪，随机分为对照组(ck)和剂量组(df)，各组3只母猪。剂量组饲喂含5％发酵大豆膳食纤维的饲料，对照组为不含发酵大豆膳食纤维的普通饲料。持续饲喂20d后收集各组母猪粪便，存放于
‑
80℃冰箱中，用于分析母猪肠道菌群及短链脂肪酸含量。
[0040]
二、肠道菌群16s rdna高通量测序分析
[0041]
16s rdna高通量测序分析由上海生工科技有限公司完成，实验具体流程如下：样品中dna的提取及采用琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。pcr扩增：采用细菌v3
‑
v4区通用引物341f
‑
805r，并引入illumina桥式pcr兼容引物，pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。将pcr扩增产物dna纯化回收，在illumina miseq
tm
平台上上机测序。
[0042]
原始测序序列经由在illumina miseq
tm
平台上机检测后得到的原始图像数据文件
经casava碱基识别处理得到。后期数据处理流程为：数据处理与统计：原始序列拼接、质控过滤、去除嵌合体和非特异性扩增序列。out聚类；将处理后的序列根据其距离进行聚类，在97％的相似水平下将其分成otu(operational taxonomic units，操作分类单元)，并制作韦恩图。物种分类及差异分析：对处理后的优质序列进行物种分类，计算各样本在不同分类水平上的序列丰度，绘制物种丰度饼图；分别采用welch’s t
‑
test和lefse筛选两组样本间在各分类水平上的差异物种并做图。alpha多样性和beta多样性分析：alpha多样性用于反映微生物群的丰富度和均一度，通过计算ace、chao、shannon、simpson、coverage等指数来评价；而各样本间的差别采用beta多样性分析进行度量，采用主成分分析(principal component analysis，pca)进行评价。
[0043]
结果如下：
[0044]
1.out分类和alpha多样性分析
[0045]
如图1，用韦恩(venn)图统计两组样品中共有和独有的out数目。ck和df组母猪肠道菌群共有的out数为1491，而ck组和df组中分别独有479个和422个out。喂食发酵大豆膳食纤维和喂食普通饲料的母猪相比，其肠道菌群中有小部分的细菌种类发生了改变，且细菌out数即物种数减少。
[0046]
各样品的alpha多样性指数和组间的alpha指数箱式图分别见表3和图2。df组与ck组相比，chao和ace指数相对较小，而shannon指数较大，simpson指数较小，说明df组的菌群多样性增大，但其丰富度减小。以上两组间数据无显著性差异。
[0047]
表3母猪的肠道菌群alpha多样性指数
[0048][0049][0050]
2.菌群结构分析
[0051]
表4为df和ck组菌群在主要门水平上的相对丰度及差异分析(相对丰度>0.1％)。测序得到的out序列分属细菌域的16个门，其中相对丰度大于0.1％的有10个门：厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)、螺旋体菌门(spirochaetes)、疵微菌门(verrucomicrobia)、放线菌门(actinobacteria)、广古菌门(euryarchaeota)、念珠菌门(candidatus saccharibacteria)、浮霉菌门(planctomycetes)和纤维杆菌门(fibrobacteres)，以及无法确定分类的细菌(unclassified)。两组间各门的相对丰度略有差异，但不存在显著性(p>0.05)。各菌门中firmicutes丰度最高，bacteroidetes次之，为母猪粪便肠道菌群中的优势菌门，二者丰度占总序列的90％左右，但略有浮动。
[0052]
表4 df和ck组菌群在主要门水平上的相对丰度及差异分析(％)(x
±
sd，n＝3)
[0053][0054]
表5选取各组间相对丰度大于1％的各菌属进行相对丰度及差异分析。out序列进行分类后分别属于153个属，df组和ck组各有约41％和35％的序列无法确定分类(unclassified)。两组共有的主要属(相对丰度>1％)有15种，分别为lachnospiracea_incertae_sedis、梭状芽孢杆菌xlva属(clostridium xiva)、链球菌属(streptococcus)、颤杆菌克属(oscillibacter)、巴恩斯氏菌属(barnesiella)、密螺旋体菌属(treponema)、pseudoflavonifractor、大肠杆菌/志贺菌属(escherichia/shigella)、梭状芽孢杆菌属(clostridium sensu stricto)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、subdivision5_genera_incertae_sedis、土孢杆菌属(terrisporobacter)和flavonifractor。