本发明涉及包含自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞群体的制造方法及其用途。
背景技术
恶性肿瘤为日本国民死亡原因的第1位，针对其的对策为当务之急。特别是，开发针对包括外科手术，放射治疗及化学疗法在内的现有治疗方法存在抵抗性的发展期难治性恶性肿瘤的新治疗方法是极其重要并有意义的。近年来，作为第4位治疗方法，使用免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)基因修饰T细胞的疗法(CAR-T疗法)的免疫疗法备受瞩目。但是，所述疗法多数是以通过识别抗原而被活化的T细胞作为效应器，因此存在对于特异性抗原的限制性这种根本性壁垒。
作为使用自然免疫的主要因子发挥作用的NK细胞的免疫疗法，其中使NK细胞在体外增殖，之后施用于患者的NK细胞疗法作为副作用较少的治疗方法而受到关注。但是，对NK细胞而言，从外周血等得到的数量较少，并且在体外的增殖性较低。因此，已进行了对培养NK细胞，使其增殖的技术的研究。例如，专利文献1提出了NK细胞的扩增方法及用于细胞疗法的药物组合物，所述药物组合物含有通过扩增得到的包含NK细胞的细胞群体，所述方法包括：制备包含NK细胞的细胞群体的步骤；从上述包含NK细胞的细胞群体除去T细胞的步骤；和在作为细胞因子仅包含IL-2的培养基中，将经历除去以后所剩的细胞进行培养且不使用饲养细胞的步骤。另外，专利文献2提出了NK细胞的制造方法以及含有制造的包含NK细胞的细胞群体的用于细胞疗法的药物组合物，所述方法包括：将造血祖细胞在包含IL-15，SCF，IL-7及Flt3L的单一培养条件下进行扩增的步骤；和在包含IL-2的培养条件下，以5，6，7，8或9天使上述扩增的步骤中得到的细胞诱导分化为NK细胞的步骤。
另外，本发明人等报道了作为肿瘤细胞毒活性提高的培养细胞，为CD16阳性，CD56高表达，且CD57阴性，且为NKG2C阳性、NKG2A阴性-低表达及CD94阳性的NK细胞，以及包含该NK细胞的细胞群体(专利文献3)，另外，已报道了表达趋化因子受体和细胞粘附分子的CD3阴性细胞(专利文献4)。
另一方面，在NK细胞的细胞表面上，表达有识别HLA I类的受体群。在这些受体中，KIR(Killer cell Immunoglobulin-like Receptor，杀伤细胞免疫球蛋白样受体)家族与HLA同样具有多样性。在造血干细胞移植中，从复发、GVHD(graft versus host disease，移植抗宿主病)及预后的观点出发，作为可带来更期望的结果的方式，最近正在有效利用在供体-接受者之间有意地进行的KIR/HLA错配，所述错配不是将HLA尽可能地匹配，而是以使接受者不具有针对供体NK细胞的KIR的配体的方式来选择供体等。但是，关于NK细胞的抗肿瘤活性，根据调查了当将NK细胞与在抑制性KIR配体方面为一致或错配(缺少在NK细胞供体中存在的1个以上的配体)的任一种饲养细胞共同培养时，HLAI类-KIR相互作用在同种异类环境中对人NK细胞增殖有何种程度影响的报告(非专利文献1)启示，当以抗肿瘤效果为指标而期望NK细胞发生高活化的情况下，较优为来自KIR的信号较少。另外，根据近年的关于HLA杂合(hetero)NK细胞(单向适合的情况)相对于源自HLA单倍型纯合子(HLA纯合(homo))iPS细胞的组织的同种反应性的报告(非专利文献2)，强烈启示就NK细胞的培养而言，包含HLA/KIR错配的混合培养是不成立的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-27385号公报(日本专利第5572863号、日本专利第5989016号)
专利文献2：日本特开2014-226079号公报(日本专利第5511039号、日本专利第6164650号)
专利文献3：日本特开2018-193303号公报
专利文献4：日本特愿2018-059624号申请说明书(在本申请的优先日时尚未公开)
非专利文献
非专利文献1：Mingus J.J.Rose et al.，Killer Ig-Like Receptor Ligand Mismatch Directs NK Cell Expansion In Vitro，The Journal of Immunology，2009，183：4502-4508.
非专利文献2：Hiroshi Ichise et al.，NK Cell Alloreactivity against KIR-Ligand-Mismatched HLA-Haploidentical Tissue Derived from HLA Haplotype-Homozygous iPSCs，Stem Cell Reports，2017，9：853-867.
