一种粗叶榕高效组培繁育方法与流程

1.本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种粗叶榕高效组培繁育方法。


背景技术：

2.粗叶榕(ficus hirta vahl)又名五指毛桃、五指牛奶、土北芪，牛奶木、五爪龙等，为桑科(moraceae)榕属(ficus)多年生灌木或落叶小乔木，全株密被粗毛，枝茎叶含乳汁，根皮有香气，自然生长于山坡、荒地、山谷或灌木丛林中，主要分布在我国江西、广西、福建、海南省等东南部及西南各省区和马来西亚、缅甸、越南、泰国等东南亚国家。粗叶榕根可入药，其味甘、辛，性平，有益气健脾、行气解郁、舒筋化湿、祛瘀消肿之功效，是抗痨丸、喘息丸、复方川贝止咳糖浆、滋肾宁神丸等多种中成药的原材料，为华南地区多民族习用草药；同时粗叶榕亦是食药同源的植物，被称之为“南芪”和“广东人参”，以其根来煲猪骨头、排骨、鸡骨汤已作为一种保健食疗的汤饮，随着我国经济的发展和生活水平的提高，人们保健意识逐渐增强，特别是近几年来，食品要求天然绿色产品这一热潮的兴起，使近几年粗叶榕根及深加工产品的市场需求量与日俱增，开发了很多粗叶榕速溶粉等保健食品和汤料药膳，粗叶榕年用量已超过1万吨。
3.然而，目前粗叶榕多以野生为主，极少人工栽培，市场供应基本依靠采挖野生资源。在自然条件下粗叶榕依靠种子进行繁殖，种子落地自然繁殖率低，生长期长，一般需8年
‑
10年才可采挖，且根系不发达，产量十分低，随着需求量的增加，大量野生资源遭到滥采乱挖，野生资源日渐匱乏，现单靠野生资源已远远不能满足国内外市场的需求，为保证粗叶榕资源的可持续利用，人工种植，特别是林下仿野生种植优良无性系是必然趋势。粗叶榕为小灌木，分枝少，单株药材产量低，需要高密度种植才能取得较高的经济效益，用种量为2.7万株/hm2，若种苗的价格过高，容易造成投资大于产出，使得人工种植无法顺利开展。通过组培繁育苗木，能够在短时间内繁育出大量具有优良性状并且一致的苗木，不受繁殖季节等因素的限制，因此，粗叶榕组培繁育方法的研究与应用是开展粗叶榕规模化人工种植的关键。
4.粗叶榕植株多浆、体表多硬毛，不易诱导愈伤组织和不定芽，很难获得组培苗。目前关于粗叶榕组织培养研究方面的报道十分有限，仅处于探索阶段，蒋林等以粗叶榕茎节为外植体进行离体再生研究，黄赛等以顶芽为外植体进行芽增殖培养研究，苏钰琴以粗叶榕茎尖外植体，进行了初代培养、继代培养和生根培养试验，李林轩和梁春辉等以叶片、叶柄和茎段为外植体诱导愈伤组织，进行不同激素对比研究，陶瑜等以新鲜粗叶榕种子为试验材料，比较了6
‑
ba、naa等对愈伤组织的诱导率及根发生率的影响，公开号为cn 104106468 b、cn 104106468 a、cn 111213588 a和cn 112088775 a的发明专利也公开了粗叶榕的组织培养繁育的方法，以上技术多采用间接离体再生的途径进行繁育，普遍存在诱导率和增殖系数偏低，育苗周期长，生产成本高和苗木质量差的问题，难以应用其进行规模化繁育苗木。因此，急需一种育苗周期短、增殖系数和生根率高、苗木质量好的粗叶榕高效组培繁育方法，为粗叶榕大规模苗木生产、人工种植利用提供技术支撑。


技术实现要素：

5.本发明克服了现有技术的不足，提供了一种育苗周期短、增殖系数和生根率高、苗木质量好的粗叶榕高效组培繁育方法。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种粗叶榕高效组培繁育方法，其特征在于包含如下步骤：植株预处理、外植体选择与灭菌、初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽；选择健壮、无病虫害、性状优良的粗叶榕植株作为外植体材料来源，对其进行预处理后，选择当年生幼嫩茎段作为外植体，对外植体进行灭菌修剪后，接种于初代诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于继代增殖培养基中形成丛芽，剪取单芽垂直插入生根培养基中诱导生根，最后进行炼苗移栽获得粗叶榕组培成活苗；主要操作步骤如下：
8.(1)植株预处理：选择健壮、无病虫害、性状优良的粗叶榕植株作为外植体材料来源，若移栽小植株是移栽盆中，若移栽植株较大不便移栽至盆中，是将其茎段进行套袋处理，将移栽植株置于大棚内或人工气候箱中养护，每5天
