可受微小RNA调控的分离的重组溶瘤痘病毒及其应用的制作方法

122、mir-124、mir-125a、mir-125b、mir-126、mir-127、mir-128、mir-133b、mir-139、mir-140、mir-142、mir-143、mir-145、mir-181、mir-192、mir-195、mir-198、mir-199a、mir-199b、mir-200、mir-203、mir-204、mir-205、mir-218、mir-219、mir-220、mir-224、mir-345、mir-375；优选mir-199a和mir-199b。
9.(3)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，该重组溶瘤痘病毒是tk基因功能缺陷型的和/或vgf基因功能缺陷型的。
10.(4)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述微小rna的所述靶序列是重复的，所述重复包含2-8个重复。
11.(5)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源il-21基因，并且该il-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
12.(6)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述tk基因通过插入外源核苷酸序列而使该tk基因功能缺陷。
13.(7)根据(5)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源il-21基因插入在所述tk基因中，从而使该tk基因功能缺陷。
14.(8)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述vgf基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该vgf基因功能缺陷。
15.(9)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒是wr株或惠氏株。
16.(10)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或lacz基因。
17.(11)根据(5)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源il-21基因来自于小鼠或人。
18.(12)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。
19.(13)根据(12)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含1
×
10
5-5
×
109pfu的所述重组溶瘤痘病毒。
20.(14)根据(12)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
21.(15)一种用于制备(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒的载体。
22.(16)根据(15)所述的载体，其中所述载体包含在启动子控制下的外源il-21基因。
23.(17)一种含有(15)或(16)所述的载体的宿主细胞。
24.(18)根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
25.(19)根据(18)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
26.(20)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒。
27.(21)根据权利要求20所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为1
×
10
5-5
×
109pfu，每天1次，连续施用1-6天；或每2天1次，连续施用1-6次。
28.(22)根据(20)所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
29.(23)根据(20)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
30.本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
31.经过深入的研究和实验，本发明在溶瘤痘病毒的基因组中选择出特定的必需基因e10r，并提出在e10r的3’utr区(3’非翻译区)插入外源核苷酸序列，该外源核苷酸序列包含特定微小rna的靶序列，其中所述微小rna的表达量在肿瘤细胞中比在正常细胞中低。这样在感染该溶瘤痘病毒的正常细胞中，高表达的所述微小rna能够靶定到所述溶瘤痘病毒e10r的3’utr区对应的mrna，通过降解mrna或阻碍其翻译，来抑制e10r的表达，从而抑制所述溶瘤痘病毒的复制。而在感染该溶瘤痘病毒的肿瘤细胞中所述微小rna低表达或不表达，因而e10r的表达不被抑制，从而保持所述溶瘤痘病毒的复制能力。因此本发明利用体内正常组织与肿瘤组织内特定微小rna表达量不同的特点，来提供一种对肿瘤细胞具有更高、更明显的选择性的新型重组溶瘤痘病毒。本发明人惊奇地发现，本发明的重组溶瘤痘病毒在多种肿瘤细胞中的复制均明显高于正常细胞，从而具有更好的肿瘤特异性、安全性，并且能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
32.此外，本发明进一步选择了微小rna的种类，发现多种微小rna(优选mir-199)能够有效地实现本发明的目的，所得重组溶瘤痘病毒显示了更强的肿瘤选择性和安全性。
33.本发明的新型重组溶瘤痘病毒可进一步包括tk和/或vgf基因失活，从而实现了更强的肿瘤细胞选择性，与已有的溶瘤痘病毒(例如tk和/或vgf缺陷痘病毒)相比，其在正常细胞中的复制及对正常细胞的杀伤显著降低。
34.此外，本发明进一步使所述新型溶瘤痘病毒同时携带免疫调控因子il-21的基因，从而使所得的重组溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，并且表达免疫调控因子il-21。这样能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥外源il-21的抗肿瘤免疫作用。本发明发现在溶瘤痘病毒中整合il-21基因，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和il-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。
35.由此，本发明为癌症治疗提供了更加丰富和有效的产品线，能够提供效果更好、肿瘤特异性更高、更加安全的产品。
附图说明
36.图1示出制备例1中质粒pzb-e10r-mir199t构建流程图。
37.图2示出制备例1中pzb-e10r-mir199t质粒的鉴定结果；其中泳道m为dna marker iii(dna分子量标记iii)，泳道1为pzb-e10r-mir199t条带。
38.图3示出制备例2中构建的vsc20-mt/mcherry骨架病毒的单克隆重组溶瘤病毒鉴定结果；其中m泳道为dna分子量标记，泳道1为vsc20-mt/mcherry条带，泳道2为vsc20条带，泳道3为阴性对照(无dna样本)。
39.图4示出制备例2中构建的vsc20-mt/mcherry溶瘤病毒载体的结构。
40.图5示出制备例3中构建的mitdvv-mcherry骨架病毒的单克隆重组溶瘤病毒鉴定结果；其中m泳道为dna分子量标记，泳道1为mitdvv-mcherry条带，泳道2为vsc20-mt/
mcherry条带，泳道3为阴性对照(无dna样本)。
41.图6示出制备例3中构建的mitdvv-mcherry溶瘤病毒载体的结构。
42.图7示出制备例4中构建的mitdvv-hil21-mcherry溶瘤病毒的单克隆重组溶瘤病毒鉴定结果；其中m泳道为dna分子量标记，泳道1为mitdvv-hil21-mcherry条带，泳道2为ddvv-hil21条带，泳道3为阴性对照(无dna样本)。
43.图8示出制备例4中构建的mitdvv-hil21-mcherry溶瘤病毒的结构。
44.图9a示出制备例5中用pcr法确认mitdvv骨架病毒及mitdvv-hil21溶瘤病毒中包含mir199t序列及不含mcherry序列；其中m泳道为dna分子量标记，泳道1为mitdvv条带，泳道2为mitdvv-mcherry条带，泳道3为阴性对照(无dna样本)，泳道4为ddvv-hil21条带，泳道5为mitdvv-hil21-mcherry条带。图9b示出制备例5中用pcr法确认mitdvv骨架病毒缺失了tk基因；其中m泳道为dna分子量标记，泳道1为mitdvv条带，泳道2为vsc20条带，泳道3为阴性对照(无dna样本)。
45.图10示出制备例5中构建的mitdvv骨架病毒及mitdvv-hil21溶瘤病毒的结构。
46.图11示出实施例1中mitdvv骨架病毒在正常细胞和肿瘤细胞内的复制比较。如图可知mitdvv骨架病毒在人正常细胞huvec中复制低于在人肿瘤细胞hela中复制，呈现明显肿瘤选择性复制功能。其中图11a示出mitdvv骨架病毒分别感染huvec细胞(左柱)和hela细胞(右柱)后24小时后的病毒含量，图11b示出mitdvv骨架病毒分别感染huvec细胞(左柱)和hela细胞(右柱)后48小时后的病毒含量；图11c示出mitdvv骨架病毒在hela细胞内复制与在huvec细胞内复制的比值。图11a和b中x轴为不同的细胞，y轴为每毫升培养液中病毒含量；图11c中x轴为病毒在hela细胞与huvec细胞中复制的比例，y轴为病毒感染时间。
47.图12示出实施例2中mitdvv骨架病毒与ddvv骨架病毒对正常细胞株的体外杀伤比较。如图可知ddvv病毒骨架对正常细胞mrc-5的杀伤作用明显强于mitdvv溶瘤病毒骨架。其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量(moi)，y轴为相应的杀伤率的百分比数值，灰色柱子表示ddvv病毒感染，黑色柱子表示mitdvv病毒感染。
48.图13示出实施例3中mitdvv骨架病毒与ddvv骨架病毒在正常细胞内的复制比较。如图可知ddvv溶瘤病毒骨架在正常细胞mrc-5内的复制明显高于mitdvv溶瘤病毒骨架。其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量(moi)，y轴为相应的每ml培养体系中病毒基因的拷贝数，灰色柱子表示ddvv病毒感染，黑色柱子表示mitdvv病毒感染。
49.图14示出实施例4中mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对正常细胞的杀伤比较。如图可知ddvv-hil21溶瘤病毒对正常细胞mrc-5的杀伤作用明显强于mitdvv-hil21溶瘤病毒。其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量(moi)，y轴为相应的细胞生长抑制率的百分比数值，黑色柱子表示mitdvv-hil21病毒感染，灰色柱子表示ddvv-hil21病毒感染。
50.图15示出实施例5中mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒在正常细胞内的复制比较。如图可知ddvv-hil21溶瘤病毒在正常细胞mrc-5内的复制明显高于mitdvv-hil21溶瘤病毒。其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量(moi)，y轴为每毫升培养体系中病毒基因的拷贝数，灰色柱子表示ddvv-hil21溶瘤痘病毒感染，黑色柱子表示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒感染。
51.图16示出实施例6中mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在正常细胞和肿瘤细胞内的复制比较。如图可知mitdvv-hil21溶瘤病毒在正常细胞mrc-5内复制低于在肿瘤细胞a549内的复
制。图16a示出不同滴度病毒感染细胞后的病毒含量，其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量(moi)，y轴为每毫升培养体系中病毒基因的拷贝数，灰色柱子表示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒感染正常细胞，黑色柱子表示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒感染肿瘤细胞。图16b示出mitdvv-hil21溶瘤病毒在肿瘤细胞a549内的复制与在正常细胞mrc-5内复制的倍数，其中x轴为溶瘤病毒在a549细胞中复制与在mrc-5细胞中复制的倍数，y轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量。
52.图17示出实施例7中mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对不同肿瘤细胞株的体外杀伤作用。图17a-g分别为fadu细胞(a)、a549细胞(b)、lovo细胞(c)、mnng/hos c1细胞(d)、sk-hep-1细胞(e)、panc-1细胞(f)、u251细胞(g)的结果。其中x轴为处理细胞所用的不同的病毒感染量moi的log值(lg moi)，y轴为相应的抑制率的百分比数值，实心点为mitdvv-hil21溶瘤痘病毒的抑制率，空心方块为阳性对照10μm紫杉醇的抑制率。
53.图18示出实施例8中不同细胞中mir-199的表达水平。其中x轴为不同肿瘤细胞株，y轴为mir-199相对表达量。黑色柱子表示高表达株，灰色柱子表示中表达细胞株，白色柱子表示低表达细胞株。
