一种乳酸左氧氟沙星中乳酸的鉴别与含量测定方法与流程

1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种乳酸左氧氟沙星中乳酸的鉴别与含量测定方法。


背景技术：

2.乳酸左氧氟沙星药品原料标准收载于《中国药典》(2000年版)2004年增补本，该标准乳酸盐鉴别采用化学反应方法进行鉴别(详见《中国药典》2020年版四部通则0301一般鉴别试验中乳酸的鉴别)，即采用溴试液氧化乳酸产生乙醛，乙醛与亚硝基铁氰化钠反应形成暗绿色环判断为阳性反应，但是该鉴别方法专属性不强。
3.乳酸化学名为2
‑
羟基丙酸，市面上销售的乳酸试剂或药用辅料均为2
‑
羟基丙酸及其缩合物的混合物。《中国药典》2020年版中乳酸含量规定为“含乳酸以c3h6o3计算，应为85.0％～92.0％(g/g)”，该含量测定方法是采用乳酸中加入氢氧化钠滴定液，煮沸5min(使缩合物水解成乳酸单体)后用硫酸滴定液滴定。说明乳酸原料或乳酸试剂中乳酸单体的浓度是偏低的，以试剂中标示含量直接测定样品中乳酸含量会导致浓度偏大。乳酸左氧氟沙星是乳酸与左氧氟沙星成盐得到的离子化合物，溶于水后里面的乳酸以乳酸根离子存在，不存在缩合乳酸，若采用上述方法测定含量，将存在很大误差。
4.高效液相色谱法(hplc)是目前检测有机酸最为广泛使用的方法。通常使用酸性水溶液或缓冲盐作为流动相，抑制有机酸解离，进而在色谱柱上分离各种有机酸。而目前有机酸分析的难点在于，即使是在酸性条件下，分子中由于酸性基团的存在使得有机酸分子的极性仍旧较大，给反相色谱的保留造成困难；再加上流动相的水相比例往往较高，因此常规的反相c18色谱柱易发生相塌陷的现象。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种乳酸左氧氟沙星中乳酸的测定方法，该测定方法以乳酸锂为对照品，采用hplc法，用有机酸专用色谱柱进行梯度洗脱分析，能有效鉴别乳酸左氧氟沙星中的乳酸并测定乳酸含量，具有专属性好、前处理方法简单、分析时间短、精密度好、准确度高、重复性好等优点，适用于乳酸左氧氟沙星原料中乳酸的鉴别和含量测定。
6.本发明提供一种乳酸左氧氟沙星中乳酸的鉴别与含量测定方法，包括以下步骤：
7.1)供试品制备：将乳酸左氧氟沙星样品加水溶解，得到供试品溶液；
8.2)hplc测定：以乳酸锂作为对照品，采用hplc法对供试品溶液进行鉴别和含量测定；
9.其中，hplc测定采用月旭oaa色谱柱，并用流动a液和流动相b液进行梯度洗脱，所述流动相a液为0.01mol/l磷酸二氢钾；所述流动相b液为甲醇；
10.梯度洗脱程序为：在0
‑
6.5min时，洗脱液为95％的a液和5％的b液；在6.5
‑
7min时，a液降为60％，b液升至40％；在7
‑
19min时，保持a液为60％，b液为40％；在19
‑
20min时，a液
又升至95％，b液降为5％；在20
‑
30min时，保持a液为95％，b液为5％。。
11.本技术方案中，乳酸左氧氟沙星是乳酸与左氧氟沙星成盐得到的离子化合物，溶于水后乳酸以乳酸根离子存在，不存在缩合乳酸，而乳酸锂也为离子化合物，乳酸与锂成盐而得，不存在缩合乳酸，所以可以采用乳酸锂作为对照品测定乳酸左氧氟沙星中的乳酸含量；利用月旭有机酸专用色谱柱分离有机酸，可实现乳酸左氧氟沙星中乳酸的鉴别。
12.乳酸极性大出峰早，约5min时，而左氧氟沙星极性中等，本技术方案中采用梯度洗脱分析，可以在较短时间内实现极性较大的8种有机酸的分离，然后通过加大甲醇的比例，使得左氧氟沙星在约19min出峰，整体分析时间仅需30min，速度快。用该方法直接测定乳酸左氧氟沙星中的乳酸含量，误差小，速度快，操作简单。
13.具体地，上述技术方案中所述hplc法的色谱条件可以为：
14.流动相a：0.01mol/l磷酸二氢钾；
15.流动相b：甲醇；
16.流速：1.0ml/min；
17.色谱柱：月旭oaa，4.6
×
300mm；
18.柱温：30℃；
19.进样量：10μl；
20.检测波长：210nm。
21.本发明采用的月旭oaa有机酸专用色谱柱是一款硅胶基质的反相色谱柱，对亲水性有机酸具有极佳的分离能力，具有色谱性佳，分离度高，色谱峰均匀的特点。
22.进一步地，上述技术方案中所述流动相a液用磷酸调节ph至2.0
‑
3.0。优选地，将流动相a液用磷酸调节调节ph至2.5。
23.本技术方案中使用酸性流动相，可以抑制有机酸的解离，有利于色谱柱上各种有机酸的分离。同时，乳酸属于酸性极性很大的化合物，pka较小(3.86)，流动相需要较小的ph才能改善峰型并延长保留时间。
24.进一步地，上述技术方案中步骤2)所述鉴别包括乳酸和以下至少一种有机酸的鉴别：草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。
25.进一步地，上述技术方案中步骤2)中所述含量测定前还包括乳酸标准曲线的制备：量取乳酸储备溶液分别置于10ml量瓶中，加水稀释制成含乳酸1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的乳酸标准系列溶液；然后各取10μl注入高效液相色谱仪并记录色谱图，以乳酸峰面积为纵坐标(y)，以乳酸浓度(x)为横坐标，建立线性回归方程。本发明制成的标准曲线，线性关系好，建立的线性回归方程用于计算乳酸含量，准确。