‑
7天，用灭菌剂喷淋植株，待萌发出新枝条后选作外植体；
9.(2)外植体选择与灭菌：于晴天采集当年生幼嫩茎段，剪去叶片和叶柄，保留4cm
‑
6cm长度的带芽茎段作为外植体材料；清水冲洗表面泥沙，用软毛毛刷刷洗外植体后，放入体积浓度为1％的洗洁精中震荡浸泡5min
‑
10min，自来水洗掉洗涤剂，放入体积浓度为2％的新洁尔灭消毒液中浸泡30min
‑
60min，流水冲洗1h
‑
2h，超声波清洗机中震荡清洗10min，放入多功能果蔬清洗机中消毒10min，在超净工作台上，将外植体放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡10s
‑
30s后，无菌水冲洗3次
‑
5次，再放入体积浓度0.1％hgcl2溶液中震荡浸泡8min
‑
12min，无菌水冲洗3次
‑
5次，将外植体材料放在灭菌的滤纸上吸干水分；
10.(3)初代诱导培养：用剪刀将步骤(2)得到的外植体两端分别剪掉1mm，并修剪成带1芽
‑
2芽的茎段，垂直插入配制好的初代诱导培养基中培养，每瓶1株；
11.(4)继代增殖培养：待初始芽生长至3cm
‑
8cm，剪掉大叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1.0cm
‑
2.5cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中，每瓶6株
‑
8株，经过20天
‑
25天培养，增殖形成丛芽；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2个
‑
3个芽的小丛接种在继代增殖培养基中培养，每瓶6株/丛
‑
8株/丛；
12.(5)生根培养：将步骤(4)得到高≥1cm的顶芽单芽垂直插入配制好生根培养基中培养，每瓶插12株
‑
15株；
13.(6)炼苗移栽：待步骤(5)生根培养后的单芽根系长度≥1.0cm时移到室外育苗棚中炼苗，5天
‑
10天后打开培养瓶盖，开盖炼苗1天
‑
2天后再移栽至装有育苗基质的育苗容器中，淋透水，之后进行苗木管理。
14.以上步骤(1)所述移栽小植株应采用浸盆法供水，大植株套袋法使用的袋子应为透气的无纺布袋；灭菌剂为质量浓度为75％的百菌清可湿性粉剂600倍液
‑
1000倍液。
15.以上步骤(2)所述的带芽茎段的直径为0.5cm
‑
1.0cm；震荡浸泡时采用水平旋转震荡仪的转速为160r/min；超声波清洗时的超声功率为80w，超声波清洗机和多功能果蔬清洗机内的用水应为灭菌水。
16.以上步骤(3)所述的茎段长度为1cm
‑
1.5cm，初代诱导培养基的配方为：ms 2
‑
ip 0.3mg/l
‑
0.5mg/l naa 0.5mg/l kt 0.3mg/l
‑
0.5mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2；培养容器为高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基。
17.以上步骤(4)所述的继代增殖培养基配方为：ms 2
‑
ip 0.2mg/l
‑
0.4mg/l naa 0.1mg/l
‑
0.2mg/l iaa 0.5mg/l
‑
1.0mg/l kt 1.5mg/l
‑
2.0mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养容器为高度14cm，直径9.5cm，口径5.3cm的650ml小口玻璃瓶，每瓶加入100ml培养基。
18.以上步骤(5)所述的生根培养基配方为：1/2ms iba 0.75mg/l
‑
1.0mg/l iaa 1.0mg/l
‑
1.5mg/l 活性炭0.05g/l 琼脂3.7g/l 糖15g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养容器为高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基。
