一种白芥子提取物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种白芥子提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病，俗称“老年痴呆症”，是一种老年神经系统性疾病。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，严重老年人的正常生活。近年来全球ad病患者的数量呈指数级增长，给患者家庭、公共医疗等都带来巨大的经济压力和社会负担，是当今世界医疗的一个研究热点。关于阿尔茨海默致病机理主要学说是“胆碱能学说”，乙酰胆碱是神经递质，在神经元之间传递信号。而患者大脑中的乙酰胆碱一旦被释放到间隙就立即被乙酰胆碱酯酶水解，从而导致神经递质乙酰胆碱的缺失，使中枢神经信号传递失败，最终形成阿尔茨海默病。
3.因此，通过乙酰胆碱酯酶抑制剂对患者大脑乙酰胆碱酯酶进行抑制，从而增加乙酰胆碱的浓度，可提高患者认知能力。目前，批准使用的阿尔茨海默病治疗药物均为乙酰胆碱酯酶抑制剂。但临床试验表明现有药物长期服用会出现恶心、厌食、呕吐等不良反应，疗效一般，不适于长期服用。因此，国内外越来越多的研究集中于从天然产物中提取乙酰胆碱酯酶抑制剂，更安全，也适合长期服用。


技术实现要素：

4.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种取代现有治疗药物作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，毒副作用小，尤其针对老年痴呆病效果明显的白芥子提取物及其制备方法和应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.发明人知晓，白芥子也叫辣菜子，它是植物白芥的种子，呈暗黄色的颗粒，是一种比较常见的中国传统香辛料。此外，它还可以入药，能温肺化痰也能止咳，《本草分经》记载“辛温入肺。通行经络，发汗散寒，温中利气，豁痰”。主要产自安徽、河南、四川、山东等地，全国各地多有栽培。
7.基于以上事实认定，提出如下具体方案：
8.一种白芥子提取物的制备方法，该方法为：将白芥子用乙醇提取后，去除乙醇，得乙醇提取物，之后将乙醇提取物加水溶解，用乙酸乙酯萃取，再去除乙酸乙酯溶剂，即得所述白芥子提取物。白芥子提取物的质量产率一般为1.3
‑
1.7％。白芥子提取物制得的药物制剂效果明显，其毒副作用相对较小，能有效改善老年痴呆症。
9.进一步地，采用乙醇提取时，白芥子与乙醇的体积比为1:(10
‑
15)，所述的提取温度为65
‑
72℃，时间为100
‑
140min。
10.进一步地，采用乙酸乙酯萃取的次数为2
‑
4次。
11.一种如上所述方法制备的白芥子提取物。
12.一种如上所述的白芥子提取物的应用，该提取物应用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中。乙酰胆碱酯酶抑制剂可用于防治老年痴呆症。
13.进一步地，所述的抑制剂包括白芥子提取物和药学上可接受的辅料。
14.进一步地，所述的抑制剂为胶囊、片剂或颗粒。
15.进一步地，所述片剂的制备方法为：将白芥子提取物与淀粉浆混合，过筛后混匀，在加入淀粉浆，过筛制粒，干燥至水分含量低于1％，干粒过筛整粒，将制备的干粒加入硬脂酸镁混匀，压片，控制每片重量为0.2g，即得白芥子提取物的片剂。
16.具体地，白芥子提取物与淀粉浆首次按质量比为1:(0.8
‑
1.2)混合，通过80目左右的筛，后一次加入混合物体积9
‑
12％的淀粉浆，载过14目左右的筛制粒，在50
‑
55℃下干燥至水分含量低于1％，干粒再通过16目左右的筛整粒，将制备的干粒加入2
‑
5％硬脂酸镁混匀，压片，控制每片重量为0.2g，即得白芥子提取物的片剂。
17.进一步地，所述胶囊剂的制备方法为：将白芥子提取物真空干燥后，制成粉状，将白芥子提取物与淀粉混匀，加入硬脂酸镁，最后用硬质胶囊填充，控制填充量，即得白芥子提取物的胶囊剂。
18.具体地，将白芥子提取物真空干燥后，制成粉状，将白芥子提取物与淀粉按质量比(1.8
‑
2.2):1混匀，加入总重量0.45
‑
0.55％的硬脂酸镁，用硬质胶囊填充，控制填充量在0.2
‑
0.3g，即得白芥子提取物的胶囊剂。
19.进一步地，所述颗粒剂的制备方法为：在白芥子提取物中加入蔗糖、糊精，混合均匀后过筛，干燥后，再整粒过筛制得白芥子颗粒。
20.具体地，在白芥子提取物中加入蔗糖、糊精，质量比1:(1.8
‑
2.2):(0.8
‑
1.2)，混合均匀后过16目左右的筛，干燥后，再整粒过筛制得白芥子颗粒。
21.与现有技术相比，本发明的白芥子提取物具有很强的乙酰胆碱酯酶的抑制活性，白芥子提取物为从常见香辛料中提取，可长期服用，相较于常规治疗药物副作用小。白芥子提取物对乙酰胆碱酯酶的强抑制力为开发新的治疗老年痴呆病提供了新的思路。
附图说明
22.图1为本发明白芥子提取物薄层色谱法初步鉴定图。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
24.白芥子提取物的制备：
25.白芥子：本发明所用的白芥子均购于安徽安庆，经鉴定为十字花科植物白芥sinapis alba l.的干燥成熟种子。
26.白芥子提取物的提取和分离：将白芥子用体积分数为80％的乙醇浸渍提取，按1:12料液体积比，浸提60min后，在70℃提取温度下回流提取120min，提取液经减压浓缩回收乙醇后，得到乙醇提取物，之后加水溶解，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，加压回收溶剂后，得乙酸乙酯提取物即为白芥子提取物。通常来说，白芥子提取白芥子提取物的产率一般为1.3
‑
1.7％。