技术实现要素：
发明所要解决的问题
本发明人等在进行包含活性高的NK细胞的细胞群体的开发。但是，由于作为原料的外周血、单采血液成分术(Apheresis)得到的血液的量有限，因此还不能将用于治疗的NK细胞群体事先制成成品(off-the-shelf)而备用于将来的治疗。
另一方面，根据本发明人等的研究，存在因供体不同而出现NK细胞的体外扩增效率极差的情况。
再者，认为在体内从骨髓中的造血干细胞进行分化的过程中，经历过与配体(HLA I类)的结合的未成熟NK细胞被“许可(license)”，具备在成熟后识别自身HLA I类的表达降低的细胞的“丧失自我(missing-self)应答”的能力，但是，在由iPS细胞、ES细胞分化成熟而成的NK细胞中，许可所需要的信号可能对于得到抗肿瘤效果是不足的。
用于解决问题的方法
本发明提供以下内容。
[1]包含NK细胞的细胞群体的制造方法，包括：
制备源自多个供体的包含NK细胞的单核的细胞的群体，
将制备的单核的细胞的群体在对NK细胞处理有效的条件下孵育。
[2]根据1所述的制造方法，其中制备单核的细胞的群体的工序包括除去CD3阳性细胞的工序。
[3]根据1或2所述的制造方法，其中制备单核的细胞的群体的工序包括除去CD34阳性细胞的工序。
[4]根据1-3中任一项所述的制造方法，其中制备单核的细胞的群体的工序包括从多个供体采集的外周血得到单核的细胞的群体的工序。
[5]根据1-4中任一项所述的制造方法，其中制备单核的细胞的群体的工序包括从多个供体采集的单采血液成分血得到单核的细胞的群体的工序。
[6]根据1-3中任一项所述的制造方法，其中制备单核的细胞的群体的工序为制备源自多个供体的、源自选自由胚胎干(ES)细胞，人工多潜能性干(iPS)细胞，及成体干细胞组成的组中任一种的单核的细胞的群体的工序。
[7]根据1-6中任一项所述的制造方法，其中多个供体包括一个供体以及在HLA及KIR的至少一个中基因型与该供体不同的其它供体。
[8]包含NK细胞的细胞群体，其具备以下特征，
(1)源自多个供体，
(2)在将NK细胞作为效应细胞(E)，将K562细胞作为靶标细胞(T)而以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的细胞毒活性为50％以上。
[9]用于细胞疗法的药物组合物，其包含通过1-7中任一项所述的制造方法制造的细胞群体。
[10]用于细胞疗法的药物组合物，其包含8所述的细胞群体。
[11]根据9或10所述的药物组合物，其用于治疗传染病和/或癌症。
发明的效果
由于能够将成为原料的血液或PBMC进行多人份的混合，因此可以增加原材料量，可以预期成品(off-the shelf)化。
可以不论供体而稳定地增殖NK细胞，还可以提高增殖率。
使得能够对应HLA-KIR匹配的多样化，能够预期稳定的活化。
使得能够灵活增加对NK细胞的许可而言需要的信号，能够预期改善源自iPS细胞、ES细胞的NK细胞群体的抗肿瘤效果。
附图说明
[图1]培养试验：从多人份的PBMC中分别除去CD3阳性细胞，使用KBM-501培养基培养14天。
[图2]实验结果的汇总(左)和统计分析(右)：与源自单独供体的培养相比，进行混合培养时更优地提高了增殖率。
[图3]肿瘤细胞毒活性试验：以相对于SKOV3(人卵巢癌细胞系)的杀伤为指标，对利用混合培养和源自单独供体的培养制备的NK细胞的细胞毒活性进行了评价。
[图4-1]利用500cm2培养袋的培养。在培养开始30分钟后和培养第9天进行了袋的翻转操作。
[图4-2]培养试验。以冷冻单采血液成分血(2名供体份)为材料，使用全自动封闭系统细胞处理装置除去CD3阳性细胞及CD34阳性细胞，之后使用KBM-501培养基用T75烧瓶或500cm2培养袋培养14天。
[图5]单核细胞/NK细胞交换(swapping)实验：在来自KIR3DL1，KIR3DS1的信号中一者或两者加入的条件的情况下，CD16高的群体增加。可以预期CD16高的群体有更高的ADCC活性。
具体实施方式
本发明涉及包含NK细胞的细胞群体。
[细胞群体的制造]
本发明的包含NK细胞的细胞群体可以通过包括以下工序的方法制造：
制备源自多个供体的包含NK细胞的单核的细胞的群体，
将制备的单核的细胞的群体在对NK细胞处理有效的条件下孵育。
(制备源自多个供体的单核的细胞的群体)
本发明的细胞群体从多个供体的单核的细胞的群体得到。这里所述单核的细胞(mononuclear cell)的群体中包含NK细胞，也可以包含除了NK细胞以外的单核的细胞，例如单核细胞(monocyte)。NK细胞可以为原代NK细胞(从活体采集的没有进行传代的NK细胞)。
对源自多个供体的包含NK细胞的单核的细胞的群体而言，存在为将包含从一个供体得到的单核的细胞(包含NK细胞，可以包含单核细胞)的群体与从其它供体得到的单核的细胞(可以包含NK细胞，单核细胞)的群体混合而成的情况，另外，也存在为从一个供体得到的NK细胞与从其它供体得到的单核细胞混合而成的情况。
关于供体，多个是指2个以上，满足上述条件则没有特别限定，可以使用源自例如3个以上，4个以上，7个以上，9个以上的供体的单核的细胞混合而成的那些。在多个供体中，存在包括待施用包含NK细胞的细胞群体的患者自己，该患者的近亲属的情况。
可以这样选择多个供体：使得多个供体中包含一个供体，和与其相比在HLA及KIR的至少一个中基因型不同的其它供体。在KIR中，包括KIR2DL1，KIR2DL2，KIR2DL3，KIR3DL1，KIR3DL2，KIR2DL4，KIR2DS1，KIR2DS2，KIR2DS3，KIR2DS4，KIR2DS5，KIR3DS1，KIR3DL3，KIR2DL5A，KIR2DL5B。
对于NK细胞，许可(licensing)是指在细胞的分化成熟的过程中，获得NK细胞特有的“丧失自我应答(自身HLA的缺失的检测)”的能力的过程。关于人、小鼠，认为在从骨髓中的造血干细胞分化出NK细胞的过程中，仅已经历了KIR、NKG2A和HLA I类分子的结合的未成熟NK细胞被许可，获得在成熟后识别自身HLA I类的表达降低的细胞的能力。已知参与许可的KIR的实例有KIR2DL1，KIR2DL2，KIR2DL3，KIR3DL1及NKG2A/CD94。对NK细胞能够识别的HLA类型而言，在经典HLA中，为HLA-C全部同种异型，HLA-B同种异型的约1/3，HLA-A同种异型的一部分(具有Bw4基序的那些)，非经典HLA中的HLA-E，HLA-G。在本发明中，可以在选择多个供体，使得多个供体包含一个供体和与其相比在HLA及KIR的至少一个中基因型不同的其它供体时，特别考虑如上所述的参与许可的KIR及HLA。