19.以上步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)所述的培养控制条件均为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d。
20.以上步骤(6)所述的育苗基质为谷壳：椰糠：泥炭土体积比为1:3:5；所述的育苗容器规格为直径8cm，高10cm的无纺布杯，移栽前，用体积浓度为0.5％
‑
0.8％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液。
21.以上步骤(6)所述的苗木管理方法为：苗木置于带遮阴网的室外育苗大棚内，每日喷淋水1次
‑
2次，移栽后一周内，透光度保持在40％
‑
50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80％
‑
90％，用质量浓度0.1％
‑
0.2％复合肥水溶液喷施叶面，施肥后立即用清水冲洗叶面，以后每月采用上述施肥方式施复合肥1次，所述的复合肥的n:p:k＝15:15:15。
22.以上步骤(3)至步骤(5)组培繁育各阶段培养基较好的组合是：初始芽诱导培养基的配方为：ms 2
‑
ip 0.3mg/l naa 0.5mg/l kt 0.5mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2；继代增殖培养基配方为：ms 2
‑
ip 0.2mg/l naa 0.1mg/l iaa 0.5mg/l kt 2.0mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2；生根培养基配方为：1/2ms iba 0.75mg/l iaa 1.0mg/l 活性炭0.05g/l 琼脂3.7g/l 糖15g/l，ph＝5.8
‑
6.2。
23.相对于现有技术，本发明具有以下优点及积极效果：
24.1、应用本发明对粗叶榕进行高效组培，显著地提高了粗叶榕种苗的增殖系数、生根率和种苗质量，可在短时间内培育出大量性状一致可供大田栽培的粗叶榕幼苗，实现规模化生产，满足生产上的需要，能够解决粗叶榕野生资源越来越少甚至趋于竭源灭种的难题，可推动山区农民扩大药源，对于发展山区资源特色经济、开发新兴产业，具有较好的经济效益和社会效益。
25.2、本发明以健壮的粗叶榕当年生茎段作为外植体来源，外植体来源材料充足；对外植体灭菌前对植株进行预处理，采用浸盆法供水养护小植株，避免了植株地上部分沾水，同时喷洒灭菌剂，经过一段时间养护后选取的外植体材料带菌较少，灭菌成功率显著提高；在外植体灭菌过程中采用了超声波清洗机和多动能果蔬清洗机等多种方式相结合的方法，并且在灭菌剂浸泡时放在水平旋转震荡仪上震动，使得灭菌剂充分接触外植体的各个部位，彻底清洗茎段带芽等较难清洗的部位，大大降低了污染率。
26.3、本发明根据粗叶榕不同生长阶段的生长情况，在进行大量试验后对其培养基配方进行了筛选，继代增殖阶段培养采用2
‑
ip和kt组合方式作为细胞分裂素替代了现有技术中单一使用6
‑
ba的方式，减少了苗木愈伤化，同时加入适宜浓度的生长素iaa，在芽增殖的
同时不影响苗木长高，生根培养阶段采用iaa和iba的组合方式，提高了生根率的同时，避免了naa带来的基部愈伤化，根系数量显著增多。
27.4、本发明离体再生植株过程不需要诱导愈伤组织再分化出芽，直接采用以芽繁芽的方式进行增殖扩繁继而生根成苗，节省了操作步骤，使得操作更为简便，同时配合使用不同规格的玻璃瓶，继代增殖阶段采用650ml小口玻璃瓶，增加了培养空间，有效解决了粗叶榕在增殖阶段由于空间不足导致的水肿问题，各个阶段苗木生长健壮，效果理想。
28.5、本发明在筛选得到的培养基配方和特定的光温条件下培养，能够适应粗叶榕组培苗的生长特性，促进苗木的生长，初始芽诱导率可达92.6％
‑
95.3％，经过20天
‑
25天的继代增殖培养可形成丛芽，增殖系数高达6.9
‑
8.1，单芽接入生根培养基后8天
‑
12天后生根，15天生根率高达100％，根长2.0cm
‑
2.5cm，根系数量13条
‑
18条，根系粗壮，移栽成活率可达95.4％
‑
96.7％，大大缩短了育苗周期，可在短期内获得大量粗叶榕组培苗。
