一种基于水相的光子晶体分子印迹水凝胶传感器及其制备方法和检测方法与流程

1.本发明属于分子印迹传感领域，特别涉及一种基于水相的光子晶体分子印迹水凝胶传感器及其制备方法和检测方法。


背景技术：

2.溶菌酶(lysozyme,lyz)是一种大分子蛋白质，分子量约为14～15kda。作为一种碱性酶，其能够水解细菌中的黏多糖进而使细菌裂解，具有一定的抗菌作用。溶菌酶广泛存在于微生物、动植物组织、鸟类和禽类的蛋清、哺乳动物的泪液、血液和乳汁中，牛乳中每100ml约含有13μg溶菌酶。由于其特殊的抗菌性能，能够作为婴儿食品、饮料中的良好添加剂。目前，已有通过对奶牛接种某些特异性抗原，提高牛奶中的溶菌酶含量进而提高牛奶质量的做法。
3.目前，检测食品中溶菌酶含量的方法主要有层析法，分光光度法，毛细管电泳法，酶联免疫吸附(elisa)、高效液相色谱(hplc)法等。这些方法大多具有灵敏度高，准确度高的优点。但往往需要较为复杂的前处理过程，导致检测效率较低。另外，每类检测方法还存在各自的缺点，如elisa法需要特异性的抗体，hplc法操作复杂，成本较高，难以进行高效的检测。因此，急需开发一种成本较低，检测效率高的溶菌酶含量快速检测方法。
4.光子晶体(photonic crystals,pc)是一种具有不同折射率的几种材料在空间呈周期性排布和排列而构成的具有光子能带和带隙的光学材料，其既可以控制光子的运动方式，同时又具有与晶体类似的有序结构。分子印迹技术(molecularly imprinting technique,mit)是一种建立具有特定三维识别和结合位点的聚合物系统的技术，即通过制备具有与特定模板分子互补的特异性结合位点的聚合物，实现对目标物的特异性识别。目前已经被应用于食品中某些物质的分离和纯化。但由于分子印迹只具有选择吸附性而不具有传感特性，因此使用分子印迹分离后，还需要借助其他仪器(如分光光度计)等对吸附结果进行检测，降低了检测效率。将分子印迹技术与光子晶体技术相结合，可以得到具有高选择性和高传感性能的光子晶体分子印迹水凝胶(molecularly imprinting photonic hydrogels,miph)。材料与模板分子结合后，会使材料的晶面间距和折射率发生变化，从而引起材料布拉格衍射峰的波长变化，宏观上表现为材料颜色的变化，实现对目标物质的传感。因此，miph具有不需要借助其他仪器，制备过程简单，响应速度快等优势，已经被用于某些小分子和离子的检测。
5.尽管目前miph的制备方法和检测目标物多样，但由于蛋白质存在特定的三维结构并容易发生变性，因此传统的在有机相中制备miph的方法难以被应用于检测特定的蛋白质分子。目前，通过一步法在水相中直接合成针对蛋白质的光子晶体分子印迹水凝胶传感器的制备方法未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种以一步法在水相中直接合成针对蛋白质的光子晶体分子印迹水凝胶传感器的制备方法，并用于溶菌酶的快速检测。
7.本发明的目的主要通过以下技术手段实现：
8.本发明中一种光子晶体分子印迹水凝胶传感器的结构：
9.1)合成时的基底选择纯净的亲水化处理的玻璃片，首先在玻璃片表面自组装一层二氧化硅(sio2)微球，形成光子晶体模板(pc)。
10.2)在pc表面覆盖一层亲水化处理的玻璃片，将加入引发剂后的预聚合溶液(含有磷酸盐缓冲液、功能单体、交联剂、lyz)注入pc与玻璃之间的缝隙并使其聚合。
11.3)使用氢氟酸剥离两块玻璃片并除去其中的sio2微球，得到具有反蛋白石结构的光子晶体分子印迹水凝胶(miph)。
12.4)最后通过洗脱剂除去模板蛋白lyz，形成lyz
‑
miph。
13.本发明中在水相中通过一步法制备针对蛋白质的光子晶体分子印迹水凝胶传感器的具体步骤如下：
14.1)量取一定量的乙醇、水和氨水，均匀混合后置于一定温度下水浴搅拌，随后量取一定量的硅酸四乙酯和乙醇，均匀混合后迅速加入前述溶液中反应3h。反应结束后离心并干燥，得到283nm的二氧化硅微球；
15.2)将微球分散在乙醇中，形成一定质量分数的二氧化硅
‑
乙醇分散液；
16.3)将玻璃片裁成1mm
×
8mm
×
76mm和1mm
×
10mm
×
30mm两种尺寸，分别作为载玻片和压片。清洗后在食人鱼溶液(98％h2so4‑