54.图19示出实施例8中的mitdvv-hil21溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤作用与mir-199表达的相关性。其中x轴为不同肿瘤细胞株，y轴为细胞存活率的百分比数值。
55.图20示出实施例9中对hct116细胞稳转mir-199片段的验证。图20a示出使用细胞流式仪检测gfp表达的结果，其中左图为空白对照组(hct116细胞株)结果，中图为阴性对照细胞株hct116-mirnc结果，右图为稳定表达mir-199的hct116-mir199细胞株结果；图20b示出定量pcr检测mir-199的表达的结果，其中x轴为不同细胞株，y轴为mir-199相对表达量。
56.图21示出实施例9中用mitdvv-hil21溶瘤病毒感染高表达mir-199的肿瘤细胞的结果。如图可知高表达mir-199的肿瘤细胞明显抑制mitdvv-hil21溶瘤病毒的细胞杀伤作用。其中x轴为不同的病毒感染量(moi)，y轴为相应的细胞生长抑制率的百分比数值，白色柱子表示感染hct116-mirnc的细胞株，黑色柱子表示感染hct116-mir199的细胞株。
57.图22示出实施例10中mitdvv-hil21溶瘤病毒对结直肠癌的抑瘤作用。图22a示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，肿瘤体积随时间的变化；如图可知mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够有效地抑制肿瘤的生长；其中x轴为给药后时间，y轴为肿瘤体积，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。图22b示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，相对肿瘤生长率t/c(％)随时间的变化；如图可知从给药后第10天开始，mitdvv-hil21给药组的相对肿瘤生长率小于40％；其中x轴为给药后时间，y轴为t/c(％)，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21。图22c示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，小鼠体重随时间的变化；如图可知在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降；其中x轴为给药后时间，y轴为小鼠体重，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。
58.图23示出实施例11中mitdvv-hil21溶瘤病毒对人骨肉瘤的抑瘤作用。图23a示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，肿瘤体积随时间的变化；如图可知mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够有效地抑制肿瘤的生长；其中x轴为给药后时间，y轴为肿瘤体积，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。图23b示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，相对肿瘤生长率t/c(％)随时间的变化；如图可知从给药后第8天开始，给药
组的相对肿瘤生长率小于40％；其中x轴为给药后时间，y轴为t/c(％)，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21。图23c示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，小鼠体重随时间的变化；如图可知在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降；其中x轴为给药后时间，y轴为小鼠体重，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。
59.图24示出实施例12中mitdvv-hil21溶瘤病毒对人肝癌的抑瘤作用。图24a示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，肿瘤体积随时间的变化；如图可知mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够有效地抑制肿瘤的生长；其中x轴为给药后时间，y轴为肿瘤体积，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。图24b示出瘤内注射mitdvv-hil21溶瘤痘病毒后，小鼠体重随时间的变化；如图可知在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降；其中x轴为给药后时间，y轴为小鼠体重，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射pbs。
60.图25示出实施例13中评价mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对不同mir-199表达水平的肿瘤细胞的杀伤作用。其中x轴为不同类别肿瘤细胞，y轴细胞生长抑制率，黑色柱子表示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒，灰色柱子表示ddvv-hil21溶瘤痘病毒。
61.图26示出实施例14中mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对不同mir-199表达水平的荷瘤小鼠的抑瘤效果比较。图26a示出在低表达mir-199的人结直肠癌hct116的荷瘤小鼠中，瘤内注射溶瘤痘病毒后，肿瘤体积随时间的变化；其中x轴为给药后时间，y轴为肿瘤体积，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射ddvv-hil21；如图可知mitdvv-hil21抑瘤作用比ddvv-hil21略强。图26b示出在高表达mir-199的人骨肉瘤mnng/hos c1的荷瘤小鼠中，瘤内注射溶瘤痘病毒后，肿瘤体积随时间的变化；其中x轴为给药后时间，y轴为肿瘤体积，实心方块表示瘤内注射mitdvv-hil21，空心方块表示瘤内注射ddvv-hil21；如图可知mitdvv-hil21抑瘤作用比ddvv-hil21弱。
62.图27示出实施例15中mitdvv-hil21与ddvv-hil21溶瘤痘病毒在小鼠体内的组织分布。图27a-f分别示出mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒在小鼠卵巢、子宫、脾、肝、肺、外周血中的分布。其中x轴为给药后时间，y轴为组织中病毒含量，黑色柱子表示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒，灰色柱子表示ddvv-hil21溶瘤痘病毒。
63.图12-15、22-25中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001(与相应的对照组比较，使用one-way anova统计分析法得到)。
具体实施方式
64.以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
65.在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
66.本文所用的词语“溶瘤病毒”或“溶瘤痘病毒”是指能够选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的病毒或痘病毒。
67.本文所用的词语“治疗有效量”是指功能药剂或药物组合物能够表现出可检测的治疗效果或抑制效果的量，或者起到抗肿瘤效果的量。所述效果可以通过本领域任何已知
的检验方法检测。
68.本文所用的词语“给药”或“施用”是指向受试者提供化合物、复合物或组合物(包括病毒和细胞)。
69.本文所用的词语“患者”是指人或非人类生物。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类疾病和兽类疾病。在一些实施方案中，患者患有肿瘤。在一些例子中，患者同时患有一种或多种类型的癌症。
70.本文所用的词语“协同效果”是指两种或多种药剂共同起到的效果，该效果大于其中各药剂的单独效果的总和。
71.本文所用的术语“pfu”或“蚀斑形成单位”(plague forming unit)是指：产生一个蚀斑的病毒量称为一个蚀斑形成单位(pfu)。
72.本文所用的术语“moi”或“感染复数”(multiplicity of infection)也即，病毒与细胞个数比，是指用以起始病毒感染的每个细胞感染病毒颗粒的粒数。moi＝pfu/细胞，即细胞个数
×
moi＝总pfu。
73.基于使用内源性微小rna(microrna(mirna))来控制病毒复制的策略已经被广泛应用(参见文献“et al.,generation of a conditionally replicating adenovirus based on targeted destruction of e1a mrna by a cell type-specific microrna.j virol 82:11009-11015.2008”)。mirna是一段20-24bp小核酸分子，通过与特定靶基因的非编码区序列结合，对靶基因的表达或翻译后的蛋白修饰发挥着重要的生物学作用(参见文献“ambros et al.,the functions of animal micrornas.nature 431:350-355 2004”)。在癌症研究中发现一系列mirna小分子在肿瘤发展过程中的表达发生明显变化(参见文献“negrini et al.,micrornas in human cancer:from research to therapy.j cell sci 120:1833-1840.2007”)，呈现多靶点调控与癌症相关的基因，比如mtor、c-met、hif-1α和cd44等(参见文献“fornari et al.,mir-199a-3p regulates mtor and c-met to influence the doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells.cancer res 70:5184-5193.2010”；“kim et al.,microrna mir-199a regulates the met proto-oncogene and the downstream extracellular signal-regulated kinase 2(erk2).j biol chem 283:18158-18166.2008”；“jia et al.,lentivirus-mediated overexpression of microrna-199a inhibits cell proliferation of human hepatocellular carcinoma.cell biochem biophys,62:237
–
44.2011”；“henry et al.,mir-199a-3p targets cd44 and reduces proliferation of cd44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.biochem biophys res commun 403:120-125.2010”)。
74.为了提供一种对肿瘤细胞具有明显的选择性的新型重组溶瘤痘病毒，本发明的发明人经过深入的研究和实验摸索，在溶瘤痘病毒的基因组中选择出特定的必需基因e10r，并提出在e10r的3’utr区(3’非翻译区)插入外源核苷酸序列，该外源核苷酸序列包含特定微小rna的靶点序列，其中所述微小rna的表达量在肿瘤细胞中比在正常细胞中低。这样在感染该溶瘤痘病毒的正常细胞中，高表达的所述微小rna能够靶定到所述溶瘤痘病毒e10r的3’utr区对应的mrna，通过降解mrna或阻碍其翻译，来抑制e10r的表达，从而抑制所述溶瘤痘病毒的复制。而在感染该溶瘤痘病毒的肿瘤细胞中所述微小rna低表达或不表达，因而
e10r的表达不被抑制，从而保持所述溶瘤痘病毒的复制能力。因此本发明利用体内正常组织与肿瘤组织内会发生特定微小rna表达量不同的特点，来提供一种对肿瘤细胞具有更高更明显的选择性的新型重组溶瘤痘病毒。本发明人惊奇地发现，本发明的重组溶瘤痘病毒在多种肿瘤细胞中的复制均明显高于正常细胞，从而具有更好的肿瘤特异性、安全性，并且能够显著抑制肿瘤细胞的生长。进一步而言，由于该新型重组溶瘤痘病毒仅能在缺乏特定微小rna的肿瘤细胞中复制，因此能获得更强的肿瘤细胞选择性，并减低该病毒对正常组织的作用。
75.基于以上构思，本发明提供了一种分离的重组溶瘤痘病毒，该重组溶瘤痘病毒能够受微小rna调控，所述微小rna的表达量在哺乳动物的肿瘤细胞中比在同种哺乳动物的正常细胞中低，其中该重组溶瘤痘病毒基因组中的e10r基因的3’utr区域中整合有所述微小rna的靶序列。
76.所述微小rna的表达量在哺乳动物的肿瘤细胞中比在同种哺乳动物的正常细胞中低，是指所述微小rna的表达量在哺乳动物的至少一种肿瘤细胞中比在同种哺乳动物的至少一种正常细胞中低。所述哺乳动物包括人。
77.本发明发现，所述重组溶瘤痘病毒在肿瘤细胞中的复制明显高于正常细胞，并且能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