附图说明
29.图1为实施例1粗叶榕组培茎段诱导出芽。
30.图2为实施例1粗叶榕继代增殖培养瓶苗。
31.图3为实施例1粗叶榕组培生根培养瓶苗瓶底照。
32.图4为实施例1炼苗10d后粗叶榕组培生根瓶苗。
33.图5为实施例1粗叶榕组培移栽杯苗。
34.图6为实施例1粗叶榕组培移栽大苗。
35.图7为实施例3粗叶榕组培继代增殖培养瓶苗。
36.图8为实施例3粗叶榕组培生根培养瓶苗瓶底照。
37.图9为实施例3炼苗10d后粗叶榕组培生根瓶苗。
38.图10为对比例1粗叶榕组培继代增殖培养瓶苗。
39.图11为对比例1粗叶榕组培生根培养瓶苗瓶底照。
40.图12为对比例1炼苗10d后粗叶榕组培生根瓶苗。
41.图13为对比例2粗叶榕组培继代增殖培养瓶苗。
42.图14为对比例2粗叶榕组培生根培养瓶苗瓶底照。
43.图15为对比例2炼苗10d后粗叶榕组培生根瓶苗。
44.图16为对比例3粗叶榕组培继代增殖培养瓶苗。
45.图17为对比例3粗叶榕组培生根培养瓶苗瓶底照。
46.图18为对比例3炼苗10d后粗叶榕组培生根瓶苗。
具体实施方式
47.下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
48.实施例1：
49.(1)植株预处理：选择健壮、无病虫害、性状优良的粗叶榕植株作为外植体材料来源，移栽小植株至盆中，将其移栽至盆后，置于大棚内或人工气候箱中养护，采用浸盆法供
水，每5天，用质量浓度为75％的百菌清可湿性粉剂600倍液喷淋植株，待萌发出新枝条后选作外植体；
50.(2)外植体选择与灭菌：于晴天采集当年生幼嫩茎段，剪去叶片和叶柄，保留4cm
‑
6cm长度、直径为0.5cm
‑
1.0cm的带芽茎段作为外植体材料；清水冲洗表面泥沙，用软毛毛刷刷洗外植体后，放入体积浓度为1％的洗洁精中震荡浸泡10min，震荡浸泡时采用水平旋转震荡仪的转速为160rpm，自来水洗掉洗涤剂，放入体积浓度为2％的新洁尔灭消毒液中浸泡60min，流水冲洗2h，超声波清洗机中震荡清洗10min，超声波清洗时的超声功率为80w，放入多功能果蔬清洗机中消毒10min，超声波清洗机和多功能果蔬清洗机内的用水应为灭菌水，在超净工作台上，将外植体放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡30s后，无菌水冲洗5次，再放入体积浓度0.1％hgcl2溶液中震荡浸泡8min，无菌水冲洗5次，将外植体材料放在灭菌的滤纸上吸干水分；
51.(3)初代诱导培养：用剪刀将步骤(2)得到的外植体两端分别剪掉1mm，并修剪成带1芽
‑
2芽的茎段，茎段长度保持为1cm
‑
1.5cm，垂直插入配制好的初代诱导培养基中培养，每瓶1株，初代诱导培养基的配方为：ms 2
‑
ip 0.3mg/l naa 0.5mg/l kt 0.5mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，诱导率95.3％；
52.(4)继代增殖培养：待初始芽生长至3cm
‑
8cm，剪掉大叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1.0cm
‑
2.5cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中培养，每瓶6株，继代增殖培养基配方为：ms 2
‑
ip 0.2mg/l naa 0.1mg/l iaa 0.5mg/l kt 2.0mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度14cm，直径9.5cm，口径5.3cm的650ml小口玻璃瓶，每瓶加入100ml培养基，经过20天培养，增殖形成丛芽，增殖系数为8.1；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2个
‑
3个芽的小丛接种在继代增殖培养基中培养，每瓶6株/丛，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d；