30％h2o2，7:3，v/v)中浸泡24h，清洗并干燥；
17.4)将载玻片垂直插入分散液中，采用垂直自组装法在玻璃表面组装蛋白石结构的pc；自组装温度为35℃，时间为72h；
18.5)称取一定量的溶菌酶、丙烯酰胺和n,n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺溶于ph＝6.4的磷酸盐缓冲液中，预聚合2h；向预聚合溶液中加入一定量的10％质量分数的过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，随后迅速将溶液滴入具有一定高度的pc与玻璃之间的缝隙中，室温下聚合1h；
19.6)使用一定浓度的氢氟酸溶液处理玻璃和水凝胶，使除去玻璃基底和二氧化硅微球；
20.7)洗涤得到的水凝胶，使用洗脱剂除去其中的目标蛋白lyz，得到lyz
‑
miph；
21.8)作为对照组，按照相同的程序制备非印迹聚合物水凝胶(niph)，除了其中不加入目标蛋白lyz之外，其他制备方法均与lyz
‑
miph相同；
22.基于一种光子晶体分子印迹聚合物水凝胶传感器对溶菌酶的特异性识别和检测：
23.9)将水凝胶分别浸入含有不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液中。在室温下孵育20min后，使用紫外分光光度计测定水凝胶的布拉格衍射峰波长，以波长的变化量与浓度作图；
24.10)将水凝胶浸入500μg/ml的溶菌酶标准溶液中，使用紫外分光光度计每隔2.5分钟测定一次水凝胶的布拉格衍射峰波长，直至波长不发生变化为止，以波长与时间作图；
25.11)选用牛血清蛋白(bovine albumin)、l
‑
谷氨酸(l
‑
glu)、大肠杆菌全蛋白(the whole cell proteins in escherichia coli)作为溶菌酶的干扰物来测定所述光子晶体分子印迹水凝胶膜的选择性。
26.进一步的，所述步骤1)中，反应温度为35℃；乙醇、水和氨水混合液中各物质的体积分别为16.25ml、24.75ml、9ml；硅酸四乙酯和乙醇混合液中各物质的体积分别为4.5ml、45.5ml。
27.进一步的，所述步骤2)中，二氧化硅
‑
乙醇分散液的质量分数为2％。
28.进一步的，所属步骤5)中，溶菌酶、n,n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺的质量比为1:2:15～2:3:17。
29.进一步的，所属步骤5)中，质量分数为10％的过硫酸铵溶液与四甲基乙二胺的体积比为4：1。
30.进一步的，所属步骤6)中，氢氟酸溶液的质量分数为1％，处理时间为30min。
31.进一步的，所属步骤7)中，洗脱剂为20ml 10％(v/v)乙酸：10％十二烷基磺酸钠，洗脱时间为72h。
32.本发明的有益效果：该方法合成的水凝胶传感器具有良好的稳定性和强度，能够实现对复杂样品中溶菌酶的特异性识别和吸附，并能表现为凝胶颜色的改变，响应时间短，且布拉格衍射峰波长与溶菌酶的浓度成良好的线性关系。
33.本发明中，采用了在水相体系中直接合成针对溶菌酶的光子晶体分子印迹水凝胶传感器，与已经报道的光子晶体分子印迹水凝胶相比，可以更好地保持蛋白质的活性，具有更好的传感性能；制备过程中不需要有机溶剂，可以有效的保护环境。本发明中，采用一步法直接对传感器进行制备，不需要复杂的分子印迹制备和处理过程，具有制备简便，操作简单等优势。该水凝胶传感器具有良好的选择性和灵敏度，已经可以成功用于实际样品中溶菌酶的检测。
附图说明
34.图1是光子晶体模板(pc)的sem图
35.图2是光子晶体分子印迹水凝胶传感器(lyz
‑
miph)的sem图
36.图3是光子晶体分子印迹水凝胶传感器(lyz
‑
miph)的布拉格衍射峰波长与溶菌酶浓度的线性关系
37.图4是光子晶体分子印迹水凝胶传感器(lyz
‑
miph)与非印迹传感器(lyz
‑
niph)的布拉格衍射峰波长与吸附时间的关系
38.图5是光子晶体分子印迹水凝胶传感器(lyz
‑
miph)与非印迹传感器(lyz
‑
niph)针对不同物质的布拉格衍射峰变化量
具体实施方式
39.实施例1