78.所述微小rna包括本领域已知的在肿瘤细胞中表达量低或不表达的那些，也包括根据本领域技术测定得知其在肿瘤细胞中表达量低或不表达的那些。所述微小rna可以选自：mir-9、mir-15a、mir-16、mir-26a、mir-27b、mir-29b、mir-30a、mir-32、mir-33、mir-34、mir-95、mir-101、mir-122、mir-124、mir-125a、mir-125b、mir-126、mir-127、mir-128、mir-133b、mir-139、mir-140、mir-142、mir-143、mir-145、mir-181、mir-192、mir-195、mir-198、mir-199a、mir-199b、mir-200、mir-203、mir-204、mir-205、mir-218、mir-219、mir-220、mir-224、mir-345、mir-375；优选mir-199a、mir-199b。其中，mir-199(包括mir-199a和mir-199b)能够最有效地实现本发明的目的，所得重组溶瘤痘病毒显示了更强的肿瘤选择性和安全性。在本发明中，mirna是包含mirna前体和成熟的mirna中任一种的概念，但在没有特别说明的情况下，其是指成熟的mirna。
79.在本说明中，上述微小rna的名称编号是本领域公认和熟知的(例如mirna成熟体简写成mir、高度同源的mirna在数字后加上英文小写字母等，如mir-199a和mir-199b那样)，其分别具有特定的已知的核苷酸序列，可在mirbase公共数据库网址(http://www.mirbase.org/)中查询到具体核苷酸序列。
80.成熟的mirna(mature rna)或mirna成熟体是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的。初级转录物(pri-mirna)长度从几百到几千个碱基不等，带有5’端帽子和3'poly a尾巴，以及一到数个发夹茎环结构。初级转录物经剪切产生约70个碱基的mirna前体，即pre-mirna。mirna前体(pre-mirna)经进一步剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟mirna。在细胞内，通常可以存在作为前体的pri-mirna和pre-mirna，以及成熟的mirna。本说明书中，mirna是包含mirna前体和成熟的mirna中任一种的概念，但在没有特别说明的情况下，其是指成熟的mirna。
81.优选地，所述微小rna的所述靶序列是重复的，所述重复优选包含2-8个重复，更优选包含3-4个重复。在一些实施方案中，所述微小rna的重复靶序列被2个或更多个核苷酸的
间隔区(例如，gg、cc、ggcc)隔开。所述重复的mirna的靶序列可以是mirna的反向互补序列(reverse complement)。
82.优选地，重组溶瘤痘病毒是tk基因功能缺陷型的和/或vgf基因功能缺陷型的。这样构建的溶瘤痘病毒实现了更强的肿瘤细胞选择性，与已知的溶瘤痘病毒(例如tk/vgf双缺陷痘病毒)相比，其在正常细胞中的复制及对正常细胞的杀伤显著降低。
83.本发明在提及溶瘤病毒的基因时所使用的术语“功能缺陷”是指该溶瘤病毒无法发挥该基因应有的功能，即功能丧失，该目的可通过(例如)在基因中插入外源片段或敲除该基因而实现。
84.因此，可以在所述tk基因中插入外源核苷酸序列，从而使其功能缺陷。也可以在所述vgf基因中插入外源核苷酸序列和/或敲除该基因，从而使其功能缺陷。
85.优选地，所述重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源il-21基因，并且该il-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
86.il-21(即白细胞介素-21(interleukin-21))是一种多向性i型细胞因子，主要由t细胞产生，调节先天免疫和获得性免疫应答，在抗肿瘤免疫反应中发挥了重要作用。已有文献报道il-21对各类免疫细胞及信号转导的作用(参见文献：“leonard,w.j.&wan,c.il-21signaling in immunity.f1000research 5,1
–
10(2016).”)，各类免疫细胞主要包括：1)cd4

t细胞：促进增殖、产生细胞因子；t
fh
细胞：促进分化、提高发育中心功能；t
h17
细胞：促进分化、增殖；treg细胞：抑制其产生与存活；2)nkt细胞：增殖、增强细胞毒性；3)cd8

t细胞：提升细胞毒性、增殖和/或存活、抗肿瘤作用；4)nk细胞：促进细胞成熟、增殖、提高细胞毒性作用、增强抗肿瘤活性；5)dc细胞：抑制抗原递呈功能、诱导凋亡；6)巨噬细胞：提升吞噬作用；7)b细胞：促进增殖和/或凋亡、促进浆细胞分化和免疫球蛋白的生成；8)另外il-21可激活多种与肿瘤相关信号通道，包括jak/stat、mark/pi3k等信号通道，调控肿瘤的发展过程。在肿瘤免疫治疗中，激活nk细胞和cd8

t细胞的细胞毒性是关键，许多研究已充分表明il-21在这一程序中起着重要作用。il-21促进nk细胞成熟使其产生ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素，诱发nk细胞介导的抗肿瘤细胞毒性作用，及通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(adcc)提升nk细胞的杀伤力(参见文献：“spolski,r.&leonard,w.j.interleukin-21:a double-edged sword with therapeutic potential.nat.rev.drug discov.13,379
–
395(2014).”)。其次，il-21通过诱导cd8

t细胞的增殖、诱导记忆t细胞的生成、促进ifnγ/颗粒酶b的分泌等，以增强cd8

t细胞对肿瘤的杀伤和有利于对复发肿瘤细胞产生记忆性免疫应答。重要的是不同于il-2，il-21不会诱导treg细胞的扩增，也进一步增强了cd8

t细胞的免疫功能应答(参见文献：“spolski,r.&leonard,w.j.interleukin-21:a double-edged sword with therapeutic potential.nat.rev.drug discov.13,379
–
395(2014).”)。基于il-21对免疫细胞的多样化作用，体现了il-21可在肿瘤微环境内“重新活化”多种效应细胞。
87.本发明通过在新型溶瘤痘病毒的基因组中插入能够调节免疫的il-21基因，进一步强化了溶瘤病毒的抗肿瘤作用。这样不仅能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥外源il-21的抗肿瘤免疫作用。本发明发现在溶瘤痘病毒中整合il-21基因，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和il-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。
88.优选地，将外源il-21基因插入到tk基因中，这样能够使该tk基因发生功能缺陷，
并且在感染肿瘤细胞之后能够表达il-21基因。
89.在本发明中，可使用的痘病毒包括惠氏株或wr株，wr株的一个例子为vsc20。
90.在一个优选的实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒是对vsc20痘病毒进行基因改造而得到的。vsc20痘病毒是vgf基因缺失的痘病毒，其中在c11r位点插入lacz基因，制备方法可参见科技文献：“mccart,ja,et al.systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.cancer res(2001)61:8751
–
8757.”。所述基因改造包括在该vsc20痘病毒的e10r基因3’utr区域插入重复的特定微小rna的靶序列，例如mir-199(mir-199a-3p或mir-199b-3p)的靶序列。
91.在一些实施方案中，本发明利用基因工程的手段构建了含有e10r基因左右同源臂和重复的特定微小rna的靶序列的穿梭质粒，然后将该穿梭质粒引入到vsc20痘病毒中，通过重组机制获得e10r基因3’utr区域插入了重复的特定微小rna靶序列的重组病毒。构建穿梭质粒的一个具体实施方案的流程如图1所示。
92.所述基因改造还可以包括将外源序列(例如il-21基因)插入该vsc20痘病毒的tk基因中，从而使该tk基因功能缺陷，其具体方法如制备例3或4所述，或者可如中国专利公开cn109554353a所述，其全文以引用的方式并入本文。
93.所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还可以整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt(鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因、lacz基因、荧光蛋白基因(例如红色荧光蛋白基因)。优选不包括荧光蛋白基因，以避免荧光蛋白的表达在患者体内带来的安全隐患。
94.所述重组溶瘤痘病毒的基因组中也可以不整合有外源筛选基因。
95.在一些实施方案中，本发明通过分别使用痘病毒启动子p7.5控制gpt基因，以及人工合成痘病毒早/晚期启动子psel控制外源il-21基因，使用体外细胞内重组技术将gpt和il-21基因插入到痘病毒vsc20株的tk基因区中，以此构建溶瘤病毒，两个启动子以背靠背的方式分别启动各自调控基因的表达。
96.优选地，所述外源il-21基因来自于小鼠或人。
97.本发明的重组溶瘤痘病毒可通过生物工程领域的相关已知方法获得。
98.基于本发明开发的重组溶瘤痘病毒，本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。
99.优选地，所述药物组合物包含治疗有效量的所述重组溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，所述药物组合物的活性成分包括1
×
105至5
×
109pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒等)。
100.所述溶瘤病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
101.本发明的药物组合物还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(il-2)、il-15、il-17、il-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。如果包含其它活性成分，那么所述重组溶瘤痘病毒应独立地存在于所述药物组合物中而不与其它活性成分相互混合。例如，将重组溶瘤痘病毒独立地装在独立容器中。
102.本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物还可包含合适的可药用的辅料。
103.在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种可药用载体。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。例如，可以将化合物等活性成分与常见的赋形剂、稀释剂(例如磷酸盐缓冲液或生理盐水)、组织培养基、和载体(例如自体血浆或人血清白蛋白)进行配制，并作为悬浮剂施用。其它的载体可以包括脂质体、胶团、纳米胶囊、聚合纳米颗粒、固体脂颗粒(例如参见文献“e.koren and v.torchilin,life,63:586-595,2011”)。本发明的药物组合物的具体配制方法可参见科学文献和专利文献中的描述，例如参见最新版雷明登氏药物科学，maack出版公司，easton pa("remington's")。
104.本发明另一方面还提供了一种用于制备本发明所述的重组溶瘤痘病毒的载体。
105.所述载体可通过重组机制改造痘病毒内的e10r基因。例如，在一个具体实施方案中，如图4所示，重组载体包含e10r基因左右同源臂、重复的mir-199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列、及启动外源筛选基因mcherry/zeocin的表达框。优选地，所述载体还可通过重组机制使痘病毒内的tk基因发生功能缺陷。在另一个具体实施方案中，如图6所示，重组载体包含e10r基因左右同源臂、重复的mir-199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列、启动外源筛选基因mcherry/zeocin的表达框、及tk同源片段tk-l、tk-r。当痘病毒为wr株时，tk基因的序列为ncbi(即，美国国立生物技术信息中心，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov)的genbank中编号为nc_006998的痘病毒基因中第80724-81257bp所示的序列，则tk-l的序列可为例如第80724-80961bp所示序列片段，tk-r的序列可为例如第81033-81257bp所示序列片段。重复的mir-199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列插入位点可为例如e10r基因左侧同源臂第56974bp处。在另一个具体实施方案中，如图8所示，重组载体包含e10r基因左右同源臂、重复的mir-199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列、启动外源筛选基因mcherry/zeocin的表达框、tk同源片段tk-l、tk-r、及启动il-21基因和外源筛选基因gpt的表达框。该载体可通过细胞内重组机制使il-21基因表达框和gpt基因表达框插入到痘病毒的tk基因区中(使(例如)genbank中编号为nc_006998的痘病毒基因中第80962-81032bp所示的序列片段缺失)，从而使重组痘病毒丧失tk基因功能。重复的mir-199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列插入位点可为例如e10r基因左侧同源臂第56974bp处。
106.本发明另一方面还提供了一种含有本发明所述的载体的宿主细胞。
107.本发明另一方面还提供了本发明所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
108.所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
109.本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒。