在本发明的优选实施方式之一中，可以以使进行NK细胞的许可的分子的储备库(repertory)增加的方式选择基因型不同的供体。另外，也可以以使得对NK细胞的抑制性KIR不产生刺激的方式，或对抑制性KIR产生刺激的方式进行选择。
对供体的选择而言，在预期基于NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(Antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性的情况，可以以使得在培养混合的单核的细胞的群体时CD16高的NK细胞增加的方式进行选择。作为基于NK细胞的细胞杀伤机制之一，已知有ADCC，其中NK细胞通过其细胞表面上的Fc受体CD16与结合了靶标细胞的抗体进行结合，执行对靶标细胞的杀伤。因此，通过CD16高的NK细胞的增加，可以预期ADCC活性变得更高。这样的供体组合条件的实例是选择供体并混合，使得NK细胞可进行由来自KIR3DL1及KIR3DS1中一者或两者的信号引起的许可。
对混合而言，在将NK细胞施用至对象前进行。对于混合而言，在能够得到由目标的混合带来的效果的范围内，可以在各种阶段进行。例如，可以将自多个供体采集的血液进行混合，接着从混合而成物得到单核的细胞的群体，也可以从源自各供体采集的血液分别得到单核的细胞的群体，之后将各群体混合。另外，也可以在将自多个供体采集的单核的细胞的群体进行各自培养后将各群体混合。从增殖良好的观点出发，优选所述混合在培养前进行。
对源自多个供体的单核的细胞的群体的混合比例而言，可以适当设定。例如可以使得源自多个供体的细胞以基本相等的比例被包含，另外，也可以使得源自特定的供体的细胞被较多或较少地包含。在将源自一个供体的NK细胞与源自其它供体的单核细胞进行混合的情况，混合比例也可以适当设定。例如，可以对于NK细胞1混合为其1-9倍的单核细胞(NK细胞∶单核细胞＝1∶1-9)，另外，可以相对于NK细胞1混合为其2-4倍的单核细胞(NK细胞∶单核细胞＝1∶2-4)。关于本发明，在表示细胞的混合比例时，如果没有特别说明，为基于细胞的数量。
作为得到单核的细胞的群体的原料，可以使用外周血，脐带血，从骨髓和/或淋巴结采集的血液细胞。优选的原料之一为外周血，外周血可以通过单采血液成分术采集。即，在本发明的优选实施方式中，制备单核的细胞的群体的工序包括从多个供体采集的外周血得到单核的细胞的群体的工序。另外，在另外的优选实施方式中，制备单核的细胞的群体的工序中，包括从多个供体采集的单采血液成分血得到单核的细胞的群体的工序。
对包含NK细胞和单核细胞的单核的细胞的群体而言，可以采用本领域技术人员已知的各种程序制备。例如，从外周血及脐带血这样的血液，通过在室温条件下进行密度离心而进行红细胞的去除及单核细胞级分的回收。从外周血分离的单核的细胞PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells)包含T细胞，B细胞，NK细胞，单核细胞及树突细胞等多种淋巴细胞。关于本发明，可以将CD3阴性且CD56阳性的单核的细胞称为NK细胞。NK细胞可以使用本领域技术人员已知的各种程序制备。已知例如，用于从全血或PBMC除去不需要的细胞而分离NK细胞的方法。单核细胞可以使用本领域技术人员已知的各种程序制备。已知例如，用于从全血或PBMC除去不需要的细胞而分离单核细胞的方法。
(CD3阳性细胞的去除，CD34阳性细胞的去除)
对单核的细胞的群体而言，除了包含单核细胞，NK细胞以外，也存在包含NK细胞前体，T细胞，NKT细胞，造血祖细胞等的情况。对所要的NK细胞而言，可在扩增之后使用例如：密度离心法，免疫磁珠，FACS，流式细胞术等进行选择。例如，存在使用抗CD3抗体，抗CD16抗体，抗CD34抗体，抗CD56抗体，抗CD69抗体，抗CD94抗体，抗CD107a抗体，抗KIR3DL1抗体，抗KIR3DL2抗体，抗KIR2DL3抗体，抗KIR2DL1抗体，抗KIR2DS1抗体，抗KIR2DL5抗体，抗NKp46抗体，抗NKp30抗体，抗NKG2D抗体等而从细胞群体中选择性分离NK细胞的情况。抗体存在为单克隆抗体、多克隆抗体等的情况。在NK细胞的选择中，存在进行将T细胞，NKT细胞，造血祖细胞以及其它细胞选择性除去的情况。
制备单核的细胞的群体的工序中也可以包括除去T细胞的工序，该工序可通过除去CD3阳性细胞实现。另外，制备单核的细胞的群体的工序中也可以包含除去造血祖细胞的步骤，该工序可通过除去CD34阳性细胞实现。即，制备单核的细胞的群体的工序也可以包括除去CD3阳性细胞的工序，也可以包含除去CD34阳性细胞的工序。
对CD3阳性细胞的去除，CD34阳性细胞的去除而言，能够通过使用例如：Invitrogen公司销售的Dynal Biotech公司制Dynabeads，Miltenyi Biotech公司的CliniMACS等免疫磁珠，分离除去表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞而实施。这样的工序优选以不造成NK细胞耗竭的方式，且单核细胞不发挥额外的吞噬功能的方式进行。具体而言，作为优选的操作，可以列举使用比较小型的磁珠(与细胞不结合的未反应的珠可以通过离心操作和上清液一起除去)，将珠与细胞群体在低温下孵育的时间设定得较短，在除去了未反应的珠的基础上使用柱而获得不与珠发生结合的细胞并作为目标的细胞群体等。细胞的去除也可以使用全自动封闭系统细胞处理装置进行。
(iPS细胞等的利用)