40.1.一种基于水相的光子晶体分子印迹聚合物水凝胶膜，其特征在于，所述水凝胶具有反蛋白石的光子晶体结构，是一种高度有序的多孔材料，具有光子能带和带隙，大的比表面积，在特定波长的光照射下能够产生布拉格衍射现象。
41.2.根据权利要求1所述的光子晶体分子印迹水凝胶膜，其特征在于，所述反蛋白石结构的模板由尺寸为283nm的二氧化硅微球通过垂直自组装法获得，微球排列紧密，结构规则。所述水凝胶在模板表面聚合并包裹模板，通过氢氟酸除去二氧化硅微球，得到具有反蛋
白石光子晶体结构的水凝胶。
42.3.根据权利要求1所述的光子晶体分子印迹水凝胶膜，其特征在于，所述水凝胶膜由交联剂n,n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺，功能单体丙烯酰胺及目标蛋白组成。丙烯酰胺与目标蛋白在低温下进行预聚合，交联剂和功能单体在模板表面聚合时，会将目标蛋白包裹在聚合物中，从而在水凝胶内引入特异性识别位点。
43.4.根据权利要求1所述的光子晶体分子印迹水凝胶膜，其特征在于，所述水凝胶的合成完全在水相中进行，可以较好的保护目标蛋白的活性和结构。
44.5.根据权利要求1所述的光子晶体分子印迹水凝胶膜，其特征在于，所使用的目标蛋白为溶菌酶。
45.实施例2
46.1)使用硅酸四乙酯、氨水、水和乙醇合成直径为283nm的二氧化硅微球，用乙醇洗涤产物并离心和干燥，将干燥产物配制成质量分数为2％的二氧化硅
‑
乙醇分散液；
47.2)将玻璃片裁成1mm
×
8mm
×
76mm和1mm
×
10mm
×
30mm两种尺寸，分别作为载玻片和压片。用去离子水清洗，在食人鱼溶液(98％h2so4
‑
30％h2o2，7:3，v/v)中浸泡24h，依次用去离子水和乙醇清洗，使用氮气进行干燥；
48.3)将载玻片垂直插入分散液中，采用垂直自组装法在玻璃表面组装蛋白石结构的光子晶体模板；自组装温度为35℃，时间为72h；
49.4)将23mg目标蛋白溶解在1.0ml磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph＝6.4)中，加入15mg n,n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和174mg丙烯酰胺，使用旋涡混合器混合5分钟，置于4℃的冰箱中预聚合3小时，通入氮气10min，加入20μl质量分数为10％的过硫酸铵溶液和2.5μl四甲基乙二胺引发聚合；
50.5)将引发后的混合溶液迅速注入厚度为1mm的由压片和带有光子晶体模板的玻片组成的夹心结构中，并用夹子夹紧，静置1小时；
51.6)将夹心结构置于去离子水中，待凝胶自行脱落。使用1％的氢氟酸浸泡30分钟除去二氧化硅微球模板；
52.7)浸入体积比为1:1的浓度为10％乙酸和浓度为10％十二烷基硫酸钠混合溶液中15分钟除去目标蛋白；
53.8)制备对照组，按照相同的步骤制备非印迹聚合物，聚合过程中不加入目标蛋白。
54.实施例3
55.基于实例2制备出的光子晶体分子印迹水凝胶传感器进行检测：
56.1)将水凝胶分别浸入含有不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液中。在室温下孵育20min后，使用紫外分光光度计测定水凝胶的布拉格衍射峰波长，以波长的变化量与浓度作图；
57.2)将水凝胶浸入500μg/ml的溶菌酶标准溶液中，使用紫外分光光度计每隔2.5分钟测定一次水凝胶的布拉格衍射峰波长，直至波长不发生变化为止，以波长与时间作图；
58.3)选用牛血清蛋白(bovine albumin)、l
‑
谷氨酸(l
‑
glu)、大肠杆菌蛋白提取物作为溶菌酶的干扰物来测定所述光子晶体分子印迹水凝胶膜的选择性。
59.如附图3所示，布拉格衍射峰的波长与lyz的浓度在100μg/ml～500μg/ml范围内成良好的线性关系，线性方程为δλ＝
‑
4.5 0.109c(r2＝0.984),c为lyz的质量浓度，δλ为
bragg衍射峰波长的变化量。本工作制备的传感器具有良好的线性范围和较低的检测限，能够应用于实际样品中溶菌酶的含量检测。
60.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。