110.所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
111.在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；或每2天1次，连续施用1-6次。所述治疗有效量优选为1
×
105至5
×
109pfu/天剂量(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量等)。
112.如果需要，还可以将本发明的重组溶瘤痘病毒与其它药物联合使用，例如白细胞介素-2(il-2)、il-15、il-17、il-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。
113.可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。
114.所述溶瘤病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
115.本发明还提供了一种治疗剂，包含：
116.(a)第一药物组合物，其中该第一药物组合物包含位于第一可药用载体中的本发明所述的重组溶瘤痘病毒；和
117.(b)第二药物组合物，其中该第二药物组合物包含位于第二可药用载体中的nk细胞。
118.在一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是相同的。在另一些实施方案中，所述第一可药用载体和第二可药用载体是不同的。
119.在一些情况下，所述治疗剂也可以理解为药物的组合。
120.所有溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的机制都大体相似。在不同实施方案中，通过瘤内注射或静脉给药的方式，溶瘤病毒与肿瘤细胞接触，感染进入肿瘤细胞内。由于溶瘤病毒的特性是，其主要在肿瘤细胞内复制增殖，而在正常细胞内低复制或不复制，因此被感染的肿瘤细胞中会出现大量的溶瘤病毒，造成肿瘤细胞的溶解和死亡。肿瘤细胞的溶解会释放出大量的肿瘤抗原和增殖的溶瘤病毒，抗原会进一步激活体内的免疫系统，刺激体内的nk细胞和t细胞继续攻击尚未死亡的肿瘤细胞，同时新的溶瘤病毒会继续感染尚未被感染的肿瘤细胞。
121.nk细胞是广谱型杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，nk细胞可以辨别肿瘤细胞与正常细胞的区别。nk通过与肿瘤细胞接触，识别确认其为非正常细胞，然后通过受体识别、抗体靶向识别(adcc)、颗粒酶分泌、穿孔素分泌和分泌干扰素间接杀伤等多种协同手段，达到杀死肿瘤细胞的效果。体外实验显示，一个健康的nk细胞在生命期内可以连续杀死27个肿瘤细胞。
122.nk细胞还具有抗病毒的功能。当正常细胞感染了病毒后，随着病毒的大量复制，细胞体现出衰老病变，体现在细胞膜上的蛋白簇的组成发生变化，在这个过程中，nk细胞就可以敏锐而高效地识别被感染的细胞，通过类似于杀伤肿瘤细胞的上述手段，杀死被感染的细胞，从而达到抑制病毒复制增殖的目的。随后在抗原刺激和干扰素等因子的作用下，其它免疫细胞会持续作用，抵抗病毒。
123.本发明考虑了溶瘤病毒和nk细胞各自的特点，巧妙地将其联用，在联用时，nk细胞的抗病毒机制对于被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞同样适用，并且与其抗肿瘤机制互补。此外，联用还使得含有溶瘤病毒的肿瘤细胞成为了nk细胞的特异性靶标，从而增强了nk细胞的肿瘤杀伤作用。溶瘤病毒选择性地在癌细胞内增殖，在胞内起作用杀伤癌细胞，同时能够导致
癌细胞膜上的蛋白受体簇发生变化，增强nk细胞对癌细胞的识别，nk细胞在癌细胞外攻击，两者联合起来协同杀伤癌细胞，具有更好的治疗效果。进一步地，本发明所述的重组溶瘤痘病毒还优选同时表达外源il-21，而表达的外源il-21能够提升nk细胞的杀伤力从而进一步增强nk细胞的杀伤作用，使得本发明所述的重组溶瘤痘病毒与nk细胞的联用能够对肿瘤的杀伤效果产生令人惊奇的效果。
124.优选的是，所述第一药物组合物的活性成分为本发明所述的重组溶瘤痘病毒，并且所述第二药物组合物的活性成分为所述nk细胞。
125.优选地，所述第一药物组合物和所述第二药物组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
126.在本发明中，所述nk细胞可以选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。nk细胞的大规模体外扩增培养技术是已知的，并且已经基本成熟(参见(例如)以下科技文献：“somanchi ss,lee da.ex vivo expansion of human nk cells using k562engineered to express membrane bound il21.methods mol biol.2016；1441:175-93.”或“phan mt,lee sh,kim sk,cho d.expansion of nk cells using genetically engineered k562 feeder cells.methods mol biol.2016；1441:167-74.”)。临床数据证实自体nk细胞、半相合异体nk细胞(属于异体nk细胞)、以及脐血制备nk细胞回输人体后均无毒副作用，无长期依赖性，安全有效。
127.可用于治疗的nk细胞的纯度范围可以是：自体nk细胞的纯度可为大于等于85％，异体nk细胞的纯度可为大于等于90％；其中的杂质细胞可为nk-t和/或γδt细胞。优选地，nk细胞活性(存活率)大于等于90％，nk细胞杀伤力活性大于等于80％。
128.在本发明的所述联用治疗方案中，本发明进一步探索优化了溶瘤病毒和nk细胞各自的施用剂量，这是至关重要的。优选地，所述第一药物组合物包含1
×
10
5-5
×
109pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒(例如，1
×
10
5-3
×
109pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒、1
×
10
5-1
×
108pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒等)，并且所述第二药物组合物包含1
×
10
7-1
×
10
10
个细胞/天剂量的所述nk细胞(优选地，所述第二药物组合物包含1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞；还优选地，所述第二药物组合物包含1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞；更优选地，所述第二药物组合物包含1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞)。优选的是，该治疗剂的活性成分由1
×
105至5
×
109pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒等)和1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量的所述nk细胞(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞等)组成。
129.所述重组溶瘤痘病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
130.nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
131.本领域的技术人员可以理解，本发明的治疗剂还可包含合适的可药用的辅料。
132.本发明的治疗剂还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(il-2)、il-15、il-17、il-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿
瘤坏死因子-α(tnf-α)等。
133.在一些实施方案中，本发明的治疗剂包含一种或多种可药用载体。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。例如，可以将化合物等活性成分与常见的赋形剂、稀释剂(例如磷酸盐缓冲液或生理盐水)、组织培养基、和载体(例如自体血浆或人血清白蛋白)进行配制，并作为悬浮剂施用。其它的载体可以包括脂质体、胶团、纳米胶囊、聚合纳米颗粒、固体脂颗粒(例如参见文献“e.koren and v.torchilin,life,63:586-595,2011”)。本发明的治疗剂的具体配制方法可参见科学文献和专利文献中的描述，例如参见最新版雷明登氏药物科学，maack出版公司，easton pa("remington's")。
134.本发明的治疗剂可以治疗多种肿瘤和/或癌症，包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
135.本发明的治疗剂的施用方法为，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘病毒，然后，在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞。“在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞”是指首次nk细胞的施用与首次重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为24-48小时。
136.在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用nk细胞的条件即可。其中所述重组溶瘤痘病毒的施用和nk细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用所述重组溶瘤痘病毒，第2天施用nk细胞，第3天施用所述重组溶瘤痘病毒，第4天施用nk细胞
…
以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用所述重组溶瘤痘病毒，第2天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和nk细胞，第3天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和nk细胞，第4天依次施用所述重组溶瘤痘病毒和nk细胞
…
以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用所述重组溶瘤痘病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用nk细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用所述重组溶瘤痘病毒，在所述重组溶瘤痘病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用nk细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘
病毒，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，施用1次；并且在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞，所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，施用1次。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1
×
105至5
×
109pfu/天剂量(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量等)。
137.本发明还提供了本发明所述的治疗剂在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。
138.所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
139.本发明另一方面还提供了一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括装有本发明所述重组溶瘤痘病毒的第一容器和装有本发明所述nk细胞的第二容器，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及载明给药时机和给药方式的说明书。优选的是，该药盒由分别独立地装有本发明所述的重组溶瘤痘病毒和本发明所述的nk细胞的独立容器组成，以及载明给药时机和给药方式的说明书。
140.所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
141.优选地，装有本发明所述重组溶瘤痘病毒的第一容器包含治疗有效量的所述重组溶瘤痘病毒，并且装有nk细胞的第二容器包含足够提供1
×
10
7-1
×
10
10
个细胞/天剂量的所述nk细胞(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞等)。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1
×
105至5
×
109pfu/天剂量(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量等)。
142.优选地，所述装有所述重组溶瘤痘病毒的第一容器包含1
×
10
5-1
×
108pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述装有nk细胞的第二容器包含1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量的所述nk细胞。
