一种积雪草发酵滤液的制备方法和产品及其应用与流程

1.本发明属于化妆品领域，具体涉及到一种积雪草发酵滤液的制备方法和产品及其应用。


背景技术：

2.积雪草centella asiatica(l.)urban是伞形科，属多年生草本植物。积雪草分布范围广，可生食、可入药。性寒、味苦、临床上用于湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎等。积雪草中含有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草酸等三萜类、黄酮类、酚类等多种药物活性成分。
3.随着对药用植物的开发，积雪草也逐渐被用于化妆品中，但是添加的多为积雪草提取物，需要耗费大量人力物力，经过复杂提取工艺获得成品。
4.目前，市场上发酵积雪草的产品比较少，cn111544357a介绍了一种黄酒酵母菌发酵的积雪草原浆的制备方法及其抗氧化功能和美白的功能。cn112353734a介绍了一种酿酒酵母发酵的以富含多糖为主的积雪草发酵液，该发酵液具有对紫外辐射引起的损伤有良好的修复功效，cn102349924介绍了积雪草三萜酸葡萄糖苷的水解方法并且应用于癌症方面。专利cn102091107用酶法提取积雪草中的无糖苷结构的积雪草酸，羟基积雪草酸、多米诺积雪草酸成分；生物转化积雪草苷，但转化时间分别为144小时、5天生物转化效率非常低，并且未能得到积雪草双糖苷的结构。
5.皮肤受到损伤，巨噬细胞会大量分泌多种生物活性物质包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、多肽转换生长因子、血小板衍生生长因子以及一氧化氮等直接引导机体修复的整个进程。但如白介素、和肿瘤坏死因子等促炎因子会加强局部的炎症反应，可能会导致伤口愈合慢、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，因此降低促炎因子水平对于修复具有重要意义。


技术实现要素：

6.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
7.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
8.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种积雪草发酵滤液的制备方法。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种积雪草发酵滤液的制备方法，其特征在于：包括，
10.取积雪草叶片，粉碎过60～100目筛，按照50～75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，调节体系ph为4.5～5.0，制得发酵培养基；
11.将发酵培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；
12.将植物乳杆菌接种于mrs培养基中，于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到
106～107cfu/ml时，以5％～10％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中发酵培养后，陶瓷膜过滤，即得到积雪草发酵滤液；
13.其中，羟基积雪草苷含量为1.5～5g/l，羟基积雪草二糖苷和羟基积雪草单糖苷含量分别为0.5～4g/l、0.5～3g/l。
14.作为本发明所述积雪草发酵滤液制备方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养基，其中，积雪草叶片优选过筛为100目，优选去离子水的添加量75g/l，优选的ph为4.5。
15.作为本发明所述积雪草发酵滤液制备方法的一种优选方案，其中：所述植物乳杆菌为cicc24202，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
16.作为本发明所述积雪草发酵滤液制备方法的一种优选方案，其中：所述mrs培养基，其配方包括，
17.蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母膏5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0ml/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph 6.2～6.6。
18.作为本发明所述积雪草发酵滤液制备方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养，包括，
19.将接种植物乳杆菌后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
20.发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经陶瓷膜过滤，得到积雪草发酵滤液。
21.作为本发明所述积雪草发酵滤液制备方法的一种优选方案，其中：所述经陶瓷膜过滤，其中，陶瓷膜滤径为200nm。
22.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种积雪草发酵滤液的制备方法制得的产品，所述产品抑制lps诱导的巨噬细胞中tnf
‑
