一种用于山茶花多酚的提取方法与流程

1.本发明涉及多酚提取领域，特别涉及一种用于山茶花多酚的提取方法。


背景技术：

2.多酚是具有多种功能活性的天然药物的重要成分之一，可能对疾病的预防有不错的效果。例如多酚可以预防心脑血管等慢性疾病，有很强的清除自由基的能力可以降低氧化作用，还能降低肿瘤生成几率和减少癌变的风险。例如，cn201710612581.8西南山茶花中茶多酚的制备方法，该方法以干燥的西南山茶花为原料，以50～80％的丙酮水溶液为溶剂进行回流提取，提取液浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经dm130大孔树脂吸附后，用蒸馏水洗脱杂质，再以浓度为20～60％乙醇溶液洗脱，采集乙醇脱液，浓缩干燥后得西南山茶花的茶多酚产品，该方法使用较多有机溶剂。cn201310089287.5一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，该方法通过以下步骤：(1)山茶花粉末制备；(2)浸提液的制备；(3)树脂吸附制得山茶花多酚。该方法使用较多的有机溶剂。因此，需要方便、快速，使用减少的有机溶剂山茶花多酚的提取方法，通过该方法提高山茶花多酚的收率和纯度。


技术实现要素：

3.鉴以此，本发明提出一种用于山茶花多酚的提取方法，不仅实现使用较少的有机溶剂提取山茶花中的多酚，而且提高山茶花多酚的收率和纯度。
4.本发明的技术方案是这样实现的：
5.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花低温冷冻粉碎，过筛。
6.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:5～10，进行超声提取制得浸提液，所述提取液由丙酮、生物酶、冰醋酸和水制得；本发明通过超声提取山茶花中的多酚，超声时间、频率、功率和功率经过大量实验得出，本发明中所采用的超声参数和提取液相互配合，使细胞壁快速分解，多酚快速浸出。提取液中添加少量的冰醋酸提高提取液的渗透作用，在生物酶的作用下，不仅提高了山茶花中多酚的浸出速率，而且去除步骤(1)中低温粉碎产生的过氧化物，提高多酚的纯度，同时，本发明使用少量的有机溶剂进行提取多酚，提供了一种绿色环保、经济效益高的提取方法。
7.(3)过滤：将吸附剂加入步骤(2)制得的浸提液中，振荡吸附30～40min，过滤，制得多酚滤液；本发明吸附剂合理配比，有效吸附浸提液中的杂质，提高多酚纯度。
8.(4)萃取：将步骤(3)得到的多酚滤液使用饱和正丁醇和进行萃取，萃取时间10～15s，过滤，取水层，再用乙酸乙酯萃取5～10s，制得山茶花多酚粗提液，所述多酚滤液和饱和正丁醇体积比为1:2～3，所述水层和乙酸乙酯体积比为1:1～2。
9.(5)浓缩干燥：将步骤(4)制得的山茶花多酚粗提液进行浓缩干燥，制得山茶花多酚。
10.进一步的，步骤(1)中，所述冷冻温度为
‑
5～2℃，冷冻时间为10～15min。
11.进一步的，步骤(1)中，所述粉碎为使用料理机进行粉碎。
12.进一步的，步骤(1)中，所述过筛筛网规格为14目。
13.进一步的，步骤(2)中，所述提取液按质量百分比计由20～40％的丙酮、0.5～1.5％的生物酶、2～5％冰醋酸和余量的水制得。
14.进一步的，步骤(2)中，所述生物酶由质量比为1～3:2～5:0.5～1.5的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得。
15.进一步的，步骤(2)中，所述冰醋酸体积分数为40～50％。
16.进一步的，步骤(2)中，所述超声提取时间为30～40min，超声频率为10～20khz，超声功率为20～25w，超声温度为40～50℃。
17.进一步的，步骤(3)中，所述吸附剂由质量比为5～10:1～3:4～7的活性白土、不溶性壳聚糖和海藻酸钙制得。
18.进一步的，步骤(3)中，所述吸附剂和浸提液的质量比为0.05～0.2：1。
19.进一步的，步骤(3)中，所述振荡功率为80～100r/min。
20.进一步的，步骤(3)中，所述过滤采用孔径为150um管式膜过滤器进行过滤。
21.进一步的，步骤(5)中，所述浓缩干燥干燥温度为60～70℃，干燥时间为1～2h。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明的山茶花多酚的制备方法，通过5个步骤制得山茶花多酚，本发明所采用的超声参数与提取液相结合，不仅加快山茶花内分子运动频率和速度，从而加快山茶花多酚溶出速率，提高了山茶花多酚的提取率，而且使用较少的有机溶剂，降低了山茶花多酚的提取成本，本发明所采用的吸附剂和有机溶剂萃取去除杂质，吸附剂通过振荡方式去除浸提液中的杂质，操作方便简单，使用有机溶剂进行萃取，有机溶剂可以回收重复利用，不会造成环境污染。本发明山茶花多酚提取率均高于19％，纯度均高于95％。
具体实施方式
24.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
25.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1山茶花多酚的提取方法
28.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花冷冻粉碎冷冻时间为10min，冷冻温度为
‑
5℃，将冷冻后的山茶花使用料理机粉碎，过14目筛。
29.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:5，超声提取时间为30min，超声频率为10khz，超声功率为20w，超声温度为40℃，制得提取液，所述生物酶由质量比为1:2:0.5的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得，按质量百分比计，所述提取液由20％的丙酮、0.5％的生物酶、2％体积分数为40％的冰醋酸和余量的水制得。