143.在本发明中，所述nk细胞可以选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。
144.所述重组溶瘤痘病毒可采用其各自的本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
145.nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
146.所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
147.本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：
148.1)对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒；
149.2)在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的nk细胞。
[0150]“在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18-72小时(例如，第20-70小时、第22-48小时、第24-48小时、第30-48小时等)，对所述肿瘤和/或癌症患者施用本发明所述的nk细胞”是指首次nk细胞的施用与首次重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)，或首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。优选地，首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为18-72小时(例如，20-70小时、22-48小时、24-48小时、30-48小时等)。还优选地，首次nk细胞的施用与在其之前最相邻一次的所述重组溶瘤痘病毒施用的时间间隔为24-48小时。
[0151]
所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
[0152]
溶瘤病毒能够在肿瘤或癌症细胞中选择性复制，经过一定时间达到峰值。本发明的发明人发现，在经过一段时间的复制之后，肿瘤细胞里的溶瘤病毒会促进nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明提出的重组溶瘤痘病毒和nk细胞的施用顺序和间隔实现了两者作用峰值的双峰重叠。
[0153]
本发明进一步探索优化了所述重组溶瘤痘病毒和nk细胞各自的施用剂量，其与上述施用顺序和施用间隔的配合是至关重要的，其决定了所述重组溶瘤痘病毒的抗肿瘤疗效、nk细胞的抗肿瘤疗效、以及两者对肿瘤细胞的最佳协同杀伤。
[0154]
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每天1次，连续施用1-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，每天1次，连续施用1-6天。在本发明的另一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为治疗有效量，每2天1次，连续施用2-6天；并且所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，每2天1次，连续施用2-6天。无论本发明采用上述何种实施方案或其它实施方案，只要满足在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用nk细胞的条件即可。其中重组溶瘤痘病毒的施用和nk细胞的施用可以是间隔给药方式(例如，第1天施用重组溶瘤痘病毒，第2天施用nk细胞，第3天施用重组溶瘤痘病毒，第4天施用nk细胞
…
以此类推)；或依次给药方式(例如，第1天施用重组溶瘤痘病毒，第2天依次施用重组溶瘤痘病毒和nk细胞，第3天依次施用重组溶瘤痘病毒和nk细胞，第4天依次施用重组溶瘤痘病毒和nk细胞
…
以此类推)；或其它给药方式(例如首先施用重组溶瘤痘病毒，每天1次，连续施用1-6天，之后间隔18-72小时再施用nk细胞，每天1次，连续施用1-6天)。优选的是，首先施用重组溶瘤痘病毒，在重组溶瘤痘病毒全部施用之后间隔18-72小时再施用nk细胞。在本发明的一个优选实施方案中，对肿瘤和/或癌症患者首先施用所述重组溶瘤痘病毒，所述溶瘤病毒的施用剂量为治疗有效量，
施用1次；并且在施用所述溶瘤病毒之后的第18小时至72小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述nk细胞，所述nk细胞的施用剂量为1
×
107至1
×
10
10
个细胞/天剂量(例如，1
×
108至5
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至4
×
109个细胞/天剂量、1
×
109至3
×
109个细胞/天剂量)，施用1次。所述重组溶瘤痘病毒的治疗有效量优选为1
×
105至5
×
109pfu/天剂量(例如，1
×
105至3
×
109pfu/天剂量、1
×
105至1
×
108pfu/天剂量等)。
[0155]
可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。
[0156]
在本发明中，所述nk细胞可以选自自体nk细胞和异体nk细胞；优选地，所述nk细胞为经体外扩增得到的自体nk细胞或经体外扩增得到的异体nk细胞。
[0157]
所述肿瘤和/或癌症包括：肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤(例如脑胶质瘤)、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
[0158]
所述重组溶瘤痘病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。
[0159]
nk细胞可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如可通过静脉给药。
[0160]
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
[0161]
例子
[0162]
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
[0163]
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
[0164]
以下例子中所用的生物材料如下：
[0165]
1.cv1非洲绿猴肾细胞(培养基：10％fbs mem 1％p/s)来源于atcc，mrc-5人正常胚肺成纤维细胞(培养基：10％fbs dmem 1％p/s)来源于中国科学院上海细胞库，hek-293和hek-293t人胚肾细胞(培养基：10％fbs dmem 1％p/s)分别来源于agilent technologies和中国科学院上海细胞库，huvec人正常脐静脉内皮细胞(10％fbs h-004b 1％p/s)来源于上海澳赛尔斯有限公司。
[0166]
2.肿瘤细胞：肿瘤细胞来源及细胞培养基见下表a
[0167]
表a
significantly enhances antitumor therapymolecular therapy.(2014)；22 1,102-111”)，该病毒的tk基因和vgf基因均为功能缺陷型，且携带有外源红色荧光蛋白(rfp)基因。由于rfp基因仅起到筛选/报告作用，因此溶瘤痘病毒ddvv-rfp的抗肿瘤功能基本等同tk基因和vgf基因功能缺陷型的溶瘤痘病毒。溶瘤痘病毒ddvv-rfp也可采用本领域常规技术对vsc20痘病毒进行基因改造而得到。vsc20痘病毒是vgf基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“mccart,ja,et al.systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.cancer res(2001)61:8751
–
8757.”。所述基因改造包括使用人工合成痘病毒早/晚期启动子psel调控外源rfp基因，使用体外细胞内重组技术将rfp基因插入到痘病毒vsc20株的tk基因区中，从而构建得到溶瘤痘病毒ddvv-rfp。
[0173]
4.c57bl/6小鼠、balbc-nude小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。重度免疫缺陷型ncg小鼠得自江苏集萃药康生物科技有限公司。
[0174]
5.培养板：6孔细胞培养板、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板均得自corning(康宁)公司。
[0175]
6.gpt药物配制：使用0.1n naoh分别配制10mg/ml霉酚酸(400
×
)、10mg/ml 40
×
黄嘌呤(40
×
)、10mg/ml次黄嘌呤(670
×
)，避光-20℃储存。使用时配制1
×
工作液：取在40ml dmem内分别加入100μl的400
×
霉酚酸、40μl的40
×
黄嘌呤及60μl的670
×
次黄嘌呤，混匀，使用0.22μm滤膜过滤，备用。
[0176]
7.pbs配方：8mm na2hpo4、136mm nacl、2mm kh2po4、2.6mm kcl，ph7.2-7.4。
[0177]
8.病毒纯化液配方：60％(w/v)、50％(w/v)、40％(w/v)、30％(w/v)蔗糖溶液
[0178]
以下例子中所用的细胞计数方法如下：
[0179]
mtt法：每孔细胞中加入10μl mtt溶液(5mg/ml)，在37℃培养箱培养4～6小时，吸弃培养液，每孔加入150μl dmso，置摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解，使用酶标仪检测其在490nm处的吸光值(od490)。抑制率计算公式：细胞增殖抑制百分率(ir％)＝1-(od490供试品-od490空白)/(od490阴性对照-od490空白)
×
100％。
[0180]
以下例子中所用的缩写说明如下：
[0181]
mir199t：mir199(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)的靶序列
[0182]
fbs：胎牛血清
[0183]
p/s：青霉素-链霉素
[0184]
mcherry/zeocin：红色荧光蛋白/博莱霉素
[0185]
dmso：二甲亚砜
[0186]
制备例1：pzb-e10r-mir199t质粒构建
[0187]
为构建携带4个重复mir199t序列的穿梭质粒pzb-e10r-mir199t，首先用基因合成方法合成4
×
mir199t重复片段，每个片段之间使用gg连接，插入到痘病毒基因e10r的3’utr区(插入位点为e10r基因左侧同源臂第56974bp处)。然后插入由mh5启动子启动的mcherry/zeocin基因，其5’和3’端各含一个同向的loxp序列。mir199t的dna序列(seq id no.1)如下：5
’-
acagtagtctgcacattggtta-3’(其对应的mirna成熟体的mirbase数据库登录号为mimat0000232(hsa-mir-199a-3p)或mimat0004563(hsa-mir-199b-3p))。
[0188]
构建过程概括而言，利用含有痘病毒基因e10r的左右同源臂和mcherry/zeocin基
因的pcdna3.1( )-e10r-mcherry/zeocin、含4个重复mir199t的质粒puc-57-mir199t(北京擎科新业生物技术有限公司合成构建)及pcb质粒(来源可参见文献“房有容等，zeocin和gfp双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建.《国际流行病学传染病学杂志》,2012.39(3):148-152.”)通过酶切及同源重组获得pzb-e10r-mir199t(如图1)。
[0189]
具体操作如下：
[0190]
下述pcr程序可在常规范围以内的温度和循环条件下根据实际情况做适当调整而进行，属于本领域的常规技术，故不赘述。
[0191]
1)pcdna3.1( )-e10r-mcherry/zeocin质粒构建：以痘病毒dvv-vsc20(病毒来源可参见文献“mccart,ja,et al.systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.cancer res(2001)61:8751
–
8757.”)基因组为模板，通过pcr法(引物序列如下：l-arme10：agtcctcgagctaatattgagaaattcatc(seq id no.2)；e10r1：
[0192]
ctgcacattggttattaagaagcatagtctggaacatcatatggatataaagggttaacctttgtc(seq id no.3))获得e10r基因及左侧同源臂f1片段。以f1片段为模板，通过pcr(引物序列如下：l-arme10：agtcctcgagctaatattgagaaattcatc(seq id no.2)；e10r2：
[0193]
tggttaggacagtagtctgcacattggttaggacagtagtctgcacattggttattaag(seq id no.4))获得e10r左侧同源臂片段f2。以pcbmcz-ttfngr质粒(来源可参见文献“房有容等，zeocin和gfp双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建.《国际流行病学传染病学杂志》,2012.39(3):148-152.”)为模板通过pcr的方法(引物序列如下：199h5：
[0194]
atgtgcagactactgtcctaaccaatgtgcagactactgtccaaaaattgaaaataaatac(seq id no.5)；zeo-rev，gatcaagatctttagtcctgctcctcggccac(seq id no.6))获得含mh5启动子和mcherry/zeocin片段f3。以痘病毒dvv-vsc20基因组为模板通过pcr法(引物序列如下：e11up：