单核的细胞的群体可以为由造血干细胞制备而成的那些，所述造血干细胞源自选自由胚胎干(ES)细胞，人工多潜能性干(iPS)细胞，及成体干细胞组成的组中的任一种。从这些干细胞诱导包含NK细胞的单核的细胞的细胞的方法是已知的，作为本领域技术人员能够适用于本发明(Domogala A.et al.，Natural killer cell immunotherapy：from bench to bedside，Frontiers in Immunology，2015；6，doi：10.3389/fimmu.2015.00264，及Zeng J.et al.，Generation of″Off-the-Shelf″Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells，Stem Cell Reports，2017；9：1796-1812)。干细胞可以以能够得到高活性的NK细胞的方式修饰，例如，已知高亲和性CD16(158V：第158位氨基酸为缬氨酸)，这样的见解是能够适用的。
(单核的细胞的群体的培养)
将制备的单核的细胞的群体以源自多个供体的细胞混合的状态，在对NK细胞处理有效的条件下进行孵育。对(进行)孵育而言，存在不伴随细胞增殖的情况及伴随细胞增殖的情况。在本发明的优选实施方式之一中，(进行)孵育伴随着增殖。(进行)伴随增殖的孵育可以与(进行)培养，或(使其)增殖进行替换。
对NK细胞处理有效的条件是指适于以下的条件：使源自多个供体的混合的细胞发挥由目标的混合带来的效果。在发挥目标的效果的范围内，对于用于将细胞悬浊的培养基或等渗溶液，时间，温度，环境等没有特别的限定。
对NK细胞处理有效的条件包括对于NK细胞的活化而言有效的条件。这样的条件包括例如：在适当浓度的，活化所需的因素例如IL-2及IL-15的存在下，在37℃，5％CO2及饱和水蒸气气氛中孵育4-18小时。
对NK细胞处理有效的条件包括对于NK细胞的增殖而言有效的条件。对于NK细胞的增殖而言有效的条件包括使用适于NK细胞增殖的培养基。这样的培养基的实例包括但不限于KBM501培养基(Kohjin-bio株式会社)，CellGro SCGM培养基(CellGenix，岩井化学药品株式会社)，X-VIVO15培养基(lonza，TAKARABio株式会社)，IMDM，MEM，DMEM，RPMI-1640等。
存在在培养基中以能够实现本发明的目标的浓度添加白介素2(IL-2)的情况。IL-2的浓度存在超过2000IU/mL的情况，存在为2500-2813IU/mL的情况。IL-2优选具有人的氨基酸序列，从安全方面优选利用重组DNA技术进行生产。IL-2的浓度可以用国内标准单位(JRU)及国际单位(IU)表示。由于1IU为约0.622JRU，因此1750JRU/mL为约2813IU/mL。
存在在培养基中，添加受试者的自体血清、能够从例如BioWhittaker公司及其他获取的人AB型血清、从日本红十字会能够获取的献血人血清白蛋白的情况。白体血清及人AB型血清优选以1-10％的浓度添加，献血人血清白蛋白优选以1-10％的浓度添加。对受试者而言，存在健康的人和罹患疾病的患者的情况。另外，可以在培养基中代替血清或与血清一起添加为了免疫细胞的增殖而配制的组合物。这样的组合物是市售的。也可以使用例如UltraGro系列(AventaCell公司)，CTS Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific公司)用于本发明。
在培养基中，存在在不破坏NK细胞的扩增效果的条件下包含适当的蛋白质、细胞因子、抗体、化合物、其它成分的情况。存在细胞因子为白介素3(IL-3)，白介素7(IL-7)，白介素12(IL-12)，白介素15(IL-15)，白介素21(IL-21)，干细胞因子(SCF)，和/或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的情况。IL-3，IL-7，IL-12，IL-15，IL-21，SCF及Flt3L优选具有人的氨基酸序列，从安全方面优选利用重组DNA技术进行生产。
对培养基的交换而言，以能够得到所要的NK细胞的细胞数作为条件，可以在培养开始之后任何时候进行，优选为每3～5天。
培养容器包括能够商业获取的平皿，烧瓶，板，多孔板，但不限于这些。为了获得治疗用的包含NK细胞的细胞群体，优选使用能培养许多细胞，操作容易的培养容器。作为这样的培养容器的实例，可列举由气体透过性高的原料制成的细胞培养用袋。
在使用袋的情况下，优选在培养期间进行上下反转而使用。培养时，可见NK细胞，单核细胞均与培养面贴壁。在为贴壁类的细胞的情况下，每单位容积细胞密度以及每单位面积的细胞密度对培养效率(包括细胞的生存率及增殖速度)有较大影响。通过在培养期间将袋反转，可以使一部分NK细胞和单核细胞移动到之前因为处于上侧而细胞贴壁比较少的面，因此可以更有效地进行培养。
对培养条件而言，以不破坏NK细胞的扩增效果为条件，没有特别限定，通常为在37℃，5％CO2及饱和水蒸气气氛中的培养条件。本发明的目标之一为大量制备NK细胞，因此在培养基中培养的时期越长，越能得到更多的NK细胞，因而有利。对培养期间而言，以将NK细胞扩增至所要的细胞数为止为条件，没有特别限定。可以进行例如7～28天，可以为10～18天，也可以为12～16天，例如14天(Saito S.et al.，Ex vivo generation of highly purified and activated natural killer cells from human peripheral blood.Hum Gene Ther Methods.2013；24(4)：241-252，及同上所述专利文献1)。
也可以不在制备单核的细胞的群体后马上实施培养。存在将制备的包含单核的细胞的细胞群体冻存，根据施用于患者的时期进行解冻，进行NK细胞的培养的情况。需要说明的是，单核的细胞的群体也可以在利用本发明的NK细胞的扩增方法扩增的过程中或在扩增结束后进行冷冻，根据移植至患者的时期进行解冻，进行向患者的移植。冷冻及解冻可以任意使用本领域技术人员众所周知的任何方法。在细胞的冷冻中可以使用任意的市售的细胞冻存液。