30.(3)过滤：将吸附剂加入步骤(2)制得的浸提液中，吸附剂和浸提液质量比为0.05:1，振荡吸附30min，振荡功率为80r/min过滤，所述吸附剂由质量比为5:1:4的活性白土、不溶性壳聚糖和海藻酸钙制得，使用孔径为150um管式膜过滤器过滤，制得多酚滤液。
31.(4)萃取：将步骤(3)得到的多酚滤液使用饱和正丁醇和进行萃取，萃取时间10s，过滤，取水层，再用乙酸乙酯萃取5s，制得山茶花多酚粗提液，所述多酚滤液和饱和正丁醇体积比为1:2，所述水层和乙酸乙酯体积比为1:1。
32.(5)浓缩干燥：将步骤(4)制得的山茶花多酚粗提液进行浓缩干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为1h，制得山茶花多酚。
33.实施例2山茶花多酚的提取方法
34.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花冷冻粉碎冷冻时间为15min，冷冻温度为2℃，将冷冻后的山茶花使用料理机粉碎，过14目筛。
35.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:10，超声提取时间为40min，超声频率为20khz，超声功率为25w，超声温度为50℃，制得提取液，所述生物酶由质量比为3:5:1.5的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得，按质量百分比计，所述提取液由40％的丙酮、1.5％的生物酶、5％体积分数为50％冰醋酸和余量的水制得。
36.(3)过滤：将吸附剂加入步骤(2)制得的浸提液中，吸附剂和浸提液质量比为0.1:1，振荡吸附40min，振荡功率为100r/min过滤，所述吸附剂由质量比为10:3:7的活性白土、不溶性壳聚糖和海藻酸钙制得，使用孔径为150um管式膜过滤器过滤，制得多酚滤液。
37.(4)萃取：将步骤(3)得到的多酚滤液使用饱和正丁醇和进行萃取，萃取时间15s，过滤，取水层，再用乙酸乙酯萃取10s，制得山茶花多酚粗提液，所述多酚滤液和饱和正丁醇体积比为1:3，所述水层和乙酸乙酯体积比为1:2。
38.(5)浓缩干燥：将步骤(4)制得的山茶花多酚粗提液进行浓缩干燥，干燥温度为70℃，干燥时间为2h，制得山茶花多酚。
39.实施例3山茶花多酚的提取方法
40.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花冷冻粉碎冷冻时间为13min，冷冻温度为
‑
1℃，将冷冻后的山茶花使用料理机粉碎，过14目筛。
41.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:8，超声提取时间为35min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃，制得提取液，所述生物酶由质量比为2:3:1的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得，按质量百分比计，所述提取液由30％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
42.(3)过滤：将吸附剂加入步骤(2)制得的浸提液中，吸附剂和浸提液质量比为0.2:1，振荡吸附35min，振荡功率为90r/min过滤，所述吸附剂由质量比为7:2:5的活性白土、不溶性壳聚糖和海藻酸钙制得，使用孔径为150um管式膜过滤器过滤，制得多酚滤液。
43.(4)萃取：将步骤(3)得到的多酚滤液使用饱和正丁醇和进行萃取，萃取时间12s，过滤，取水层，再用乙酸乙酯萃取8s，制得山茶花多酚粗提液，所述多酚滤液和饱和正丁醇体积比为1:2.5，所述水层和乙酸乙酯体积比为1:1.5。
44.(5)浓缩干燥：将步骤(4)制得的山茶花多酚粗提液进行浓缩干燥，干燥温度为65℃，干燥时间为1.5h，制得山茶花多酚。
45.对比例1超声时间
46.在实施3的基础上，调整超声时间，具体为，分为以下几个处理：
47.处理1：超声提取时间为10min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
48.处理2：超声提取时间为20min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
49.处理3：超声提取时间为30min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45
℃。
50.处理4：超声提取时间为35min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
51.处理5：超声提取时间为40min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
52.处理6：超声提取时间为45min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
53.处理7：超声提取时间为50min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
54.处理8：超声提取时间为60min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃。
55.处理1～8山茶花多酚的制备方法为：
56.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花冷冻粉碎13min，冷冻温度为
‑
1℃，将冷冻后的山茶花使用料理机粉碎，过14目筛。
57.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:8，超声提取，所述生物酶由质量比为2:3:1的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得，按质量百分比计，所述提取液由30％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