[0195]
gatcaagatctttataaacttaacccattataaaac(seq id no.7)；r-arm，agtcggatccttgacagtcttgaacaattatac(seq id no.8))获得含痘病毒e10r右侧同源臂f4。将f2和f3片段磷酸化后通过t4 dna连接酶(thermo公司，e10011)连接，以连接片段为模板，通过pcr法(引物序列如下：l-arme10，agtcctcgagctaatattgagaaattcatc(seq id no.2)；
[0196]
zeo-rev，gatcaagatctttagtcctgctcctcggccac(seq id no.6))获得含e10r左侧同源臂和mcherry/zeocin序列的融合片段f5。采用限制性内切酶bglⅱ(thermo公司，er0082)分别酶切片段f4和f5后，再通过t4 dna连接酶连接，获得包含e10r左右同源臂和mcherry/zeocin序列的e10r-mcherry/zeocin片段。采用限制性内切酶bamhⅰ(thermo公司，fd0054)和xhoⅰ(thermo公司，fd0694)分别切e10r-mcherry/zeocin片段和质粒pcdna3.1( )(invitrogen)，再通过t4 dna连接酶连接，大肠杆菌dh5α(tiangen公司，cb101)转化，挑单克隆获得pcdna3.1( )-e10r-mcherry/zeocin质粒，测序确认正确。
[0197]
2)pzb-1质粒构建：采用pcr法以pcb质粒为模板，获得线性化l-pcb片段(所用引物序列为：zp12-f：ccgctcgaggctggcgtttttccatagg(seq id no.33)；zp12-r：cgcggatcccggtctggttataggtacattgag(seq id no.34))，将pcdna3.1( )-e10r-mcherry/zeocin及l-pcb采用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ双酶切得到l-e10r-e11l/d和l-pcb/d片段，再通过t4 dna连接酶连接，最后通过大肠杆菌dh5α转化，挑单克隆获得pzb-1质粒，测序确认正确。
[0198]
3)pzb-2质粒构建：以pzb-1质粒模板，采用pcr法(引物序列如下：zp13-f：cccaagcttttagtcctgctcctcggcc(seq id no.9)；zp11m-r：
[0199]
ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctttataaacttaacccattataaaac(seq id no.10))在mcherry/zeocin 3’插入loxp序列(ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat(seq id no.11))获得l-pzb-1片段(4815bp)，使用t4 dna连接酶自我连接，大肠杆菌dh5α转化，挑单克隆获得pzb-2质粒，测序确认正确。
[0200]
4)pzb-e10r-mir199t质粒构建：以pzb-2质粒为模板，采用pcr法(引物序列如下：zp11-f：cgcgtatttgggatcagatg(seq id no.12)；zp11-r：caaaggttcttgagggttgtg(seq id no.13))获得包含l-e10r-e11l-loxp的片段(4689bp)。puc-57-mir199t采用限制性内切酶kpnⅰ(thermo公司，fd0524)和sacⅰ(therm o公司，fd1133)双酶切得到l-mir199t片段：caatttaacacaaccctcaagaacctttgtatttattttcaatttttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatggacagtagtctgcacattggttaggacagtagtctgcacattggttaggacagtagtctgcacattggttaggacagtagtctgcacattggttattaagaagcatagtctggaacatcatatggatataaagggttaacctttgtcacatcgatcgcgtatttgggatcagatggtac(seq id no.35)。通过一步克隆的方法(trelieftm sosoo cloning试剂盒ver.2，北京擎科新业生物技术有限公司，tsv-s2)与包含l-e10r-e11l-loxp的片段(4689bp)连接，大肠杆菌dh5α转化，挑单克隆获得pzb-e10r-mir199t质粒。bamhⅰ和smaⅰ(thermo公司，fd0663)酶切验证(图2)，并采用z10、z11、z14和z15引物(北京擎科新业生物技术有限公司)测序确认正确(测序引物序列见表1)。
[0201]
表1
[0202][0203]
制备例2：vsc20-mt/mcherry病毒的包装及鉴定
[0204]
1)溶瘤痘病毒的重组：a)cv1细胞铺于6孔板中，4
×
105个细胞/孔，使得次日细胞密度达到80％-90％。弃掉6孔板中的mem，每孔分别加入1ml无血清无抗生素的mem培养基，其中含有8
×
103pfu的dvv-vsc20病毒使其感染浓度为0.02moi，37℃培养2小时，弃掉培养液，置换为2％fbs 1％p/s的mem培养基，加入300μl质粒/lipo3000(lipofectamineor 3000转染试剂，invitrogen
tm
，l3000-015)混合液(溶液a：2μg pzb-e10r-mir199t质粒和4μl的p3000试剂(invitrogen
tm
，l3000-015)加入到300μl的opti-mem i中混匀，室温孵育5分钟；溶液b：10μl的lipo3000，加入至300μl的opti-mem i中混匀，室温孵育5分钟；溶液a及溶液b混合，室温孵育15分钟)，放置于培养箱(37℃，5％co2)中继续培养。b)24-48小时后显微镜下观察见细胞完全病变后，收集上清及细胞，反复冻融3次，300g离心5分钟，收集上清中释放的病毒，标注为p0代病毒。c)取出200μl的病毒，使用tianamp virus dna/rna试剂盒(tiangen公司，dp315)抽提病毒基因组，采用pcr法使用zp19/zp20引物鉴定vsc20-mt/mcherry重组成功。
[0205]
2)单克隆重组溶瘤痘病毒的筛选：a)cv1细胞铺于5个100mm培养皿中，使得次日细胞密度达到80％-90％，弃mem培养基，每个培养皿中分别加入3ml无血清培养液梯度稀释的p0代病毒(梯度稀释为10-1-10-5
)，放入培养箱37℃，5％co2孵育2小时，期间每隔30分钟十字混匀一次，再继续孵育2小时后，弃培养基，加入10ml的2％(w/v)琼脂糖凝胶(含2％fbs的mem培养基)，待凝固后放于培养箱37℃，5％co2继续培养。b)48小时左右，挑取带有红色荧
光的单个空斑至200μl的无菌pbs中，反复冻融三次释放病毒，每个空斑分别取100μl的病毒液在24孔板中采用cv1细胞(细胞达到80％满)进行小扩，约48小时待细胞完全病变后，收集病毒标记为p1-x(x为数字1，2，3，4
……
，代表不同病毒克隆)，每个空斑吸取200μl病毒液使用tianamp virus dna/rna试剂盒抽提基因组，使用pcr法鉴定，其余病毒液保存于-80℃。重复以上筛选步骤4次，得p5代病毒，pcr使用引物zp19和zp20(引物序列见表1)得2310bp条带，确认vsc20-mt/mcherry单克隆重组病毒(图3)。采用z11、z15、zp19和zp20测序(引物序列见表1)确认序列无误。vsc20-mt/mcherry病毒载体缺失vgf基因功能、在e10r基因3’utr区域插入4个重复mir199t序列及mcherry红色标记基因以供筛选(图4)。
[0206]
制备例3：mitdvv-mcherry骨架病毒的包装及鉴定
[0207]
1)溶瘤痘病毒的重组：cv1细胞铺于6孔板中，4
×
105个细胞/孔，使得次日细胞密度达到80％-90％；弃掉6孔板中的mem培养基，两个孔分别加入1ml无血清无抗生素的mem培养基，其中含有8
×
103pfu的vsc20-mt/mcherry使其感染浓度为0.02moi，37℃培养2小时，弃掉培养液置换为2％fbs 1％p/s的mem培养基，加入300μl pcb质粒/lipo3000混合液(配制同制备例2)，24-48小时后显微镜下观察见细胞完全病变后，收集上清及细胞，反复冻融3次，300g离心5分钟，收集上清中释放的病毒，标注为p0代病毒，使用tianamp virus dna/rna试剂盒(tiangen，dp315)抽提病毒基因组，采用pcr法使用p5/p18引物确认mitdvv-mcherry病毒重组成功。
[0208]
2)gpt药物筛选：使用60mm培养皿培养cv1细胞，达到80％满时加入1ml用mem稀释后的病毒稀释液，含150μl p0代病毒，感染2小时后，加4ml含0.5
×
gpt筛选药物进行筛选，观察细胞病变，收集病毒标注p1代病毒；重复2次以上步骤获得p3代病毒。
[0209]
3)单克隆重组溶瘤痘病毒的筛选：具体操作同制备例2，使用cv1细胞感染梯度稀释的p3代病毒4小时后，加入10ml的2％(w/v)琼脂糖凝胶对病毒固定培养48小时左右，挑取红色荧光的单个空斑进行pcr法鉴定，根据pcr结果取阳性克隆进行p4-p5代重复筛选，获得mitdvv-mcherry单克隆病毒，pcr法鉴定含1840bp(引物p5和p18序列见表1)条带且不含622bp(引物p1和p2序列见表1)条带(图5)。并采用引物p5和p18测序检测确认(北京擎科新业生物技术有限公司)，mitdvv-mcherry骨架病毒是双缺失vgf功能基因和tk功能基因、在e10r基因3’utr区域插入4个重复片段mir199t序列及mcherry红色标记基因、同时在tk基因区域携带gpt筛选基因(图6)。
[0210]
制备例4：mitdvv-hil21-mcherry溶瘤病毒的包装及鉴定
[0211]
1)溶瘤痘病毒的重组：cv1细胞铺于6孔板中，4
×
105个细胞/孔，使得次日细胞密度达到80％-90％；弃掉6孔板中的mem培养基，两个孔分别加入1ml无血清无抗生素的mem培养基，其中含有8
×
103pfu的ddvv-hil21病毒(制备方法如中国专利公开cn109554353a所述，其全部内容以引用方式并入本文)，使其感染浓度为0.02moi。37℃培养2小时，弃掉培养液置换为2％fbs 1％p/s的mem培养基，加入300μl pzb-e10r-mir199t质粒/lipo3000混合液(配制同制备例2)，24-48小时后显微镜下观察见细胞完全病变后，收集上清及细胞，反复冻融3次，300g离心5分钟，收集上清中释放的病毒，标注为p0代病毒。使用tianamp virus dna/rna试剂盒(tiangen，dp315)抽提病毒基因组，采用pcr法使用zp19/zp20引物确认mitdvv-hil21-mcherry溶瘤病毒重组成功。
[0212]
2)单克隆重组溶瘤痘病毒的筛选：具体操作同制备例2)，使用cv1细胞感染梯度稀
释的p0代病毒4小时后，加入10ml的2％(w/v)琼脂糖凝胶对病毒固定培养48小时左右，挑取红色荧光的单个空斑进行pcr法鉴定，根据pcr结果取阳性克隆进行p2-p5代重复筛选，获得单克隆病毒，pcr法鉴定(引物zp19和zp20序列见表1)含2310bp(图7)，并采用z11、z15、zp19和zp20测序(引物序列见表1)确认序列无误(北京擎科新业生物技术有限公司)。mitdvv-hil21-mcherry溶瘤病毒双缺失vgf功能基因和tk功能基因，在e10r基因3’utr区域插入4个重复mir199t序列及mcherry红色标记基因，同时在tk基因区域携带il-21功能基因(图8)。
[0213]
制备例5：通过cre-loxp剪切系统制备mitdvv骨架病毒和mitdvv-hil21溶瘤病毒
[0214]
mitdvv骨架病毒(去除mcherry/zeocin序列的mitdvv-mcherry病毒)和mitdvv-hil21溶瘤病毒(去除mcherry/zeocin序列的mitdvv-hil21-mcherry病毒)的获得：
[0215]
1)cv1细胞铺于6孔板中，4
×
105个细胞/孔，使得次日细胞密度达到70％左右，换置5％fbs 1％p/s的mem培养基后每孔加入300μl pbs185 cmv-cre质粒(该质粒由cmv启动子启动，能在哺乳动物细胞内表达cre酶，购自addgene，货号#11916)/lipo3000混合液(配制同制备例2)，于培养箱中37℃，5％co2培养24小时后，每孔分别加入8
×
105pfu的mitdvv-mcherry和mitdvv-hil21-mcherry病毒，同时设置只加病毒和只转质粒的对照孔，十字混匀，继续培养24小时后显微镜下观察，待细胞完全病变后，收集病毒，反复冻融3次，300g离心5分钟，收集上清液，标注为p0代病毒。
[0216]
2)cv1细胞铺于5个100mm培养皿中，使得次日细胞密度达到80％-90％，将p0代病毒按10倍梯度稀释为10-1-10-5
，弃培养皿中mem培养基，每个培养皿中分别加入3ml mem培养基进行梯度稀释的病毒液，放入培养箱37℃，5％co2孵育2小时，期间每隔30分钟十字混匀一次，再继续孵育2小时后，弃培养基，加入10ml的2％(w/v)琼脂糖凝胶，待凝固后放于培养箱继续培养，48小时左右，挑取不带有红色荧光的单个空斑至200μl的无菌pbs中，反复冻融三次释放病毒，每个空斑分别取100μl的病毒液在24孔板中采用80％满孔的cv1细胞进行小扩，约48小时待细胞完全病变后，收集病毒标记为p1-x(x为数字1，2，3，4
……
，代表不同病毒克隆)，每个空斑吸取200μl病毒液抽提基因组，使用pcr法鉴定(引物zp19和zp20，序列见表1)。
[0217]
3)重复步骤2)1次，获得p2代单克隆病毒mitdvv和mitdvv-hil21，使用pcr法鉴定(引物zp19和zp20，序列见表1)，并采用zp19和zp20测序(引物序列见表1)确认序列无误(北京擎科新业生物技术有限公司)后，保存于-80℃。
[0218]