53.(5)生根培养：将步骤(4)得到高≥1cm的顶芽单芽垂直插入配制好生根培养基中培养，每瓶插15株，生根培养基配方为：1/2ms iba 0.75mg/l iaa 1.0mg/l 活性炭0.05g/l 琼脂3.7g/l 糖15g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养容器为高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶倒50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，8天后长根，15天生根率100％，根长2.0cm
‑
2.5cm，根系数量14条
‑
18条；
54.(6)炼苗移栽：准备体积比为1:3:5谷壳:椰糠:泥炭土的育苗基质，装于直径8cm，高10cm的无纺布杯中，移栽前，用体积浓度为0.5％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液，待步骤(5)生根培养后的单芽根系长度≥1.0cm时移到室外育苗棚中炼苗，5天后打开培养瓶盖，开盖炼苗1天后，移栽至育苗基质中，淋透水，之后将苗木置于带遮阴网的室外育苗大棚内，每日喷淋水2次，移栽后一周内，透光度保持在50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80％，用质量浓度0.2％复合肥水溶液喷施叶面，施肥后立即用清水冲洗叶面，以后每月采用上述施肥方式施复合肥1次，所述的复合肥的n:p:k＝15:15:15，移栽成活率96.7％。
55.实施例2：
56.(1)植株预处理：选择健壮、无病虫害、性状优良的粗叶榕植株作为外植体材料来源，对较大植株不便移栽至盆中，可采用无纺布袋将其茎段进行套袋处理，每7天，用质量浓度为75％的百菌清可湿性粉剂1000倍液喷淋植株，待萌发出新枝条后选作外植体；
57.(2)外植体选择与灭菌：于晴天采集当年生幼嫩茎段，剪去叶片和叶柄，保留4cm
‑
6cm长度、直径为0.5cm
‑
1.0cm的带芽茎段作为外植体材料；清水冲洗表面泥沙，用软毛毛刷刷洗外植体后，放入体积浓度为1％的洗洁精中震荡浸泡10min，震荡浸泡时采用水平旋转震荡仪的转速为160r/min，自来水洗掉洗涤剂，放入体积浓度为2％的新洁尔灭消毒液中浸泡30min，流水冲洗1h，超声波清洗机中震荡清洗10min，超声波清洗时的超声功率为80w，放入多功能果蔬清洗机中消毒10min，超声波清洗机和多功能果蔬清洗机内的用水应为灭菌水，在超净工作台上，将外植体放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡30s后，无菌水冲洗3次，再放入体积浓度0.1％hgcl2溶液中震荡浸泡12min，无菌水冲洗3次，将外植体材料放在灭菌的滤纸上吸干水分；
58.(3)初代诱导培养：用剪刀将步骤(2)得到的外植体两端分别剪掉1mm，并修剪成带1芽
‑
2芽的茎段，茎段长度保持为1cm
‑
1.5cm，垂直插入配制好的初代诱导培养基中培养，每瓶1株，初代诱导培养基的配方为：ms 2
‑
ip 0.5mg/l naa 0.5mg/l kt 0.3mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，诱导率92.6％；
59.(4)继代增殖培养：待初始芽生长至3cm
‑
8cm，剪掉大叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1.0cm
‑
2.5cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中培养，每瓶8株，继代增殖培养基配方为：ms 2
‑
ip 0.4mg/l naa 0.2mg/l iaa 1.0mg/l kt 1.5mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度14cm，直径9.5cm，口径5.3cm的650ml小口玻璃瓶，每瓶加入100ml培养基，经过25天培养，增殖形成丛芽，增殖系数为6.9；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2个
