一种组织工程骨凝胶及其应用的制作方法

1.本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程骨凝胶及其应用。


背景技术：

2.目前，由创伤、感染、肿瘤或先天性疾病引起的关键性骨缺损的临床治疗，仍倾向于基于自体或同种异体骨移植。然而，严重的供体部位发病率、高度的感染风险和运输等问题，阻碍了它们成为可持续发展的骨修复材料。
3.基于生物可降解多孔支架的组织工程技术，被认为是进行骨再生修复的可行和有效替代策略。如今，已被广泛应用于骨组织工程支架的材料多为人工合成的可降解脂肪族聚酯，如聚乳酸、聚（乳酸
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羟基乙酸）、聚己内酯等。此合成材料往往缺乏生物活性成分，需要通过改性或添加外源性生物活性成分如生长因子、生物活性陶瓷来达到促进骨再生的目的。即便如此，骨组织的修复是一个包括多种生物活性因子协同作用的复杂过程，通过人工合成生物材料负载外源性生物活性成分来仿生模拟骨再生修复对其天然微环境的各种需求仍是一个巨大的挑战。
4.中国专利cn104984398b公开了一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，包括步骤：（1）对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨细胞诱导分化，使其分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质；（2）对成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒；（3）将成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，即制得注射型组织工程骨凝胶载体。将该载体应用在骨缺损修复中可显著提高注射型骨组织工程骨在骨缺损部位的原位成骨效果。但目前专利所使用的脱细胞材料制备方法含有较强的免疫原性，且凝胶生物力学强度较低，很难起到支撑作用，导致骨组织异常增生，因此需要一种新的组织工程骨凝胶来解决上述问题。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种组织工程骨凝胶及其应用，将交联葡聚糖与骨脱细胞材料联用，极大程度上促进了细胞成骨分化，具有较好的支撑性，免疫原性低。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供的组织工程骨凝胶，包括骨脱细胞材料、交联葡聚糖、生理盐水，骨脱细胞材料、交联葡聚糖与生理盐水的体积比为（0.1~1）：1：1。
7.优选地，本发明所用骨脱细胞材料的制备方法如下：（1）取骨组织，无菌pbs缓冲液漂洗，去除血液和其他杂质；（2）在含蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液中，恒温37℃摇床100~150rpm震荡2~3h；用pbs缓冲液冲洗6
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8次；（3）在含dna酶的pbs缓冲液中，加入青霉素
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链霉素溶液，37℃摇床100~150rpm震荡8~10h，用pbs缓冲液冲洗6~8次；
（4）在含tritonx
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100的pbs缓冲液中，加入青霉素
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链霉素溶液，恒温37℃摇床100~150rpm震荡4~8h；用pbs缓冲液冲洗6~8次；（5）在含sds的pbs缓冲液中，加入青霉素
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链霉素溶液，恒温37℃摇床100~150rpm震荡4~8h；用pbs缓冲液冲洗6~8次。
8.优选地，含蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液，体积浓度为7~8%的含蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液，其中蛋白酶抑制剂的浓度为10kiu/ml；含dna酶的pbs缓冲液中，dna酶的浓度为0.2~0.4mg/ml；含tritonx
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100的pbs缓冲液，体积浓度为5~6%的含tritonx
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100的pbs缓冲液；含sds的pbs缓冲液，体积浓度为5~8%的含sds的pbs缓冲液；步骤（3）（4）（5）中，青霉素
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链霉素溶液的浓度为10kiu/ml，10 kiu /ml，青霉素与链霉素的比例为1:1，相应的缓冲液和青霉素
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链霉素溶液的体积比为（5
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8）：1。
9.本发明还提供了一种组织工程骨凝胶的制备方法，将骨脱细胞材料、交联葡聚糖、生理盐水按比例混合，混合的方法为37℃恒温1000rpm/min，5min；其中所述骨脱细胞按照上述方法制备。