pcr和测序结果显示，mitdvv骨架病毒中4个重复的mir199t序列已整合到dvv-vsc20痘病毒e10r 3’端utr区，且不含mcherry/zeocin序列，gpt基因整合到tk区使tk功能失活；mitdvv-hil21溶瘤病毒中4个重复的mir199t序列已整合到ddvv-hil21痘病毒e10r 3’端utr区，且不含mcherry/zeocin序列，即2株病毒重组成功(图9)，病毒结构如图10。
[0219]
制备例6：溶瘤病毒的生产和纯化
[0220]
1)hela细胞铺于150mm培养皿以使其第二天达到80％左右，共50个皿，分别以0.2moi p2代1号单克隆mitdvv骨架病毒和p2代1号单克隆mitdvv-hil21溶瘤病毒进行感染，约2-3天后，显微镜下观察细胞发生病变呈圆串珠状，使用细胞刮刀收集培养液和细胞；
[0221]
2)25924
×
g 4℃离心30分钟，弃掉上清，沉淀物中加入20ml含10％fbs的mem，重悬，使用液氮/高压灭菌水反复冻融三次，25924
×
g 4℃离心30分钟，沉淀物使用20ml pbs清洗，25924
×
g 4℃离心30分钟，沉淀物重悬于10ml的10mm tris ph9.0。60w 4℃超声30
秒、间隔30秒、共3分钟，300
×
g离心5分钟，收集上清备用。另取13.2ml超速离心管，加入6ml 36％(w/v)的蔗糖，从上往下缓慢加入5ml病毒上清，32900
×
g 4℃离心80分钟，沉淀物重悬于5ml 1mm tris ph9.0，超声30秒、间隔30秒、共3分钟；
[0222]
3)蔗糖梯度纯化管的制备及加样：使用13.2ml超速离心管分别缓慢加入2.2ml 40％(w/v)、36％(w/v)、32％(w/v)、28％(w/v)、24％(w/v)蔗糖溶液，制备成蔗糖梯度纯化管，随后贴着离心管壁在液面上缓慢加入2ml步骤2)所得病毒悬液，26000
×
g 4℃离心50分钟后，肉眼可见超速离心管中间呈乳白色的病毒条带，使用18g-5ml针管针头刺穿超速离心管吸取病毒条带，置于新的离心管中(记录吸取病毒条带的体积为v1)；
[0223]
4)加入2倍v1体积的1mm tris ph9.0缓冲液清洗病毒去除残余的蔗糖，32900g 4℃离心1小时，弃上清，沉淀物重悬于5ml的1mm tris ph9.0，4℃超声30秒、间隔30秒、共3分钟，分装50μl/管在无菌ep管中，储存于-80℃，同时采用常规空斑法进行病毒滴度检测，mitdvv-hil21滴度检测结果为6.4
×
109pfu/ml，mitdvv滴度检测结果为1.92
×
109pfu/ml。
[0224]
实施例1：mitdvv骨架病毒对肿瘤细胞的选择性复制
[0225]
人正常脐静脉内皮细胞huvec和人宫颈癌细胞hela以3
×
105细胞/孔铺入6孔板，37℃，5％co2培养过夜，使其在第二天达到70％。分别加入0.1moi的通过上述方法制备的mitdvv病毒，感染2小时后，换成含5％fbs的各自培养基，培养24小时和48小时后，收取细胞培养液和细胞，反复冻溶3次以完成裂解细胞，裂解液使用常规空斑法检测病毒含量。
[0226]
结果如图11所示，在0.1moi感染条件下，mitdvv病毒在huvec正常细胞内复制低于在hela肿瘤细胞内复制。图11a示出mitdvv骨架病毒分别感染huvec细胞和hela细胞后24小时后的病毒含量，图11b示出mitdvv骨架病毒分别感染huvec细胞和hela细胞后48小时后的病毒含量；图11c示出mitdvv骨架病毒在hela细胞内复制与在huvec细胞内复制的比值，其中病毒感染细胞后24小时和48小时后，病毒在hela细胞内复制量分别是在huvec细胞内复制量的50.46倍和60.56倍。
[0227]
实施例2：mitdvv骨架病毒与ddvv-rfp骨架病毒对正常细胞株的体外杀伤比较
[0228]
人正常胚肺成纤维细胞mrc-5以1
×
104细胞/孔铺入96孔板，37℃，5％co2培养过夜，使其在第二天达到80％。分别加入0.03moi和0.1moi的通过上述方法制备的ddvv-rfp和mitdvv病毒，感染2小时后，换成含5％fbs的dmem培养基。使用xcelligence实时无标记细胞分析仪(rtca)sp(acea，xcelligenc rtca sp)检测细胞生长状况，检测时间为24小时(n＝6，2-3次重复实验)。实验中保留一组只有细胞不含病毒的孔(无病毒感染)，作为阴性对照组，对照组均在相同时间做相应换液操作，每组为6个复孔。细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。
[0229]
结果如图12所示，在不同的moi值情况下，mitdvv病毒对mrc-5正常细胞的杀伤显著均低于ddvv病毒(p<0.001)。
[0230]
实施例3：mitdvv骨架病毒与ddvv-rfp骨架病毒在正常细胞内的复制比较
[0231]
人正常胚肺成纤维细胞mrc-5以1
×
105细胞/孔铺入24孔培板，使用2％fbs的dmem培养基37℃，5％co2培养过夜，使其在第二天达到80％。分别加入0.1moi和0.3moi的通过上述方法制备的ddvv-rfp病毒和mitdvv病毒，感染2小时后，换成含5％fbs的培养基。实验中保留一组只有细胞不含病毒的孔，作为阴性对照组，对照组均在相同时间做相应换液操作。37℃，5％co2培养24小时后收集培养液和细胞，使用tianamp病毒dna/rna试剂盒(tiangen，
dp315)抽提病毒基因组，用qpcr法检测病毒a46r基因以进行病毒含量检测，引物序列如表2。实验重复3次，取平均值做统计学分析。
[0232]
表2
[0233][0234]
结果如图13所示，在不同的moi值情况下，mitdvv病毒在mrc-5正常细胞中的复制均显著低于ddvv病毒(*p<0.01；**p<0.05)。
[0235]
实施例4：比较mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对正常细胞的杀伤
[0236]
人肺正常成纤维细胞mrc-5以1
×
104细胞/孔铺入96孔培养皿，使其在第二天达到80％，分别加入0.3moi、1moi的通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒和ddvv-hil21溶瘤痘病毒，感染2小时后，换液使用含5％fbs的dmem培养液37℃，5％co2培养12小时，使用xcelligence实时无标记细胞分析仪(rtca)sp(acea，xcelligenc rtca sp)检测细胞生长状况。实验中保留一组mrc-5细胞，不加病毒，作为空白组对照组，对照组均在相应时间做相应换液操作。每组为6个孔，实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。
[0237]
结果如图14所示，mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对人肺正常成纤维细胞mrc-5的杀伤呈剂量递增趋势，在同一剂量下，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对人肺正常成纤维细胞mrc-5的杀伤明显弱于ddvv-hil21溶瘤痘病毒(0.3moi，p<0.05；1moi，p<0.01)。
[0238]
实施例5：比较mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒在正常细胞内的复制
[0239]
人肺正常成纤维细胞mrc-5以1
×
105细胞/孔铺入24孔培养板，使其在第二天达到80％，分别加入0.1moi、0.3moi的通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒和ddvv-hil21溶瘤痘病毒，感染2小时后，换液使用含5％fbs的dmem培养液，37℃，5％co2培养24小时后收集培养液和细胞，使用tianamp病毒dna/rna试剂盒抽提病毒基因组，用实时荧光定量pcr法检测病毒a46r基因进行病毒含量检测，引物序列如表2。实验中保留一组mrc-5细胞不加病毒，作为空白对照组，对照组均在相应时间做相应换液操作。每组为3个复孔，取平均值做统计学分析。
[0240]
结果如图15所示，在0.1moi和0.3moi感染条件下，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在正常细胞mrc-5中的复制比ddvv-hil21溶瘤痘病毒均明显减低。
[0241]
实施例6：比较mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在正常细胞和肿瘤细胞内的复制
[0242]
人肺正常成纤维细胞mrc-5和人非小细胞肺癌细胞a549分别以1
×
105细胞/孔铺入24孔培养皿，使其在第二天达到80％，分别加入0.03moi、0.3moi、3moi的通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒感染2小时后，换液使用含5％fbs的dmem培养液，37℃，5％co2培养24小时后收集培养液和细胞，使用tianamp病毒dna/rna试剂盒抽提病毒基因组，用实时荧光定量pcr法进行病毒含量检测，病毒基因为a46r，引物序列如表2。实验中保留一组细胞不加病毒，作为空白对照组，对照组均在相应时间做相应换液操作，每组为3个复孔。
[0243]
结果如图16a所示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在肿瘤细胞a549内的复制明显高于正常细胞mrc-5。其中0.03moi、0.3moi、3moi的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在肿瘤细胞a549中的复制与在正常细胞mrc-5中的复制比值(a549/mrc-5)分别为51、23、16(图16b)，其中x轴为溶瘤病毒在a549细胞中复制与在mrc-5细胞中复制的比值(即a549/mrc-5)，y轴为病毒感染moi。
[0244]
实施例7：mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对不同肿瘤细胞株的体外杀伤
[0245]
在96孔板中铺各类人肿瘤细胞，包括sk-hep-1细胞(人肝癌细胞)、a549细胞(人非小细胞肺癌细胞)、fadu细胞(人头颈部癌细胞)、panc-1(人胰腺癌细胞)、u251细胞(人脑胶质瘤细胞)、lovo细胞(人结直肠癌细胞)、mnng/hos c1细胞(人骨肉瘤细胞)，每孔4000-5000个细胞，37℃，5％co2培养过夜后使其达到70％。各孔吸弃一半体积的培养基，换液加入等体积含不同浓度通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒(0.001moi、0.003moi、0.01moi、0.03moi、0.1moi、0.3moi、1moi、3moi、10moi)的无血清培养液感染4小时后，使用含5％fbs的细胞培养液换液，37℃，5％co2培养48小时(mnng/hos c1、a549、lovo、fadu)或72小时(sk-hep-1、u251、panc-1)，使用mtt法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝6，2-3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)及阳性对照组(10μm紫杉醇，购自北京双鹭药业)，每个处理组及对照组均设置6个复孔，细胞杀伤率(抑制率)为实验组或阳性对照组与阴性对照组百分比值。
[0246]
结果显示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对肿瘤细胞的杀伤作用呈剂量依赖关系(图17)，对sk-hep-1细胞、u251细胞、panc-1细胞、mnng/hos c1细胞、a549细胞、lovo细胞、fadu细胞的半数抑制率(ic
50
)分别为0.18、0.79、0.54、0.53、0.66、0.68、0.29(表3)。
[0247]
表3
[0248][0249]
实施例8：评价不同细胞中mir-199成熟体表达水平与mitdvv-hil21溶瘤痘病毒细胞杀伤作用的相关性
[0250]
1)评价不同肿瘤细胞mir-199的表达水平：将hek-293t细胞(注：所有肿瘤细胞的mir-199的表达量是相对于hek-293t细胞的)、mnng/hos c1细胞、saos2细胞(人骨肉瘤细
胞)、a549细胞、fadu细胞、sk-br-3细胞(人乳腺癌细胞)、hepg2细胞(人肝癌细胞)、hela细胞(宫颈癌细胞)、skov3细胞(人卵巢癌细胞)、mcf-7细胞(人乳腺癌细胞)、c33a细胞(人宫颈癌细胞)、lovo细胞、u251细胞、hct116细胞(人结直肠癌细胞)、sk-hep-1细胞、cfpac-1细胞(人胰腺癌细胞)、panc-1细胞(人胰腺癌细胞)、nci-h1299细胞(人非小细胞肺癌)、u87mg细胞(人脑胶质瘤细胞)分别铺于6孔板上，细胞完全满盘后，弃除培养液，加入1ml trizol试剂(invitrogen公司)提取rna，取1μg rna使用反转录试剂盒(天根cat#kr116-02)合成cdna后，使用荧光定量pcr试剂盒(天根cat#fp215-02)检测肿瘤细胞内mir-199成熟体(hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p)表达，采用通用茎环序列gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac(seq id no.36)加上mir199-3p成熟体3’端的7个碱基的反向重复序列得到反转录引物mir199-rt，见表4；qrt-pcr引物序列(由北京擎科新业生物技术有限公司合成)如表4，同时使用内源基因u6作为内参计算mir-199的相对表达量。结果显示，mnng/hos c1细胞、saos2细胞是mir-199高表达株( ，≥10)，fadu细胞、hepg2细胞、sk-br-3细胞是mir-199中表达细胞株( ，≥1且<10)，其他肿瘤细胞株都是mir-199低表达细胞株(
±
，<1)(图18)。
[0251]
表4
[0252][0253]