α细胞因子的分泌，抑制lps诱导的巨噬细胞中il
‑
6细胞因子的分泌，具有抗炎功效，所述产品，羟基积雪草苷含量为1.5～5g/l，羟基积雪草二糖苷和羟基积雪草单糖苷含量分别为0.5～4g/l、0.5～3g/l。
23.本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供积雪草发酵滤液产品在化妆品中作为抗炎成分的应用。
24.本发明有益效果：
25.(1)本发明提供了一种积雪草发酵滤液制备方法，该制备方法有工艺简单、成本低廉和易于生产等优势；本发明制得的积雪草发酵液中富含三萜类、黄酮类、酚类等多种药物活性成分，以及微生物次生代谢产物，并且在微生物发酵条件下药用活性成分转化提高，同时该方法发酵得到的积雪草发酵滤液是一种安全性高的抗炎功效化妆品原料。
26.(2)本发明中的乳酸菌积雪草发酵滤液，相比未发酵组和米曲霉积雪草发酵滤液，羟基积雪草苷(m/z992.51[m oh]
‑
；rt:8.78min)的含量减少，产物中羟基积雪草二糖苷m/z846.45[m oh]
‑
；rt:9.43min]与羟基积雪草单糖苷(m/z794.41[m oh]
‑
；rt:12.83min)的含量增加，羟基积雪草苷含量为1.5～5g/l，羟基积雪草二糖苷和羟基积雪草单糖苷含量分别为0.5～4g/l、0.5～3g/l。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0028]
图1为本发明实施例中不同菌种积雪草发酵滤液dpph抑制率图。
[0029]
图2为本发明实施例中不同菌种积雪草发酵滤液abts抑制率图。
[0030]
图3为本发明实施例中积雪草空白组及积雪草发酵滤液hplc色谱对比图。
[0031]
图4为本发明实施例中抗炎实验炎症因子(tnf
‑
α)检测测定结果对比图。
[0032]
图5为本发明实施例中抗炎症因子(il
‑
6)检测测定结果对比图。
[0033]
图6为本发明实施例中羟基积雪草苷lc
‑
ms/ms质谱图。
[0034]
图7为本发明实施例中羟基积雪草二糖苷lc
‑
ms/ms质谱图。
[0035]
图8为本发明实施例中羟基积雪草单糖苷lc
‑
ms/ms质谱图。
[0036]
图9为本发明实施例中皮肤开放型斑贴试验图示。
[0037]
图10为本发明实施例中皮肤封闭型型斑贴试验图示。
[0038]
图11为本发明实施例中积雪草发酵滤液鸡胚绒毛尿囊膜实验结果图。
具体实施方式
[0039]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0040]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0041]
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0042]
本发明中植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为24202；米曲霉(aspergillus oryzae)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为2011。
[0043]
实施例1
[0044]
(1)种子培养基mrs：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母膏5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0ml/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph 6.2；
[0045]
发酵培养基：精选药用积雪草叶片，进行粉碎操作后，过100目筛，然后按照75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，并调节ph4.5；
[0046]
以上培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min。
[0047]
(2)将植物乳杆菌接种于mrs培养基中于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到106～107cfu/ml时，以8％的接种量接种于发酵培养基中；
[0048]
(3)将接种植物乳杆菌后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，
终止发酵；
[0049]
发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经由200nm陶瓷膜过滤，得到积雪草发酵滤液。
[0050]
实施例2
[0051]
(1)pda：马铃薯200g/l葡萄糖20g/l，自然ph；
[0052]
发酵培养基：精选药用积雪草叶片，进行粉碎操作后，过100目筛，然后按照75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，并调节ph4.5；以上培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min
[0053]
(2)将米曲霉菌株，转接至pda培养基斜面，30℃培养3～4d，然后挑取斜面培养基上菌种，挑取培养基斜面上的米曲霉孢子接种于装有pda液体培养基的三角瓶30℃培养3～4d，然后以8％的接种量接种于发酵培养基；
[0054]