58.(3)浓缩干燥：将步骤(2)制得的浸提液进行浓缩干燥，干燥温度为65℃，干燥时间为1.5h，制得山茶花多酚。
59.对比例2丙酮使用量
60.在实施3的基础上，调整丙酮在提取液中的占比，具体为，分为以下几个处理：
61.处理1：按质量百分比计，所述提取液由10％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
62.处理2：按质量百分比计，所述提取液由15％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
63.处理3：按质量百分比计，所述提取液由20％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
64.处理4：按质量百分比计，所述提取液由30％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
65.处理5：按质量百分比计，所述提取液由40％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
66.处理6：按质量百分比计，所述提取液由45％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
67.处理7：按质量百分比计，所述提取液由50％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
68.处理8：按质量百分比计，所述提取液由70％的丙酮、1％的生物酶、3％体积分数为45％冰醋酸和余量的水制得。
69.处理1～8的山茶花多酚制备方法如下：
70.(1)山茶花粉末的制备：将山茶花冷冻粉碎13min，冷冻温度为
‑
1℃，将冷冻后的山
茶花使用料理机粉碎，过14目筛。
71.(2)浸提液的制备：将山茶花粉末加入提取液中，料液重量比为1:8，超声提取时间为35min，超声频率为15khz，超声功率为23w，超声温度为45℃，制得提取液，所述生物酶由质量比为2:3:1的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得。
72.(3)浓缩干燥：将步骤(2)制得的浸提液进行浓缩干燥，干燥温度为65℃，干燥时间为1.5h，制得山茶花多酚。
73.对比例3
74.在实施3的基础上，区别在于将丙酮分别替换成乙醇和乙酸乙酯。
75.对比例4
76.在实施3的基础上，区别在于步骤(3)中使用大孔树脂进行过滤，具体为浸提液经dm130大孔树脂吸附后，用3倍树脂量(ml/g)的蒸馏水洗脱杂质，杂质洗脱完全后，再以10倍树脂量(ml/g)的浓度为40％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，制得多酚滤液。
77.对比例5
78.在实施3的基础上，区别在于将生物酶中原料等量使用，具体为生物酶由质量比为1:1:1的纤维素酶、离析酶和超氧化物歧化酶制得。
79.试验例1
80.实施例1～3和对比例1～5的制备方法分别使用500g云南腾冲山茶花为原料进行提取山茶花多酚，检测制得的山茶花多酚提取率和纯度。
81.检测方法：纯度检测：参照福林酚检测法gb/t 8313
‑
2008。
82.溶液的配制：
83.(1)没食子酸标准溶液：分别配制没食子酸标准液浓度为10、20、30、40、50ug/ml。
84.(2)山茶花多酚供试品溶液：称取0.015g山茶花多酚于200ml容量瓶，加水稀释至刻度。
85.(3)溶剂空白：水。
86.(4)分别移取没食子酸标准溶液、山茶花多酚供试品溶液和溶剂空白各1ml于20ml试管内，每个试管内分别加5.0ml 10％的福林酚，摇匀；反应5min，加入4.0ml7.5％na2co3溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下放置60min。
87.检测条件：
88.使用紫外可见分光光度计，检测波长为765nm。
89.计算公式：多酚纯度(％)＝样品吸光度
×
样品体积
×
稀释因子/没食子酸标准曲线斜率/样品质量/106×
100
90.提取率(％)＝山茶花多酚重量/山茶花粉末重量
×
100
91.实施例1～3和对比例4～5实验结果：
92.名称提取率(％)纯度(％)实施例119.8895.7实施例219.9096.1实施例319.7196.7对比例421.2387.9对比例519.9990.1
93.试验结果表明，本发明的制备方法可以有效提高山茶花多酚的提取率和纯度。对比例4，使用大孔树脂进行过滤，导致纯度下降，因此提取率高于实施例。对比例5将生物酶中原料等量使用，导致提取率和纯度均有明显下降。
94.对比例1中处理1～8实验结果：
95.名称纯度(％)处理164.5处理263.7处理376.4处理477.5处理575.4处理668.7处理763.7处理859.6
96.实验结果表明，由于处理1～8未进行吸附过滤处理，随着超声时间的延长，其他大分子杂质同时析出，导致纯度下降。处理3～5为本发明的优选超声时间，在超声时间30～40min中，多酚纯度最高。
97.对比例2中处理1～8实验结果
[0098][0099][0100]
实验结果表明，随着丙酮在提取液中的占比增大，纯度出现先增加后下降的趋势，有机溶剂过多不但没有带来更好的提取效果，反而导致效果下降，由于过多的有机溶剂导致山茶花中蛋白质变性，造成多酚难以析出。
[0101]
对比例3中不同有机溶剂的实验结果
[0102]
名称纯度(％)
乙醇67.9乙酸乙酯62.8
[0103]
实验结果表明，本发明所采用的有机溶剂提取效果优于乙醇和乙酸乙酯。
[0104]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。