对通过培养得到的指定的NK细胞的群体而言，存在除了目标的NK细胞以外，包含NK细胞前体、T细胞、NKT细胞、造血祖细胞等的情况。培养后，目标的NK细胞或其群体可以使用例如密度离心法，免疫磁珠，FACS，流式细胞术等进行选择。存在使用例如抗CD3抗体，抗CD16抗体，抗CD34抗体，抗CD56抗体，抗CD69抗体，抗CD94抗体，抗CD107a抗体，抗KIR3DL1抗体，抗KIR3DL2抗体，抗KIR2DL3抗体，抗KIR2DL1抗体，抗KIR2DS1抗体，抗KIR2DL5抗体，抗NKp46抗体，抗NKp30抗体，抗NKG2D抗体等，将目标的NK细胞，或其群体选择性地分离的情况。存在抗体为单克隆抗体、多克隆抗体等的情况。在目标的NK细胞或其群体的选择中，存在将T细胞，NKT细胞，造血祖细胞，其它细胞选择性去除而进行的情况。
(混合培养的效果)
根据本发明人等的研究，通过培养源自多个供体的包含NK细胞的单核的细胞的群体，NK细胞的增殖良好。认为原因在于由于HLA/KIR的组合的变异增加，由此成为更多的许可信号互相加入的方式。对于增殖而言，良好是指与将混合培养的多个供体中的任一个源自单独供体的细胞进行培养的情况相比，细胞的增殖率(培养后的细胞数/培养前的细胞数)提高。
另外，在通过混合培养得到的细胞群体中，可有70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上为NK细胞。
另外，根据本发明人等的研究，通过混合培养包含源自多个供体的NK细胞的单核的细胞的群体，得到的NK细胞的细胞毒活性能够相等或高于源自单独供体的NK细胞。再者，对包含CD16高表达的NK细胞的比例而言，也能够相等或高于源自单独供体的NK细胞。如果没有特别说明，细胞毒活性指对象细胞(效应细胞，E)针对靶标细胞(T)的溶解能力。细胞毒活性能够利用由效应细胞导致死亡的靶标细胞的百分率(％)表示，例如根据下式求出。
(与效应细胞共培养的情况的细胞死亡-自然细胞死亡(阴性对照))/(最大细胞死亡(阳性对照)-自然细胞死亡(阴性对照))×100
在测定细胞毒活性的时候，通常而言，根据效应细胞的细胞毒活性的程度等，对效应细胞与靶标细胞的混合比(E∶T)，效应细胞与靶标细胞共培养的时间而言，可以根据使用的细胞种类、活性的强度而适当制定。在NK细胞作为效应细胞时，存在靶标细胞为K562细胞，SKOV3细胞(人卵巢癌细胞株)，急性骨髓性白血病细胞，慢性骨髓性白血病细胞的情况，但不限于这些。效应细胞与靶标细胞、活细胞与死细胞可以利用被放射性物质、荧光染料等标记的抗体等试剂进行区别以及定量。
另外，对根据本发明的源自多个供体的本发明的NK细胞的群体而言，不受MDSC(Myeloid-derived suppressor cells，髓源性抑制细胞)造成的抑制或该抑制显著降低。本发明人通过至今的研究，确认了利用上述这样的培养方法得到的源自单独供体的NK细胞的群体不受由MDSC造成的抑制。作为原因之一，可列举针对体液因子(TGF-β，IL-10)的受体的不表达，或所述表达显著降低。根据本发明人等此次的研究可知，即使当将来自多个供体的细胞进行混合的情况，也并不有损于上述优点。
[包含NK细胞的细胞群体]
根据本发明得到的包含NK细胞的细胞群体具备以下特征：
(1)源自多个供体。
(2)在将NK细胞作为效应细胞(E)，并将K562细胞作为靶标细胞(T)而以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况，细胞毒活性为50％以上。
可以代替上述(2)的特征，或在(2)的特征之上具备下述特征：
(2′)在将SKOV3细胞作为靶标细胞(T)并以混合比(E∶T)3∶1进行共培养的情况，细胞毒活性为50％以上。
这样的细胞群体可以进一步具备下述特征。
(3)NK细胞的比例为70％以上，更特别指定时为80％以上，再特别指定时为90％以上。
(4)也可以包含为CD16高表达的NK细胞的群体，及为CD16低表达的NK细胞的群体这两者。为CD16高表达的NK细胞的比例为50％以上。
NK细胞的细胞毒活性可通过本领域技术人员众所周知的方法测定及算出。细胞毒活性(％)通常是基于与效应细胞(E)作用之后的靶标细胞(T)的活细胞数，例如采用算式：(1-活细胞数/阴性对照活细胞数)×100算出。
在将NK细胞作为效应细胞(E)，并将K562细胞作为靶标细胞(T)而以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况，细胞毒活性优选为60％以上，更优选为70％以上，更优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
在将NK细胞作为效应细胞(E)，SKOV3细胞作为靶标细胞(T)而以混合比(E∶T)3∶1进行共培养的情况，细胞毒活性优选为60％以上，更优选为70％以上，更优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
关于CD16等标记，有时将为阳性用 表示，将为阴性用-表示。例如，有时将CD16阳性用CD16 表示，将CD16阴性用CD16-表示。在阳性中，包括为高表达的情况和为低表达的情况。为高表达有时用高、亮表示。例如，有时将CD16高表达用CD16高、CD16亮表示。为低表达有时用低、暗表示。例如，有时将CD16低表达用CD16低、CD16暗表示。
阳性、阴性、高表达、低表达能够基于根据流式细胞术得到的图表而判断。在图表中出现的位置可能根据仪器的电压设定、灵敏度设定、使用的抗体克隆、染色条件、使用的染料等不同而改变，但本领域技术人员可以在得到的图表中，以将被认为是一组的细胞群体不分开的方式适当进行划线。
对目标的标记的表达而言，在为阳性还是为阴性的判断中，可以将使用了同种型对照(Isotype control)抗体的情况用作阴性对照而判断。同种型对照抗体为与特定的抗原不反应的抗体。一般而言，在使用了抗体的实验中，存在由于与靶标以外的蛋白质的非特异性结合、与细胞表面上的Fc受体的结合而产生背景的可能性。通过与使用了作为阴性对照的抗体的体系进行比较，由此明确相对于目标的抗原的一次抗体的反应是特异性的。另外，能够排除背景的影响，准确解释信号的强度。
目标的标记的表达的程度(为低表达或为高表达)，可以通过与在相同条件下测定的对照细胞的结果进行比较来判断。关于对照细胞的实例，为如在本申请说明书的实施例的项中记载的原代(primary)NK细胞那样的，从外周血得到且没有进行实质性培养的NK细胞。