(3)发酵培养：将接种米曲霉后的培养基于30
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
[0055]
发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经由200nm陶瓷膜过滤，得到积雪草发酵滤液。
[0056]
实施例3
[0057]
将实施例1和2中制得的不同菌种发酵液抗氧化活性比较：
[0058]
1.不同菌种发酵液抗氧化活性比较：
[0059]
(1)dpph自由基清除实验
[0060]
溶液准备：
[0061]
称取dpph 6.0mg，用10ml meoh溶解，为1.5mm dpph。
[0062]
dpph溶液的配置确定：上述溶液稀释5倍后与水按照1：1的比例混合，在紫外517nm测定吸光值为约0.8。
[0063]
把1.5mm的dpph用meoh稀释5倍使用，为0.3mm dpph溶液。
[0064]
实验：
[0065][0066]
避光条件反应30min后，酶标仪检测517nm处吸光度。
[0067]
数据处理：
[0068]
inhibition％＝[1
‑
(as
‑
ab)/(ac
‑
acb)]
×
100
[0069]
结果如图1，经过发酵的积雪草的dpph抗氧化活性都增加，植物乳杆菌增加最多。
[0070]
(2)abts自由基检测法
[0071]
原理：abts在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的abts
·
，在抗氧化物存在时
abts
·
的产生会被抑制，在734nm或405nm测定abts的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。
[0072]
实验准备：
[0073]
2.45mm过硫酸钾溶液：6.6mg过硫酸钾定容到10ml
[0074]
7mm abts
·
浓溶液:7.7mg abts用2ml过硫酸钾溶液溶解，16h后使用。
[0075]
abts
·
浓溶液稀释：将abts
·
浓溶液稀释至734nm处吸光度为0.9(取200μl至96孔板中检测)。
[0076]
试验方法：
[0077]
在96孔板中依次加入50μl样品与150μl abts溶液，反应15min，734nm测量吸光度。样品溶剂为对照组进行检测。
[0078]
抑制率％＝(1
‑
a sample/a control)*100
[0079]
结果如图2，可以看出，经过发酵的积雪草的abts抗氧化活性都增加，植物乳杆菌增加最多。
[0080]
(3)将实施例1和2中制得的不同菌种发酵液，通过hplc成分分析比较，结果见图3。
[0081]
通过对不同菌种的积雪草发酵液进行比较分析，发现植物乳杆菌与米曲霉的成分差异较大，植物乳杆菌转化能力较强。
[0082]
实施例4
[0083]
将实施例1制得的积雪草发酵液抗炎功效进行测定：
[0084]
用elisa试剂盒检测本发明积雪草发酵液在炎症反应中对促炎因子tnf
‑
α和il
‑
6的抑制作用。
[0085]
(1)tnf
‑
α：
[0086]
接种：raw264.7细胞按照1.5
×
105个/ml接种到96孔板，每孔加入100μl，于37℃，5％co2培养箱中培养，待细胞融合度达到90％。
[0087]
样品处理：去培养基，向每孔加入100μl dmem配制的样品(积雪草发酵液)，于培养箱中培养8h，对照组和空白组细胞dmem培养。
[0088]
炎症刺激：去培养液，用1μg/ml lps刺激样品组和对照组细胞6h，空白组细胞不刺激。(lps刺激对照组，lps 样品刺激样品组，下同)
[0089]
炎症因子检测：6h后，收集培养液，用elisa试剂盒进行炎症因子(tnf
‑
α)检测。
[0090]
通过图4对比发现，植物乳杆菌积雪草发酵滤液可以抑制lps诱导的巨噬细胞中tnf
‑
α细胞因子的分泌，表现出更好的抗炎功效。
[0091]
(2)il
‑
6：
[0092]
接种：raw264.7细胞按照1.5
×
105个/ml接种到96孔板，每孔加入100μl，于37℃，5％co2培养箱中培养，待细胞融合度达到90％。
[0093]
样品处理：去培养基，向每孔加入100μl dmem配制的样品(积雪草发酵液)，于培养箱中培养8h，对照组和空白组细胞dmem培养。
[0094]
炎症刺激：去培养液，用1μg/ml lps刺激样品组和对照组细胞6h，空白组细胞不刺激。(lps刺激对照组，lps 样品刺激样品组，下同)
[0095]
炎症因子检测：6h后，收集培养液，用elisa试剂盒进行炎症因子(il
‑
6)检测。
[0096]
通过图5对比发现，植物乳杆菌积雪草发酵滤液可以抑制lps诱导的巨噬细胞中
il
‑
6细胞因子的分泌，表现更好的抗炎功效。
[0097]
积雪草发酵，借助特定微生物丰富的酶系，降低药用植物的刺激性，释放更多有效成分；同时可以将积雪草中活性成分转化为活性更高的成分，提升其成分利用度。并且发酵会产生更多的代谢产物，对皮肤多有益处。具有安全性高，成本低，耗时少等特点。
[0098]
(3)积雪草成分测定
[0099]
将发酵过后的积雪草发酵液与未发酵的空白组进行hplc分析，发现经过发酵后发酵液成分发生了改变。
[0100]
通过lc
‑
ms/ms对发生改变的组分进行分析，结果见图3，hplc的峰面积数据见表：
[0101][0102]
图6为本发明实施例中羟基积雪草苷lc
‑
ms/ms质谱图；图7为本发明实施例中羟基积雪草二糖苷lc
‑