26.进一步地，上述技术方案中所述乳酸储备溶液制备方法为：称取乳酸锂对照品，置于50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀制得。
27.本发明还提供由上述测定方法在对乳酸左氧氟沙星原料的乳酸鉴别和含量检测中的应用。
28.进一步地，上述技术方案中所述鉴别包括草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸中任一种有机酸的鉴别。
29.相对于现有技术的有益效果：
30.1.本发明采用乳酸锂作为对照品，无需用碱液滴定，可直接测定乳酸左氧氟沙星
中的乳酸含量，误差小，速度快，操作简单；
31.2.本发明采用hplc法鉴别乳酸左氧氟星沙中乳酸并测定乳酸含量，用有机酸专用色谱柱进行梯度洗脱分析，可以有效鉴别草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸8种有机酸；
32.3.本发明方法具有专属性好、前处理方法简单、分析时间短、精密度好、准确度高、重复性好的优点，适用于乳酸左氧氟沙星原料中乳酸的鉴别和含量测定。
附图说明
33.图1为本发明系统适用性色谱图，其中1为草酸，2为酒石酸，3为甲酸，4为抗坏血酸，5为乳酸，6为乙酸，7为柠檬酸，8为琥珀酸；
34.图2为本发明专属性色图谱，其中a为乳酸的色谱图，b为左氧氟沙星的色谱图，c为供试品溶液(乳酸左氧氟沙星)的色谱图，d为水的色谱图。
具体实施方式
35.本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施案例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，但本发明不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。
36.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的制剂若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
37.下面结合图示和实施例对本发明作进一步详细描述：
38.实施例1：实验条件优化
39.1.仪器与试剂
40.1.1仪器：lc
‑
20ad高效液相色谱仪(日本岛津公司)，ms205du电子天平(瑞士mettler toledo公司)；
41.1.2试剂：左氧氟沙星对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：130455
‑
201607，含量：97.3％)，l
‑
乳酸锂对照品(厂家：aldrich，批号：mkck3402，l
‑
乳酸含量89.1％)，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；
42.1.3药品：乳酸左氧氟沙星原料1，生产企业：浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：2190225
‑
190901；乳酸左氧氟沙星原料2，生产企业：上虞京新药业有限公司，批号：dk24
‑
1904281
‑
vi；乳酸左氧氟沙星原料3，生产企业：江西大地制药有限责任公司，批号：190105
‑
2。
43.2.色谱条件
44.流动相a：0.01mol/l磷酸二氢钾(用磷酸调节ph至2.5)，流动相b：甲醇，梯度洗脱，梯度表详见表1。流速：1.0ml/min；色谱柱为：月旭oaa(4.6
×
300mm)；柱温30℃；进样量10μl；检测波长：210nm。采用梯度洗脱分析，具体梯度洗脱数据见表1。
45.表1梯度洗脱表
[0046][0047]
3.溶液配制
[0048]
乳酸储备溶液：精密称取l
‑
乳酸锂对照品0.5558g，置于50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为乳酸储备溶液(约10mg/ml)。
[0049]
储备溶液：精密称取草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸适量，分别置于50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸各约10mg/ml的储备溶液。
[0050]
系统适用性溶液：分别量取草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸储备溶液各适量，置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成含草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸分别约为50μg/ml、1000μg/ml、1000μg/ml、50μg/ml、1000μg/ml、1000μg/ml、1000μg/ml和1000μg/ml的溶液作为系统适用性溶液。
[0051]