27.白芥子提取物薄层色谱法初步鉴定：
28.(1)标准品的制备：
29.儿茶素标准品：准确称取儿茶素标准对照样品6.70mg，加入60％乙醇定容至10ml，得到0.670mg/ml的儿茶素标准品。
30.芦丁标准品：准确称取芦丁标准对照样品7.92mg，加入60％乙醇定容至10ml，得到0.792mg/ml的芦丁标准品。
31.齐墩果酸标准品：准确称取齐墩果酸标准对照样品1.02mg，加入60％乙醇定容至10ml，得到0.690mg/ml的齐墩果酸标准品。
32.(2)显色剂的制备：45ml乙醇和5ml浓硫酸配制成10％浓硫酸乙醇溶液。
33.(3)薄层色谱点样：以标准品儿茶素、芦丁和齐墩果酸分别作为多酚类、黄酮类和三萜类化合物对照，定性鉴别提取物中的活性物质的主要物质类别。取儿茶素、齐墩果酸、芦丁对照标准品点于同一硅胶gf254薄层板，在展开剂氯仿：乙酸乙酯：甲醇：甲酸＝6：8：4：2展开体系进行展开，展开结束后晾干喷洒10％浓硫酸乙醇溶液，并在105℃恒温干燥箱中加热，待显色后取出，观察，并计算rf值。
34.(4)白芥子提取物薄层色谱的鉴定结果，如图1，按照薄层色谱法对白芥子提取物进行初步鉴定，比移值及显色反应如上图。通过观察可知，样品显色后的斑点rf值与儿茶素、芦丁的比移值接近，并呈现出典型的颜色，多酚类呈现砖红色斑点、黄酮类化合物呈现黄色斑点的。因此，可判断白芥子提取物中主要含有多酚类、黄酮类化合物，这类化合物没有毒性，所以副作用小。
35.实验研究
36.1.白芥子提取物体外抑制乙酰胆碱酯酶的研究
37.1.1实验材料
38.应用ellman(ellman,g.l.courtney,k.d.andres,v.etal.biochem.pharmacol.1961,7,88.)的方法测试提取物对乙酰胆碱酯酶抑制的ic50值。所有测试都是用spectramax m2(multi
‑
mode microplate reader)型酶标仪(美国molecular devices公司)，在37℃条件下测定。数据分析软件使用origin软件进行数据处理，使用氢溴酸加兰他敏作为对照品。
39.1.2实验方法
40.1)抑制剂储备液的配制：所测试的抑制剂配成含10mmol/l的白芥子提取物的二甲基亚砜(dmso)溶液。
41.2)酶储备液的配制：乙酰胆碱酯酶购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成0.1mg/ml，2mg/ml。
42.3)底物储备液的配制：乙酰巯基胆碱(乙酰胆碱酯酶底物)购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成2mg/ml，4mg/ml。
43.4)显色剂储备液的配制：显色剂5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)，简称为dtnb，购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液配成4mg/ml。
44.5)测试：每次测试的体积都为150μl的ph＝8.0的磷酸盐缓冲液。往96孔酶标板中加入6μl显色剂储备液，再分别加入15μl不同浓度抑制剂溶液(用ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液稀释抑制剂储备液)，用ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液补齐至139μl，然后加入5μl酶储备液，在37℃的酶标仪中保温12min，立即加入6μl底物储备液，混匀后立即测其在λ＝405nm处一分钟
吸光度变化(斜率kt)。参比溶液为ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液，测其在λ＝405nm处一分钟吸光度变化(斜率k0)。根据抑制率计算公式：
[0045][0046]
得到不同浓度抑制剂的抑制率，通过非线性拟合求得所测物质对乙酰胆碱酯酶抑制活性的ic50。
[0047]
详细地说，ic50即为50％抑制率，前文已经交代，实验中加入不同浓度的抑制剂溶液，因此会得到对应的抑制率。而ic50即50％的抑制率，可通过上述数据的非线性拟合得到。
[0048]
求得所测物质对乙酰胆碱酯酶抑制活性的ic50。
[0049]
1.3实验结果及分析
[0050]
表1白芥子提取物对乙酰胆碱酯酶活性的影响
[0051]
组别品名乙酰胆碱酯酶ic50(μmol/l)本发明组白芥子提取物0.92对照组氢溴酸加兰他敏0.85
[0052]
由表1可见，本发明所述的白芥子提取物具有很强的乙酰胆碱酯酶的抑制活性，其所测得的ic50值已接近fda许可的氢溴酸加兰他敏，同时本发明的白芥子提取物为从常见香辛料中提取，可长期服用，相较于常规治疗药物副作用小。白芥子提取物对乙酰胆碱酯酶的强抑制力为开发新的治疗老年痴呆病提供了新的思路。
[0053]
实施例1
[0054]
将白芥子提取物与淀粉浆按质量比为1：1混合，通过80目筛，混匀，加入10％淀粉浆，过14目筛制粒，在52℃下干燥至水分含量低于1％，干粒通过16目筛整粒。将制备的干粒加入3％硬脂酸镁混匀，压片，控制每片重量为0.2g，即得白芥子提取物的片剂。
[0055]
实施例2
[0056]
将白芥子提取物真空干燥后，制成粉状，将白芥子提取物与淀粉按质量比2：1混匀，加入总重量0.5％的硬脂酸镁，用硬质胶囊填充，控制填充量在0.2
‑
0.3g，即得白芥子提取物的胶囊剂。
[0057]
实施例3
[0058]
在白芥子提取物中加入蔗糖、糊精(质量比1:2:1)，混合均匀后过16目筛，干燥后再整粒过筛制得白芥子颗粒。
[0059]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。