10.本发明另一目的是提供一种组织工程骨凝胶在骨组织损伤修复中的应用，将上述骨凝胶作为骨组织损伤修复材料，用于骨缺损的部位。
11.组织是由细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ecm)组成的，其中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应。而ecm是结构蛋白和功能蛋白的复合物，该组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好。ecm是组织和器官中的细胞的分泌产物，与这些细胞之间有着动态的相互作用，能够及时反映微环境的改变，同时在细胞迁移、分化和增殖方面有着重要的作用。其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用，即使经过脱细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境。本发明通过生物酶法脱细胞技术制备的骨脱细胞材料在去除异种/异体细胞的同时，可较好保留原先ecm的完整性。
12.而交联葡聚糖是一类新的可降解生物材料，由于其免疫原性低，组织相容性好并可被完全降解，在医疗美容领域受到广泛关注，由于其本身为葡萄糖聚合物，其降解产物为葡萄糖，在降解后可为生物供能，因此对组织、细胞的生长发育和修复起到重要作用。
13.本发明的有益效果为：在骨脱细胞材料的制备过程中，本发明使用生物酶法脱细胞技术，先用蛋白酶抑制剂保证骨脱细胞材料里蛋白质的完整性，蛋白酶抑制剂的浓度为10kiu/ml，含量为7
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8%，能更有利于骨中蛋白质的留存。然后用dna酶去除dna，再使用tritonx
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100去掉其他杂质，最后得到含sds的pbs的骨脱细胞材料。在去除异种/异体细胞的同时，可较好保留原先ecm的完整性；材料不含细胞、细胞核、dna等抗原性物质，具有极低的免疫排斥反应，具有很好的生物相容性；同时不含细菌病毒等有害成分，能降低感染的风险；能够模拟骨再生修复的微环境，为细胞生长提供理想环境；ecm包含的多种生长因子还能够促进骨组织的修复和重建。本发明使用交联葡聚糖作为组织工程凝胶的载体，支撑性好，免疫原性低，且可降解，其本身的多孔结构可吸附骨脱细胞材料，减缓了交联葡聚糖的降解，并可较大程度刺激细胞成骨分化。组织工程骨凝胶中使用生理盐水，可以保证凝胶的渗透压与体内生物环境相同。
14.本发明的骨脱细胞材料与交联葡聚糖混合制备的组织工程骨凝胶用于骨组织损
伤修复支撑性好，免疫原性低，可促进细胞成骨分化。
附图说明
15.图1为本发明的mts检测细胞活力图；图2为本发明的qpcr检测alp表达量图。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例1本实施例的组织工程骨凝胶，由骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖组成，骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖的用量比例为0.1：1：1。
18.其中，骨脱细胞材料的制备方法如下：（1）取spf级小鼠骨组织，剪成3mm左右的小块，无菌pbs漂洗3次，每次漂洗30min，去除血液和其他杂质；（2）在浓度为7%的含10kiu/ml蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡3h；用pbs冲洗6次；（3）浓度为0.2mg/ml的含dna酶的pbs缓冲液中，加入10kiu/ml，10kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为8：1，37℃摇床100rpm震荡10h，用pbs冲洗6次；（4）在浓度为5%的含tritonx
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100的pbs缓冲液中，加入10kiu/ml，10kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为8：1，恒温37℃摇床100rpm震荡8h；用pbs冲洗6次；（5）浓度为5%的含sds的pbs缓冲液中，加入10kiu/ml，10kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为8：1，恒温37℃摇床100rpm震荡8h；用pbs冲洗6次。得到骨脱细胞材料。
19.将骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖按照体积比0.1：1：1的比例， 37℃恒温1000rpm/min，5min混合，得到骨凝胶。
20.实施例2本实施例的组织工程骨凝胶，其由骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖组成，骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖的用量比例为0.5：1：1。
21.其中，骨脱细胞材料的制备方法如下：（1）取spf级小鼠骨组织，剪成3mm左右的小块，无菌pbs漂洗5次，每次漂洗10min，去除血液和其他杂质；（2）在浓度为8%的含10kiu/ml蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液中，恒温37℃摇床150rpm震荡2h；用pbs冲洗8次；（3）浓度为0.4mg/ml的含dna酶的pbs缓冲液，加入10kiu/ml，10 kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为5：1，37℃mg摇床150rpm震荡8h，用pbs冲洗8次；（4）在浓度为6%的含tritonx