乳酸标准系列溶液：用移液枪精密量取浓度约为10mg/ml的乳酸储备溶液1ml、0.75ml、0.5ml、0.25ml，分别置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成含乳酸约为1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml和250μg/ml的溶液。用移液枪精密量取浓度约为1000μg/ml的乳酸溶液1ml和0.5ml，分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成含乳酸约为100μg/ml和50μg/ml的溶液。
[0052]
供试品溶液：取乳酸左氧氟沙星原料约0.29g，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到的溶液中含乳酸浓度约为500μg/ml、左氧氟沙星浓度约为2mg/ml。
[0053]
左氧氟沙星溶液：取左氧氟沙星对照品约20mg，置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0054]
4.条件选择
[0055]
4.1色谱分离条件
[0056]
取系统适用性溶液，参照上述色谱条件进行测定，结果如图1。各组分按草酸、酒石酸、甲酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的顺序依次出峰，各组分的分离度均大于1.5，其中，抗坏血酸峰和乳酸峰之间分离度为3.5，乳酸峰和乙酸峰之间分离度为1.8。说明本发明方法可将上述8种有机酸分离，且分离度好，可实现乳酸左氧氟沙星中乳酸的鉴别。
[0057]
4.2专属性试验
[0058]
分别取乳酸溶液(约500μg/ml)、左氧氟沙星溶液、供试品溶液和水，参照上述色谱条件进行测定，结果如图2。乳酸保留时间约5.9min，左氧氟沙星保留时间约17min，且水、左氧氟沙星溶液在乳酸保留时间均无色谱峰。说明水、左氧氟沙星溶液对乳酸的测定无干扰，专属性好。
[0059]
5.方法学考察
[0060]
5.1线性关系考察
[0061]
参照上述色谱条件，取乳酸标准系列溶液(含乳酸约为1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的溶液)10μl分别进样并记录色谱图。以乳酸峰面积为纵坐标(y)，以乳酸浓度(x)为横坐标进行线性回归，结果表明，乳酸在50
‑
1000μg/ml之间与峰面积呈良好线性关系，回归方程为：y＝492.490x
‑
544.844，r2＝0.9999。
[0062]
5.2精密度
[0063]
取浓度约500μg/ml乳酸溶液，参照上述色谱条件，连续进样6次(10μl)，记录色谱图。计算乳酸峰面积和保留时间的rsd，分别为0.07％和0.03％，结果见表2。说明本发明的测定方法精密度良好。
[0064]
表2精密度测定结果表
[0065][0066]
5.3重复性
[0067]
精密称取乳酸左氧氟沙星原料1(生产企业：浙江医药股份有限公司新昌制药厂)约0.29g，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，平行制备6份。参照上述色谱条件进行分析，记录色谱图。用回归方程计算6份样品中乳酸的含量，平均为17.3％，rsd为1.1％；6份样品中乳酸保留时间rsd为0.02％；结果见表3。说明本发明的测定方法重复性良好。
[0068]
表3重复性测定结果表
[0069][0070]
5.4定量限与检出限
[0071]
取浓度约为500μg/ml的乳酸溶液适量，用水稀释成浓度约为1.0μg/ml和0.3μg/ml的乳酸溶液，分别按上述色谱条件进行测定，结果乳酸浓度约为1.0μg/ml和0.3μg/ml时信噪比分别大于10和3。本发明测定方法对乳酸的定量限与检出限可以定为1.0μg/ml和0.3μg/ml。
[0072]
5.6准确度
[0073]
精密称取乳酸左氧氟沙星原料1(生产企业：浙江医药股份有限公司新昌制药厂)
约0.14g，置于100ml量瓶中(共9份)，分别加浓度约为10mg/ml的乳酸储备溶液1.5ml、2.5ml和3.5ml(每个浓度3份)，再分别加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别按上述色谱条件进行测定，并计算回收样中的乳酸浓度和回收率。结果乳酸回收率为99.81％～101.56％，平均回收率为100.3％，回收率rsd为0.9％，结果详见表4。说明本发明测定方法准确度良好。
[0074]
表4乳酸回收率结果表
[0075][0076]
实施例2：样品测定
[0077]
以实施例1“1.3药品”中3个生产企业的乳酸左氧氟沙星原料为样品，分别称取约0.29g，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。然后，按实施例1中色谱条件进行分析，记录色谱图。用回归方程计算3份样品中乳酸的含量，结果见表5。
[0078]
表5样品测定结果表
[0079][0080]
综上所述，本发明建立的hplc测定乳酸的方法具有专属性高、前处理方法简单、分析时间短、精密度好、准确度高、重复性好等优点，适用于乳酸左氧氟沙星原料中乳酸的鉴别和含量测定。
[0081]
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。