注：u6-rt和mir199-rt为反转录引物；u6-f和u6-r为u6的qpcr引物；mir199-f和mir199-r为mir199的qpcr引物。
[0254]
2)根据图18显示的细胞内mir-199的表达水平，分别选择低、中、高表达的肿瘤细胞株panc-1、sk-hep-1、fadu、mnng/hos c1细胞对通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒进行杀伤作用比较：在96孔板分别铺mnng/hos c1、fadu、sk-hep-1、panc-1细胞，每孔细胞数根据细胞生长速率调整，培养过夜后使其达到80％，弃液后分别加入100μl含0.1moi mitdvv-hil21溶瘤痘病毒的无血清培养液感染4小时后，换液使用含5％fbs的细胞培养液培养48小时，使用mtt法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝6，2-3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)，每个处理组及对照组均设置6个复孔，细胞存活率为加病毒的实验组与阴性对照组的百分比值。结果显示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对低表达
mir-199的肿瘤细胞的杀伤明显强于高表达mir-199的肿瘤细胞(图19)。
[0255]
实施例9：评价mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对同类稳转高表达mir-199肿瘤细胞的杀伤作用
[0256]
本实验的目的是为进一步验证本发明溶瘤病毒的机理。由于tk/vgf双缺失的溶瘤痘病毒本身对不同类肿瘤细胞存在杀伤差异，因此为进一步验证本发明mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够受到微小rna的调控，因此构建了稳转高表达mir-199(包括has-mir-199a-3p和has-mir-199b-3p)的肿瘤细胞，来在同一种肿瘤细胞中进行比较。
[0257]
1)构建携带mir-199的慢病毒：hek-293细胞(agilent technologies)使用10％fbs 1％p/s的dmem培养基铺于6孔板中，4
×
105个细胞/孔，使得次日细胞密度达到70％左右，换置5％fbs 1％p/s的dmem培养基后，每孔加入300μl质粒/lipo3000混合液(配制同制备例2)(制备lv-mir199慢病毒的质粒包含：p59-rev、pp60-vsv-g、p61-gag-p01和lv3-has-mir199-gfp，购自上海吉玛制药技术有限公司，lv3-has-mir199-gfp质粒包含能够表达mir199成熟体hsa-mir-199a-3p或hsa-mir-199b-3p的dna序列：
[0258]5’-
gatccgacagtagtctgcacattggttattcaagagataaccaatgcagactactgtcttttttgaatt-3’(seq id no.37)，并能表达可用于筛选和检测的gfp绿色荧光；制备lv-mirnc慢病毒的质粒包含：p59-rev、pp60-vsv-g、p61-gag-p01和lv3-shnc，购自上海吉玛制药技术有限公司，lv3-shnc为对照质粒包含一段无关的对照dna序列：
[0259]5’-
gatccgttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaacttttttgaatt-3’(seq id no.38)；其中lv3是吉玛公司慢病毒质粒载体的编号，hsa表示人源)。培养箱中37℃，5％co2培养48小时后收取上清，4℃5000rpm/分钟离心30分钟，收取上清，0.45μm滤膜过滤分装成1ml每管，-80℃保存，分别为携带mir-199的慢病毒lv-mir199及骨架慢病毒lv-mirnc。
[0260]
2)构建高表达mir-199的肿瘤细胞：分别使用lv-mir199慢病毒及骨架慢病毒lv-mirnc感染hct116细胞(常规操作故不赘述)后，进行单克隆阳性细胞挑选，从而构建稳定表达mir-199的hct116-mir199细胞株及阴性对照细胞株hct116-mirnc。使用细胞流式仪的绿色荧光通道检测gfp的表达(图20a)和pcr法(图20b)鉴定确认(可根据实验情况按常规操作调整，故不赘述)。qpcr引物序列如表4。流式检测结果显示，hct116-mir199细胞株及hct116-mirnc细胞阳性转染率分别为99.91％和99.64％，pcr结果确认hct116-mir199细胞株高表达mir-199(包括has-mir-199a-3p和has-mir-199b-3p)。
[0261]
3)将hct116-mir199细胞株及hct116-mirnc细胞株分别用10％fbs的培养基以每孔5000个细胞铺于96孔板，培养过夜后使其达到80％，弃液后分别加入100μl含0.03moi、0.3moi、3moi的通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒无血清培养液，感染4小时后，换液使用含5％fbs的细胞培养液37℃，5％co2培养48小时，使用mtt法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝6，2-3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)，每个处理组及对照组均设置6个复孔，细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在高表达mir-199的肿瘤细胞中的杀伤力明显降低(图21)。
[0262]
实施例10：mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对结直肠癌的抑瘤作用
[0263]
使用对数生长期人结直肠癌hct116细胞，构建重度免疫功能缺失的ncg小鼠肿瘤模型。实验采用重度免疫功能缺失的ncg小鼠(得自江苏集萃药康生物科技有限公司)(8周
龄，雌性)，以每只100万个hct116细胞接种于小鼠后腿背部皮下，当肿瘤体积在100mm3左右时，瘤内注射通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒5
×
105pfu/只小鼠，给药体积为50μl，每组4只小鼠，每3天检测瘤体大小及体重。实验中设置给予pbs的对照组。结果显示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够有效地抑制肿瘤的生长(图22a)。给药后第10天开始，给药组的相对肿瘤生长率(t/c，即给药组肿瘤体积与对照组肿瘤体积的百分比率，该值<40％时表示药物有效)小于40％(图22b)。在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降(图22c)。
[0264]
实施例11：mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对人骨肉瘤的抑瘤作用
[0265]
使用对数生长期人骨肉瘤mnng/hos c1细胞，构建重度免疫功能缺失的ncg小鼠肿瘤模型。实验采用重度免疫功能缺失的ncg小鼠(得自江苏集萃药康生物科技有限公司)(8周龄，雌性)，每只给予50万个mnng/hos c1细胞接种于小鼠后腿背部皮下，当肿瘤体积在100mm3左右时，瘤内注射通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒1
×
106pfu/只小鼠，给药体积为50μl，每组4只，每3天检测瘤体大小及体重。实验中设置pbs的对照组。结果显示mitdvv-hil21溶瘤病毒也能够在小鼠体内有效地抑制高表达mir-199的mnng/hos c1肿瘤的生长(图23a)。给药后第8天开始相对肿瘤生长率(t/c)小于40％(图23b)。在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降(图23c)。
[0266]
实施例12：mitdvv-hil21溶瘤痘病毒对人肝癌的抑瘤作用
[0267]
使用对数生长期人肝癌sk-hep-1细胞，构建重度免疫功能缺失的ncg小鼠肿瘤模型。实验采用重度免疫功能缺失的ncg小鼠(得自江苏集萃药康生物科技有限公司)(7周龄，雌性)，每只给予1000万个sk-hep-1细胞接种于小鼠后腿背部皮下，当肿瘤体积在100mm3左右时，瘤内注射通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒2
×
105pfu/只小鼠，给药体积为50μl，每组3-4只小鼠，每3天检测瘤体大小及体重。实验中设置pbs的对照组。结果显示mitdvv-hil21溶瘤痘病毒能够有效的抑制肿瘤的生长(图24a)，在整个实验过程中小鼠体重未见明显下降(图24b)。
[0268]
实施例13：评价mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对不同mir-199表达水平的肿瘤胞的杀伤作用
[0269]
在96孔板分别铺各类人肿瘤细胞，包括mnng/hos c1、saos2、fadu、sk-br-3、hepg2、hela、skov3、c33a、lovo、u251、hct116、sk-hep-1、cfpac-1、panc-1细胞，每孔4000-5000个细胞，37℃，5％co2培养过夜后使其达到70％。换液加入含0.3-10moi(由于各种肿瘤细胞对病毒敏感度不同，使用之前体外实验摸索的感染moi：0.3moi感染mnng/hos c1、fadu；1moi感染lovo、u251、sk-hep-1；3moi感染saos2、sk-br-3、hepg2、hela、skov3、c33a、cfpac-1、panc-1；10moi感染hct116)的通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒或ddvv-hil21溶瘤痘病毒的无血清培养液感染4小时，之后换液使用含5％fbs的细胞培养液37℃，5％co2培养48小时，使用mtt法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝6，2-3次重复实验)。本试验的阴性对照组为无病毒感染，每个处理组及对照组均设置6个复孔，细胞杀伤率(细胞生长抑制率)为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示，在高表达mir-199的肿瘤细胞mnng/hos c1和saos2中，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对细胞杀伤无差别，但在中或低表达mir-199的肿瘤细胞fadu、sk-br-3、hepg2、hela、skov3、c33a、lovo、u251、hct116、sk-hep-1、cfpac-1、panc-1等细胞中，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒表现更强的杀伤力(图25)。
[0270]
实施例14：评价mitdvv-hil21和ddvv-hil21溶瘤痘病毒对不同mir-199表达水平的荷瘤鼠的抑瘤效果
[0271]
分别使用对数生长期人结直肠癌hct116细胞和对数生长期人骨肉瘤mnng/hos c1细胞，构建重度免疫功能缺失的ncg小鼠肿瘤模型，其中按照实施例10和11所述的构建模型的方法，分别将高表达mir-199的人骨肉瘤mnng/hos c1和低表达mir-199的人结直肠癌hct116细胞接种在ncg小鼠后腿背部皮下，当肿瘤体积在100mm3左右时，分别瘤内注射通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤病毒和ddvv-hil21溶瘤痘病毒，其中mnng/hos c1荷瘤鼠给药剂量为1
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106pfu/只小鼠，hct116荷瘤鼠给药剂量为5
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105pfu/只小鼠，给药体积均为50μl，每组3只小鼠，每3天检测瘤体大小及体重。结果显示，在hct116和mnng/hos c1肿瘤模型组中都表现出较好的抑瘤作用，两者比较而言，在低表达mir-199的hct116肿瘤中，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒抑瘤作用强于ddvv-hil21溶瘤痘病毒(图26a)，然而在高表达mir-199的mnng/hos c1肿瘤中，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒抑瘤作用比ddvv-hil21溶瘤痘病毒弱(图26b)。
[0272]
实施例15：评价mitdvv-hil21与ddvv-hil21溶瘤痘病毒在小鼠体内的组织分布
[0273]
8周龄的正常c57bl/6n雌性小鼠静脉给予200μl pbs，其中分别包含1
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109pfu/kg通过上述方法制备的mitdvv-hil21溶瘤痘病毒与ddvv-hil21溶瘤痘病毒，每组5只小鼠。分别于给药后第一天(d1)、第三天(d3)、第7天(d7)及第15天(d15)处死1组小鼠(5只)，收取外周血、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢、子宫，使用qpcr法检测痘病毒在各脏器的分布，检测病毒基因为a46r，引物序列如表2所示。结果显示，mitdvv-hil21溶瘤痘病毒在卵巢、子宫、肝脏和脾脏内的复制比ddvv-hil21溶瘤痘病毒低，在肺内病毒含量与给予ddvv-hil21溶瘤痘病毒相似，在外周血中mitdvv-hil21溶瘤痘病毒含量比ddvv-hil21溶瘤痘病毒高(图27)。心脏和肾内未检测到mitdvv-hil21溶瘤痘病毒或ddvv-hil21溶瘤痘病毒(图未显示)。