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100的pbs缓冲液中，加入10kiu/ml，10 kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为5：1，恒温37℃摇床150rpm震荡4h；用pbs冲洗8次；（5）浓度为8%的含sds的pbs缓冲液，加入10kiu/ml，10kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为5：1，恒温37℃摇床150rpm震荡4h；用pbs冲洗8次。得到骨脱细胞材料。
22.将骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖按照体积比0.1：1：1的比例， 37℃恒温1000rpm/min，5min混合，得到骨凝胶。
23.实施例3本实施例的组织工程骨凝胶，其由骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖组成，骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖的用量比例为1：1：1。
24.其中，骨脱细胞材料的制备方法如下：（1）取spf级小鼠骨组织，剪成3mm左右的小块，无菌pbs漂洗4次，每次漂洗20min，去除血液和其他杂质；（2）在浓度为7%的含10kiu/ml蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液中，恒温37℃摇床120rpm震荡2h；用pbs冲洗7次；（3）浓度为0.3mg/ml的含dna酶的pbs缓冲液，加入10kiu/ml，10kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为6：1，37℃摇床120rpm震荡9h，用pbs冲洗7次；（4）在浓度为5%的含tritonx
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100的pbs缓冲液中，加入10kiu/ml，10 kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为7：1，恒温37℃摇床120rpm震荡6h；用pbs冲洗7次；（5）浓度为6%的含sds的pbs缓冲液，加入10kiu/ml，10 kiu/ml的青霉素
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链霉素溶液，缓冲液和青霉素
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链霉素溶液体积比为6：1，恒温37℃摇床120rpm震荡6h；用pbs冲洗7次。得到骨脱细胞材料。
25.将骨脱细胞材料、生理盐水与交联葡聚糖按照体积比0.1：1：1的比例， 37℃恒温1000rpm/min，5min混合，得到骨凝胶。
26.实施例4为了证明交联葡聚糖与骨脱细胞材料联用能增强骨髓间充质干细胞的细胞活力，促使骨髓间充质干细胞成骨分化，设置实验组、对照组1、对照组2进行细胞实验，实验组所用组织工程骨凝胶制备方法与实施例3相同。将50份上述组织工程骨凝胶、50份骨髓间充质干细胞混合均匀，在1640 10�s培养基中培养72h，作为实验组；将50份上述交联葡聚糖与50份骨髓间充质干细胞混合均匀，在1640 10�s中培养72h，作为对照组1；将50份pbs与50份骨髓间充质干细胞混合均匀，以使对照组2中液体量与对照组1和实验组相等，在1640 10�s中培养72h，作为对照组2。实验组、对照组1、对照组2培养条件均为37℃，5%二氧化碳。骨髓间充质干细胞株购自deweibio。
27.将实验组、对照组1、对照组2得到的细胞进行细胞活力检测，直接使用碧云天的
mts试剂盒检测细胞活力，在细胞与实验组或对照组材料共孵育72h后，加入mts于37℃恒温箱中孵育3h，用酶标仪检测在570nm波长处各孔与活细胞相关的吸光度值（od值），计算得到的mts检测细胞活力图如图1所示，其中纵坐标表示细胞总体活力，从图1可以看出，实验组的细胞活力显著高于对照组1、对照组2。所以，交联葡聚糖与骨脱细胞材料共培养的骨髓间充质干细胞具有更强的细胞活力。
28.将实验组、对照组1、对照组2得到的细胞进行分化基因检测，使用rt
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pcr检测成骨特征性基因alp的表达，实验组、对照组的细胞培养条件与mts检测中培养条件一致，培养结束后，收集细胞，使用trizol法提取细胞内总rna，并将胞内总rna反转录，使用特定引物测定胞内alp的总体表达量（其中引物序列为：5'
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3'gaggcatacgccatcacatg，3'
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5'ccgatggcacacctgctt），通过待测基因与内参基因(gapdh)ct值的差值来计算基因表达差异，得到图2所示的qpcr检测alp表达量图，纵坐标为标准化后骨髓间充质干细胞内alp的总体表达量，交联葡聚糖共培养的骨髓间充质干细胞alp的表达量显著高于对照组1和对照组2，说明交联葡聚糖共培养的骨髓间充质干细胞成骨分化更明显。
29.以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。