ms/ms质谱图，图8为本发明实施例中羟基积雪草单糖苷lc
‑
ms/ms质谱图，可以看出，乳酸菌积雪草发酵滤液中羟基积雪草苷(m/z992.51[m oh]
‑
；rt:8.78min)的含量减少，产物中羟基积雪草二糖苷m/z846.45[m oh]
‑
；rt:9.43min]与羟基积雪草单糖苷(m/z794.41[m oh]
‑
；rt:12.83min)的含量增加，这可能是抗炎效果提升的原因。羟基积雪草苷含量为1.5～5g/l，羟基积雪草二糖苷和羟基积雪草单糖苷含量分别为0.5～4g/l、0.5～3g/l。
[0103]
实施例5
[0104]
积雪草发酵液安全性测试：
[0105]
开放性斑贴测试：
[0106]
选取18～35岁的志愿者50名，随机分成5组，每组10人。参照《化妆品卫生规范》(2015版)中“人体皮肤斑贴试验”的相关要求进行人体皮肤不良反应测试。
[0107]
样品：1号样品——积雪草发酵滤液
[0108]
阴性对照——纯水
[0109]
斑试方法：前臂屈侧作为受试部位，面积3
×
3cm2，受试部位应保持干燥，将试验物0.020ml每天2次均匀地涂于受试部位，连续7天，同时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准(表1)记录其结果(表2)。
[0110]
皮肤开放型斑贴试验图示，见图9。
[0111]
表1皮肤开放型斑贴试验皮肤反应分级标准
[0112][0113]
表2皮肤开放型斑贴试验试验结果
[0114][0115]
[0116]
从表中可以看出涂抹1号样品的志愿者的试验结果均为阴性，无不良皮肤反应发生。表明积雪草发酵滤液温和、无刺激，安全性好。
[0117]
封闭性斑贴实验
[0118]
试验的人员：18～35岁的志愿者50名，选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方法，将0.020ml的样品涂于斑试器内，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果。
[0119]
样品：1号样品——积雪草发酵滤液
[0120]
阴性对照——纯水
[0121]
皮肤封闭型型斑贴试验图示，见图10。
[0122]
表3皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
[0123][0124]
表4皮肤封闭型斑贴试验试验结果
[0125][0126]
从表中可以看出涂抹1号样品的志愿者的试验结果均为阴性，无不良皮肤反应发
生。表明积雪草发酵滤液温和、无刺激，安全性好。
[0127]
实施例6
[0128]
积雪草发酵滤液鸡胚绒毛尿囊膜实验
[0129]
一、原理：利用cam膜或者血管呈现的特定信息，如出血、血管溶解、凝血、小血管直径微小改变等，可以评估受试物产生的刺激能力。
[0130]
二、执行标准：sn/t 2329
‑
2009。
[0131]
三、试验方法
[0132]
1.实验材料：
[0133]
1.1 鸡胚：spf级白莱杭鸡(white leghorn chicken)，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
[0134]
1.2 培养条件：孵箱温度37.5
±
0.5℃，相对湿度55％
‑
70％。
[0135]
1.3 试剂和对照：阳性对照(pc1)：1.0％sds溶液。
[0136]
阳性对照(pc2)：0.1mol/lnaoh溶液
[0137]
阴性对照(nc)：0.9％nacl溶液。
[0138]
测试样品(ta)：稀释成合适浓度的四款发酵液。
[0139]
2.试验步骤：
[0140]
2.1 cam制备：购买0d龄鸡胚，50～60g，孵化过程中，每天翻动一次，孵化至5d龄时，检查鸡胚发育状态，6天时，剥去蛋壳部分，暴露白色蛋膜；小心用镊子去除内膜，确保血管膜不受损。
[0141]
2.2 正式试验：每组至少6只鸡胚，取受试物原样0.1ml直接滴加于cam表面，观察cam反应情况，并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间，精确到秒，包括出血、凝血和血管融解3种反应，并记录反应的程度。阳性对照和阴性对照采用相同的操作过程。
[0142]
2.3 数据分析：记录每个检测终点出现的时间和反应程度，应用以下公式计算刺激评分(is)，结果保留小数点后两位：
[0143][0144]
sech、secl和secc分别代表cam膜上观察到开始发生出血、血管融解和凝血的平均时间(秒)。
[0145]
表5刺激评分法结果评价
[0146][0147]
积雪草发酵滤液鸡胚绒毛尿囊膜实验结果，见图11。
[0148]
根据sn/t2329
‑
2009的判定标准，对照组1.0％sds溶液和0.1mol/lnaoh溶液具有
重度刺激，0.9％nacl溶液无刺激，样品组积雪草发酵滤液无刺激。
[0149]
本发明中的乳酸菌积雪草发酵滤液，相比未发酵组和米曲霉积雪草发酵滤液，羟基积雪草苷(m/z992.51[m oh]
‑
；rt:8.78min)的含量减少，产物中羟基积雪草二糖苷m/z846.45[m oh]
‑
；rt:9.43min]与羟基积雪草单糖苷(m/z794.41[m oh]
‑
；rt:12.83min)的含量增加，这可能是抗炎效果提升的原因。
[0150]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。