例如，在某NK细胞的群体中的CD16表达程度能够通过以下进行判断：使用流式细胞术，将该细胞群体中的CD16表达量与从外周血得到且没有进行实质性培养的NK细胞的群体(对照)中的CD16表达量相比，将发现与对照为同等表达的情况判断为高表达，将表达低于对照细胞的情况判断为低表达。需要说明的是，已知对照的NK细胞为CD16高表达。
[医药用途]
本发明还提供用于细胞疗法的药物组合物，所述药物组合物将上述包含NK细胞的细胞群体作为有效成分。细胞疗法是指通过将在体外进行处理的细胞施用于对象，从而处理对象的疾病或状态的方法，在这其中包括免疫细胞疗法。
在药物组合物中除了为有效成分的细胞群体以外，包含能够进行悬浊NK细胞的溶液，例如：生理盐水，磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。在药物组合物或溶液中可以包含药学上允许的添加剂。药物组合物可以施用于例如静脉，动脉，皮下，腹膜内等。利用药物组合物的细胞疗法可以单独或与外科疗法，化学疗法，放射疗法等组合而实施。
包含NK细胞的细胞群体被预期用于癌的治疗、传染病的治疗(Dahlberg C.M.et al.，Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer：PossibleStrategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity，Front.Immunol.，2015；30：https//doi.org/10.3389/fimmu.2015.00605，及Schmidt S.et al，Natural killer cells as a therapeutic tool for infectious diseases-current status and future perspectives，Oncotarget，2018；9(29)：20891-20907)，本发明的药物组合物也可以用于治疗这样的癌或传染病。更具体而言，包括但不限于：口腔癌，胆囊癌，胆管癌，肺癌，肝癌，大肠癌，肾癌，膀胱癌，白血病；由病毒，细菌等造成的传染病。在使用了本发明的药物组合物的细胞疗法中，存在NK细胞被施用至例如：静脉、动脉、皮下、腹膜内等的情况。细胞疗法存在单独或与外科疗法，化学疗法，放射疗法，抗体药物等组合实施的情况。
认为抗体药物大多在静脉内施用之后显示基于ADCC活性的抗肿瘤效果。其一方面，在发挥ADCC活性的时候，除了NK细胞以外，单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞也被动员。并且，除了NK细胞以外的效应子对正常细胞和癌细胞无区别地显示ADCC活性，认为其也与副作用的发生相关联。在本发明中，可以在施用前将NK细胞和抗体混合，将抗体预先装备在NK细胞上。认为效应子由此被限定于NK细胞，能够减少施用的抗体的量，另外，对副作用的减少也极其有效。即，本发明的药物组合物可以在将NK细胞群体与抗体混合之后，经过除去未与NK细胞结合的抗体的工序而制备。即，本发明的药物组合物的优选实施方式之一为包含NK细胞和抗体，但抗体与NK细胞结合，实质上不包含为与NK细胞结合的抗体。(参考同上所述的专利文献3)。
本发明的药物组合物的制造，优选根据适合于药物及准药的制造管理及品质管理规定的条件(good manufacturing practice，GMP，良好操作规范)及再生医疗等产品的制造管理及品质管理的基准(良好的基因、细胞和基于组织的产品制造实践(Good Gene，Cellular，and Tissue-based Products Manufacturing Practice，GCTP))而实施。
以下进行说明的本发明的实施例仅为例示目的，并不意在对本发明的技术范围进行限定。本发明的技术范围仅由权利要求书的记载而限定。在不脱离本发明的主旨的条件下，能够进行本发明的改变，例如，追加、删除及替换本发明的构成条件。
实施例
[实施例1：从新鲜外周血得到的NK细胞的混合培养1]
从健康人志愿者实施采血，使用Ficoll(GE Healthcare，17144002)通过密度梯度离心而分离了外周血单核细胞。将分离的多人份的外周血单核细胞以基本相同比率混合，添加CD3珠※1并悬浊，于4℃孵育15分钟之后，加入分离缓冲液1mL※2充分悬浊，于300x g进行离心10分钟。除去上清液，悬浊于0.5mL的分离缓冲液中，添加至预先添加分离缓冲液2mL而润湿的LD柱(Miltenyi Biotech，130-042-901)，回收了来自LD柱的洗脱液。进一步向LD柱添加分离缓冲液1mL，回收了洗脱液。之后，用分离缓冲液1mL洗涤柱，计数了回收的液体中的细胞数，算出总细胞数。于500x g离心5分钟，除去上清液之后，悬浊于KBM501培养基※3中使得成为5x105细胞/mL。
将一部分细胞回收而用于流式细胞仪测定，其余的细胞进行培养。培养使用6孔板(Thermo Fisher Scientific，140675)，T-75烧瓶(Thermo Fisher Scientific，156499)，或500cm2培养袋(NIPRO)，在CO2培养箱中进行(37℃，5％CO2)。在培养第5天及第9天取出培养液的一部分计数了细胞数，在第9天添加了KBM501培养基，使得最终液量当为6孔板时为每1孔6mL，当为T-75烧瓶时为每1瓶50mL。在第14天回收细胞，计数了细胞数，用一部分的细胞通过流式细胞仪进行了细胞表面抗原的测定。
※1：CliniMACS CD3，Miltenyi Biotech，130-017-601(每1x107细胞5μL)
※2：0.5％人AB型血清(Cosmo Bio，12181301，于56℃经30分钟的灭活处理)，含2mM EDTA(Thermo Fisher Scientific，15575-020)的PBS((和光纯药工业，045-29795)
※3：添加了5％人AB型血清(Cosmo Bio，12181301，于56℃经30分钟的灭活处理)的KBM 501(Kohjin-bio，16025015)