‑
3个芽的小丛接种在继代增殖培养基中培养，每瓶8株/丛，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d；
60.(5)生根培养：将步骤(4)得到高≥1cm的顶芽单芽垂直插入配制好生根培养基中培养，每瓶插12株，生根培养基配方为：1/2ms iba 1.0mg/l iaa 1.5mg/l 活性炭0.05g/l 琼脂3.7g/l 糖15g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养容器为高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，12天后长根，15天生根率100％，根长2.0cm
‑
2.5cm，根系数量为13条
‑
16条；
61.(6)炼苗移栽：准备体积比为1:3:5谷壳:椰糠:泥炭土的育苗基质，装于直径8cm，高10cm的无纺布杯中，移栽前，用体积浓度为0.8％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液，待步骤(5)生根培养后的单芽根系长度≥1.0cm时移到室外育苗棚中炼苗，10天后打开培养瓶盖，开盖炼苗2天后，移栽至育苗基质中，淋透水，之后将苗木置于带遮阴网的室外育苗大棚内，每日喷淋1次水，移栽后一周内，透光度保持在40％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80％，用质量浓度0.2％复合肥水溶液喷施叶
面，施肥后立即用清水冲洗叶面，以后每月采用上述施肥方式施复合肥1次，所述的复合肥的n:p:k＝15:15:15，移栽成活率为95.4％。
62.实施例3：
63.(1)植株预处理：选择健壮、无病虫害、性状优良的粗叶榕植株作为外植体材料来源，移栽小植株至盆中后，置于大棚内或人工气候箱中养护，采用浸盆法供水，每7天，用质量浓度为75％的百菌清可湿性粉剂600倍液喷淋植株，待萌发出新枝条后选作外植体；
64.(2)外植体选择与灭菌：于晴天采集当年生幼嫩茎段，剪去叶片和叶柄，保留4cm
‑
6cm长度、直径为0.5cm
‑
1.0cm的带芽茎段作为外植体材料；清水冲洗表面泥沙，用软毛毛刷刷洗外植体后，放入体积浓度为1％的洗洁精中震荡浸泡10min，震荡浸泡时采用水平旋转震荡仪的转速为160r/min，自来水洗掉洗涤剂，放入体积浓度为2％的新洁尔灭消毒液中浸泡30min，流水冲洗2h，超声波清洗机中震荡清洗10min，超声波清洗时的超声功率为80w，放入多功能果蔬清洗机中消毒10min，超声波清洗机和多功能果蔬清洗机内的用水应为灭菌水，在超净工作台上，将外植体放入体积浓度为75％的酒精溶液中浸泡20s后，无菌水冲洗5次，再放入体积浓度0.1％hgcl2溶液中震荡浸泡12min，无菌水冲洗5次，将外植体材料放在灭菌的滤纸上吸干水分；
65.(3)初代诱导培养：用剪刀将步骤(2)得到的外植体两端分别剪掉1mm，并修剪成带1芽
‑
2芽的茎段，茎段长度保持为1cm
‑
1.5cm，垂直插入配制好的初代诱导培养基中培养，每瓶1株，初代诱导培养基的配方为：ms 2
‑
ip 0.2mg/l naa 0.5mg/l kt 1.0mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，诱导率为84.4％；
66.(4)继代增殖培养：待初始芽生长至3cm
‑
8cm，剪掉大叶片，保留顶芽和部分叶柄，修剪成高度为1.0cm
‑
2.5cm的单芽，转入配制好的继代增殖培养基中培养，每瓶8株，继代增殖培养基配方为：ms 2
‑
ip 0.5mg/l naa 0.1mg/l iaa 0.3mg/l kt 2.5mg/l 琼脂3.7g/l 糖30g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养基配好后分装于高度14cm，直径9.5cm，口径5.3cm的650ml小口玻璃瓶，每瓶倒100ml培养基，经过30天培养，增殖形成丛芽，增殖系数为5.5；再次进行继代增殖培养时，将丛芽底部愈伤组织切掉，切分成单芽或保留2个
‑