另外df组中梭状芽孢杆菌iv属(clostridium iv)、普雷沃氏菌属(prevotella)和粪球菌属(coprococcus)的相对丰度均大于1％，但在ck组中相对丰度小于1％。乳酸杆菌属(lactobacillus)在ck组肠道细菌中相对丰度占1.09％，df组中仅占0.99％。在属水平上，各样本的肠道细菌约有27.86～47.73％的序列无法确定分类，占比最大。其次相对丰度较大的依次为lachnospiracea_incertae_sedis，clostridium xlva和streptococcus，三者均为firmicutes中菌属。clostridium中包含有潜在的益生菌，clostridium xiva、clostridium iv中的部分芽孢杆菌菌株已被报道可减轻炎症及过敏性疾病。
[0055]
表5 df和ck组菌群在主要属水平上的相对丰度及差异分析(％)(x
±
sd，n＝3)
[0056]
[0057][0058]
3.菌群差异分析
[0059]
分别采用welch’s t
‑
test和lefse进行组间物种差异分析。图3为在属水平上两组间进行welch’s t
‑
test丰度差异比较的误差线图。在属水平上，df组slackia丰度显著高于ck组(p<0.05)，但其在df组中的相对丰度仅占0.01％，为actinobacteria中的一个菌属。其中部分菌株如slackia isoflavoniconvertens为人类粪便中分离出的少数具有形成雌马酚特征的菌株，其代谢底物为大豆异黄酮的两种苷元形式——大豆苷元和染料木素，并将其转化为雌马酚和5
‑
羟基雌马酚。图4为lefse分析的进化分支图和柱状图。与ck组相比，df组中丰度较高的物种有：clostridium iv和δ
‑
变形菌纲(deltaproteobacteria)。
[0060]
4.pca主成分分析
[0061]
图5为所有样本基于out的pca图，并选取了能够最大程度反映样品间差异的两个坐标轴(即pc1和pc2)，第一主成分贡献77％，第二主成分贡献为10％，二者共贡献87％。图中黄色代表df组，蓝色代表ck组，各点间的距离代表样本间肠道菌群的结构差异。df组的各样本分布较集中，而ck组的各样本间距较分散。结果表明，将5％母猪饲料替换为发酵大豆膳食纤维后，母猪的肠道菌群结构发生一定程度趋向性的变化。ck组的各样本聚类较分散，可能是喂食普通饲料的个体自身健康状况、年龄等其他因素造成的。
[0062]
三、短链脂肪酸含量测定
[0063]
取500mg粪便于5ml研磨离心管中，加入1.0ml1％磷酸溶液，放入同等体积的1mm研磨珠，在珠磨机中研磨2min。观察研磨彻底后加入1ml乙酸乙酯，用vortex涡旋振荡，使体系充分混匀。离心取上层有机试剂层于
‑
20℃冰箱备用。上机分析前，加入4
‑
甲基戊酸作为内标，用于纠正每次注射样品量间的变化和仪器响应的微小变化。每个样品进行3次独立重复提取实验。
[0064]
气相色谱采用极性毛细管柱db
‑
wax，氦气载气浓度1ml/min，质谱检测器扫描范围在30～250m/z之间，离子源、四极杆和界面温度分别为230℃、150℃和280℃。采用分流模式，设置分流比为50：1，进样量5μl，进样口温度250℃。跑样时柱温起始温度90℃跑3min，然后15℃/min升温至150℃，150℃下维持3min，最后2℃/min升温至160℃并在此温度下维持2min。总运行时间为17min。
[0065]
结果如下表6所示：
[0066]
表6 ck和df组母猪粪便中的scfas含量(x
±
se，n＝3)
[0067][0068][0069]
除丁酸外的其他短链脂肪酸含量在df组中均有增加，但差异并不显著(p>0.05)。仅丁酸含量在df组中显著增加(p<0.05)。对在粪便中得到的短链脂肪酸含量，其说明含义是有限的，该结果无法表征结肠近端发酵和短链脂肪酸吸收的动态过程，但对于肠道远端的短链脂肪酸含量有一定的代表性。
[0070]
在肠道末端，肠道菌群发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸可以通过扩散或转运进入细胞，并作为胃肠道细胞的重要能量来源，调节免疫反应及维持黏膜稳态。其中乙酸和丙酸影响饱腹感和肠道转运，并能通过循环系统直接影响脂肪组织、大脑和肝脏，特别是丙酸盐能被肝细胞利用进行糖异生转化为葡萄糖。而丁酸可诱导粘蛋白合成，使上皮细胞之间的连接收紧，并抑制组蛋白脱乙酰基酶类的活性，从而防止肠道炎症和肠漏综合征，预防结肠癌。此外，拟杆菌门中某些细菌如拟杆菌属会将乳酸转化为其他短链脂肪酸如乙酸、甲酸或丙酸，这些脂肪酸的大量堆积会损害肠道内壁。df组中丁酸含量的显著提高说明发酵大豆膳食纤维可促进丁酸的产生，保护肠道内壁并预防肠道炎症和结肠癌。