将结果示于图1。在9人混合(图1的A)，8人混合(图1的B)，7人混合(图1的C)中的任一组中，细胞增殖良好。确认纯度的结果，在任一种混合培养中均有90％以上是CD3-CD56 的NK细胞。在8人混合培养中，利用T-75烧瓶和500cm2培养袋进行了培养，两者中细胞增殖均良好。需要说明的是，在9人混合培养，7人培养，及源自单独供体(7人中的1人)的培养中使用了6孔板进行培养。在使用500cm2培养袋的培养中，如后述的实施例4所记载那样进行将袋翻转的操作。
另外，当将7人混合培养与源自单独供体的培养中对细胞增殖进行比较时，在源自单独供体的培养中从6.8×106细胞增殖到1.9×107细胞(约2.8倍)，与此相对，在混合培养中从7.8×10６细胞增殖到3.7×107细胞(约4.7倍)，混合培养的一方细胞增殖良好(图1的C))。
[实施例2：从新鲜外周血得到的NK细胞的混合培养2]
以实施例1中记载的方法，将在T-75烧瓶中进行的，源自单独供体的培养(n＝17)及4人以上的混合培养(n＝10)的数据进行合计计算，针对得到的NK细胞数的细胞增殖率进行了统计分析。对分析软件而言，使用了JMP Pro13进行了Wilcoxon秩和检验。
将结果示于图2。在培养源自单独供体的细胞的情况下，增殖率(增殖后的总细胞数/增殖前的总细胞数)为3.10±0.56，与此相对，在混合培养的情况下，增殖率为6.56±1.24，混合培养的一方的增殖率在统计学意义上更高(P＜0.01)。
[实施例3：肿瘤细胞毒活性试验]
《NK细胞的制造》
回收了从健康人志愿者以实施例1中记载的方法得到的4人的混合培养NK细胞，和来自单独供体(4人中的1人)的培养NK细胞，洗涤后，分别悬浊在包含10％FBS(Nichirei Bioscience，171012-500ML)及100单位的青霉素，100μg/mL的链霉素(Nacalai Tesque，26253-84)的RPMI1640培养基(和光纯药工业，189-02025)(下文中记作10％FBS/RPMI1640)中，用与上述相同的培养基制备成浓度1x106细胞/mL。
《SKOV3的制造》
用不包含血清成分RPMI1640培养基(和光纯药工业，189-02025)将SKOV3细胞(人卵巢癌细胞系)制备成浓度1x106细胞/mL。将制备的SKOV3细胞用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker试剂盒(Sigma，PKH26GL-1KT)进行染色，最终用10％FBS/RPMI1640制备为2x106细胞/mL及2x105细胞/mL。
《MDSC(髓源性抑制细胞)的制造》
使用Ficoll从健康人志愿者(与NK细胞的供体不同)分离了外周血单核细胞，在包含10ng/mL IL-6(PEPROTECH，200-06-5UG)及10ng/mL GM-CSF(CellGenix，1012-050)的10％FBS/RPMI1640中培养7-10天，由此诱导MDSC。用不包含血清成分的RPMI1640培养基(和光纯药工业，189-02025)将MDSC悬浊，用PKH Green Fluorescent Cell Linker试剂盒(Sigma，MINI67-1KT)进行染色，最终用10％FBS/RPMI1640制备为8x105细胞/mL。
《细胞毒活性试验》
制备了将源自多个供体的混合培养NK细胞与SKOV3细胞的组，源自单独供体的培养NK细胞与SKOV3细胞的组，及在这2组中分别加入MDSC的组，共计4组，以及作为阴性对照的仅SKOV3细胞的组。
将NK细胞和SKOV3细胞以细胞比计为3∶1的方式接种于96孔板(IWAKI，4870-800SP)进行混合，在37℃，5％CO2中反应4小时。对于添加MDSC的组而言，以NK细胞和SKOV3和MDSC的细胞比为5∶1∶4的方式先将NK细胞和MDSC在96孔板中混合，在37℃，5％CO2中反应12～18小时。之后，离心(500x g，5分钟)除去上清液后，添加SKOV3细胞进行混合，在37℃，5％CO2中反应4小时。反应之后，离心(500x g，5分钟)除去上清液之后，添加用PBS稀释的Zombie溶液(Biolegend，423105)，进行混合，在室温，暗处孵育30分钟。离心除去上清液之后，用PBS悬浊，添加了AccuCheck Counting Beads(Thermo Fisher Scientific，PCB100)。用流式细胞仪(BD LSR Fortessa，BD Bioscience公司)使进行测定，用FlowJo软件(FLOWJO，LLC)进行分析，算出细胞毒活性率(％裂解)※4。
※4：细胞毒活性率＝(1-SKOV3活细胞数/阴性对照SKOV3活细胞数)×100
活细胞数：SKOV3细胞实际测量数×添加珠液中珠数/珠实际测量数
SKOV3细胞实际测量数：进行FSC/SSC门控(debris exclusion，碎片排除)，在双重排除(doublet exclusion)之后，进行PKH26 门控
将结果示于图3。源自多个供体的混合培养NK细胞显示与源自单独供体的NK细胞相比同等以上的细胞毒活性。
[实施例4：从冷冻单采血液成分血制备的NK细胞的混合培养]
将2名供体的冷冻单采血液成分血(HemaCare，PB001CLP)解冻，之后进行混合，用HBSS(-)溶液(Nacalai Tesque，17461-05)稀释，使用全自动封闭系统细胞处理装置Lovo Cell Processing System(FRESENIUS KABI)用PBS/EDTA溶液(Miltenyi Biotec，130-021-201)进行了洗涤，浓缩。接下来，将浓缩的细胞液使用CliniMACS Prodigy TS 310(Miltenyi Biotec，130-097-183)，CliniMACS CD3微珠(Miltenyi Biotec，130-017-601)，CliniMACS CD34试剂(Miltenyi Biotec，130-017-501)除去CD3阳性细胞，CD34阳性细胞，进行了洗涤，洗脱。计数了洗脱液中的细胞数，算出总细胞数。于500x g进行离心5分钟，除去上清液之后，悬浊于KBM501培养基中使得成为1x106细胞/mL。培养使用T-75烧瓶(Thermo Fisher Scientific，156499)或500cm2培养袋(NIPRO)在CO2培养箱中进行(37℃，5％CO2)。对袋的培养而言，从培养开始30分钟后将袋翻转，在培养9天第再次进行翻转操作(参考图4-1)。另外，在培养第9天取出培养液的一部分计数了细胞数，添加了KBM 501培养基使得最终液量在T-75烧瓶中为每1瓶50mL，在培养袋中为每1袋500mL。在第14天回收细胞，计数了总细胞数，用一部分的细胞通过流式细胞仪进行了细胞表面抗原的测定。