3个芽的小丛接种在继代增殖培养基中培养，每瓶8株/丛，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d；
67.(5)生根培养：将步骤(4)得到高≥1cm的顶芽单芽垂直插入配制好生根培养基中培养，每瓶插15株，生根培养基配方为：1/2ms iba1.5 mg/l iaa 2.0mg/l 活性炭0.05g/l 琼脂3.7g/l 糖15g/l，ph＝5.8
‑
6.2，培养容器为高度9.5cm、直径6.6cm、口径6.3cm的240ml直口玻璃瓶，每瓶加入50ml培养基，培养控制条件为：温度为25
±
3℃，光照强度3000lx
‑
9000 lx，光照时间12h/d
‑
16h/d，13天长根，15天生根率99.4％，根长1.5
‑
2.0cm，根系数量为2条
‑
7条；
68.(6)炼苗移栽：准备体积比为1:3:5谷壳：椰糠：泥炭土的育苗基质，装于直径8cm，高10cm的无纺布杯中，移栽前，用体积浓度为0.5％高锰酸钾溶液对育苗基质淋透消毒，1天后再用清水淋洒洗去药液，待步骤(5)生根培养后的单芽根系长度达到1.0cm以上时移到室外育苗棚中炼苗，8天后打开培养瓶盖，开盖炼苗2天后，移栽至育苗基质中，淋透水，之后将
苗木置于带遮阴网的室外育苗大棚内，每日喷淋水2次，移栽后一周内，透光度保持在50％，一周后逐渐增加光照，移栽一个月后透光度增至80％，用质量浓度0.1％复合肥水溶液喷施叶面，施肥后立即用清水冲洗叶面，以后每月采用上述施肥方式施复合肥1次，所述的复合肥的n:p:k＝15:15:15，移栽成活率为89.4％。
69.对比例1：
70.与实施例1基本相同，不同的是继代增殖、生根培养基和移栽基质采用“cn 104106468 b一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法”公开的最佳配方，移栽成活率为93.8％。
71.对比例2：
72.与实施例1基本相同，不同的是继代增殖、生根培养基和移栽基质采用“cn 111213588 a一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法”公开的最佳配方，移栽成活率为95.3％。
73.对比例3：
74.与实施例1基本相同，不同的是继代增殖、生根培养基和移栽基质采用《中药材》2004年第27卷第8期“五指毛桃组织培养研究”公开的最佳配方，移栽成活率为85.3％。
75.分别采用本发明实施例1
‑
3及对比例1
‑
3的处理方式进行处理，统计试验结果，初始芽诱导率/％＝(诱导初始芽的外植体数/接种外植体总数)
×
100％；增殖系数＝芽生长到可供切割成高度0.5cm
‑
1cm的芽数/接种时单芽总数；生根率/％＝(生根芽数/接种总芽数)
×
100％；最短组培苗成苗周期/天＝最短增殖周期 最短生根时间，将处理结果进行对比，见表1。
76.表1：各处理育苗效果对比
[0077][0078]
由表1可知，实施例1为最优实施例，效果如图1
‑
图6所示；
[0079]
与实施例1和实施例2对比，实施例3的培养基配方对激素含量进行了调整，其叶片
微褐化(效果如图7)，增殖系数分别降低了2.6和1.4，生根时间分别增加了5天和1天，生根率降低了0.6％，最短组培苗成苗周期分别增加了10天和6天，移栽成活率分别降低了7.3％和6.2％，根系数量较少(效果如图8)，炼苗后苗木质量较差(效果如图9)，说明适宜范围的激素含量对于苗木的生长具有重要意义，不适宜的激素含量增殖系数下降，生根率降低，根系质量差等问题，不利于苗木生长，本发明通过大量试验优化得到的培养基配方中激素含量适宜，苗木生长健壮；
[0080]
与实施例1对比，对比例1(效果如图10、图11、图12)、对比例2(效果如图13、图14、图15)、对比例3(效果如图16、图17、图18)中分别采用已公开的较佳的增殖、生根培养基和移栽基质，可发现实施例1增殖系数、生根时间、生根率、苗木状态、移栽成活率均为最优，缩短了育苗周期，由此说明本发明公开的组培繁育方法育苗周期短、增殖系数和生根率高、苗木质量好，可在短期内获得大量优质粗叶榕组培苗，对于推动粗叶榕产业的发展具有重要意义，具有较好的经济效益和社会效益。