将回收到的细胞按以下的方式利用抗体进行了染色：
将Alexa Fluor(注册商标)700标记的抗人CD56抗体(Biolegend，318316)，PerCP/Cy 5.5标记的抗人CD3抗体(Biolegend，300430)，PE-Cy7标记的抗人CD16抗体(Biolegend，302016)以1μg/mL的浓度在4℃，染色30分钟之后，离心(500x g，5分钟，4℃)除去上清液，悬浊于PBS(-)(和光纯药工业)中后，使用流式细胞仪(BD LSRFortessa，BD Bioscience公司)进行了测定，利用FlowJo软件(FLOWJO，LLC)进行了分析。
将结果示于图4-2。在使用从冷冻单采血液成分血得到的NK细胞的情况下，通过混合培养，细胞也在14天中充分增殖。具体地，在T-75烧瓶培养的情况下从1.50x108细胞增殖到5.72x108细胞(约3.81倍)，在500cm2培养袋培养的情况下从1.50x108细胞增殖到5.60x108细胞(约3.73倍)(图4-2，左)。
对得到的培养NK细胞的群体中NK细胞的纯度而言，在T-75烧瓶培养的情况下为90.5％，在500cm2培养袋培养的情况下为91.7％。另外，关于CD16的表达，混合培养NK细胞的群体与源自单独供体的培养NK细胞的群体(参考日本特开2018-193303)同样地为二峰性。具体地，CD16低表达，及CD16高表达的比例在T-75烧瓶培养的情况下依次为50.9％及49.1％，在500cm2培养袋培养的情况下依次为46.7％及53.3％(图4-2，右)。
[实施例5：单核细胞/NK细胞交换实验]
《原代NK细胞和单核细胞的制造》
从健康人志愿者2名(作为供体1，2)采血，使用Ficoll通过密度梯度离心而分离了外周血单核细胞。从分离的外周血单核细胞中，使用EasySepTM Human NK Cell Enrichment试剂盒(STEMCELL，19055)分离了原代NK细胞，使用EasySepTM Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion(STEMCELL，19058)分离了单核细胞，分别计数了细胞数。用KBM 501培养基悬浊，使得原代NK细胞为1x105细胞/mL，单核细胞为3x105细胞/mL。
《交换培养》
将供体1的原代NK细胞与供体1的单核细胞，供体1的原代NK细胞与供体2的单核细胞，供体2的原代NK细胞与供体2的单核细胞，供体2的原代NK细胞与供体1的单核细胞分别组合为合计4组，以原代NK细胞与单核细胞的细胞比为1∶3的方式进行混合，在6孔板(Thermo Fisher Scientific，140675)中开始培养(37℃，5％CO2)。与实施例1中记载的方法同样地，在培养第9天追加KBM501培养基，在第14天回收细胞。使用得到的细胞，进行了针对细胞表面抗原和K562(人慢性骨髓性白血病细胞系)的细胞毒活性率的测定。
对细胞表面抗原的测定而言，将回收的细胞按如下方式利用抗体进行染色并分析：
将Alexa Fluor(注册商标)700标记的抗人CD56抗体(Biolegend，318316)，APC/Cy7标记的抗人CD3抗体(Biolegend，300426)，FITC标记的抗人KIR2DL1抗体(Miltenyi Biotec，130-103-966)，PerCP/Cy 5.5标记的抗人KIR3DL1抗体(Biolegend，312718)以1μg/mL的浓度在4℃，染色30分钟之后，离心(500x g，5分钟，4℃)除去上清液，悬浊于PBS(-)(和光纯药工业)中后，使用流式细胞仪(BD LSRFortessa，BD Bioscience公司)进行了测定，利用FlowJo软件(FLOWJO，LLC)进行了分析。
在细胞毒活性的测定中，制备了以下各组：对将2名供体的原代NK细胞与单核细胞进行组合而成的每种培养NK细胞，使所述培养NK细胞与K562细胞反应的4个组，作为阴性对照仅K562细胞的组，作为阳性对照将K562细胞用10％福尔马林进行固定的组。
《K562的制造》
将K562细胞(人慢性骨髓性白血病细胞系)用不包含血清成分的RPMI1640培养基(和光纯药工业，189-02025)制备成浓度1x10６细胞/mL。将制备的K562细胞用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker试剂盒(Sigma，PKH26GL-1KT)进行染色，最终用10％FBS/RPMI1640制备为2x10６细胞/mL。
《培养NK细胞的制造》
将通过上述方法得到的2名供体的原代NK细胞与单核细胞进行组合而培养所得到的4组培养NK细胞回收，洗涤，之后分别用10％FBS/RPMI1640进行悬浊，用与上述相同的培养基制备为浓度1x106细胞/mL。
《细胞毒活性试验》
将NK细胞和K562细胞以细胞比计为1∶1的方式添加至96孔板(IWAKI，4870-800SP)中，进行混合，在37℃，5％CO2中反应2小时。反应之后，离心(500x g，5分钟)除去上清液之后，添加用PBS稀释的7-AAD溶液(Beckman Coulter，A07704)进行悬浊，于室温孵育20分钟。用流式细胞仪(BD LSR Fortessa，BD Bioscience公司)进行测定，用FlowJo软件(FLOWJO，LLC)进行分析，算出细胞毒活性率(％裂解)※5。
※5：细胞毒活性率＝(K562细胞死亡细胞率-阴性对照死细胞率)/(阳性对照死细胞率-阴性对照死细胞率)×100
将供体分型信息示于下表，将结果示于图5。
[表1]
在来自KIR3DL1、KIR3DS1的信号中有一者或者两者加入的条件的情况下，CD16高的群体增加，因此可以预期更高的ADCC活性。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
