单原子纳米酶及其制备方法、基于其联合CRISPR/Cas12a级联放大的电致化学发光传感器及应用与流程

本发明涉及生物传感器，具体涉及一种单原子纳米酶及其制备方法、基于其联合crispr/cas12a级联放大的电致化学发光传感器及应用。

背景技术：

1、乳腺癌（breast cancer, bc）是一类由于遗传因素、激素水平异常及环境因素等共同作用导致乳腺组织发生恶性转化的肿瘤，是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康。人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2,her2）是乳腺癌发生发展和治疗决策中的重要分子标志物。her2 的异常表达与肿瘤增殖、侵袭转移、预后不良及靶向治疗敏感性密切相关，因此，准确评估 her2 状态对于乳腺癌的早期诊断、预后判断、治疗方案选择及疗效监测具有重要意义。

2、目前，临床上 her2 状态的评估主要依赖组织样本检测方法，如免疫组织化学（immunohistochemistry, ihc）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,fish）等。然而，这些方法通常需要通过穿刺或手术获取肿瘤组织，具有一定侵入性，且受肿瘤空间异质性和取样部位差异影响，难以全面反映患者体内 her2 的真实状态。此外，组织检测多为单时间点检测，难以满足乳腺癌治疗过程中对 her2 表达变化进行连续、动态监测的临床需求。随着 her2 靶向治疗，尤其是抗体药物偶联物等新型治疗策略的发展，her2阳性以及 her2 低表达患者的精准分层变得愈发重要，因此亟需建立一种便捷、灵敏、可动态监测的 her2 检测方法。

3、血清 her2（sher2）主要来源于 her2 蛋白胞外结构域的脱落，可进入外周血循环，是一种具有临床应用潜力的液体活检标志物。与组织检测相比，sher2 检测具有取样便捷、创伤小、适合重复检测和动态监测等优势，可为乳腺癌诊断、病情评估、疗效监测及复发风险判断提供重要补充信息。然而，血清样本成分复杂，含有大量干扰分子，容易引起非特异性吸附和背景信号升高，从而影响检测准确性。同时，sher2 水平在不同患者及不同疾病阶段存在动态变化，临床分层相关的浓度差异可能受到复杂血清基质和检测方法灵敏度的限制而难以准确区分。

4、传统 sher2 检测方法主要包括酶联免疫吸附测定、化学发光免疫分析及电化学免疫传感等。虽然这些方法在临床检测和实验研究中已有一定应用，但仍存在操作步骤较多、检测时间较长、信号放大能力有限以及对低水平变化识别能力受限等问题。尤其是在复杂血清样本中，如何同时实现 sher2 的高特异性识别、高效信号转换和高灵敏读出，仍是当前液体活检检测技术面临的重要挑战。因此，临床上亟需开发一种操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强且适用于复杂血清样本的 sher2 检测方法，为乳腺癌早期诊断、精准分层及治疗动态监测提供可靠技术支持。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种单原子纳米酶及其制备方法、基于其联合crispr/cas12a级联放大的电致化学发光传感器及应用，通过“适配体识别转换蛋白信号、 crispr/cas12a正反馈级联体系持续放大核酸信号、pt1/pdceb 单原子纳米酶增强ecl输出”三重技术协同，实现复杂血清样本中sher2的高特异性识别、高效信号转换和高灵敏读出，为乳腺癌早期诊断、精准分层及治疗动态监测提供可靠平台。

2、目的一，为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种pt1/pdceb单原子纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

3、（1）将表面活性剂溶解于水中，依次加入氟源、硼源、钯源和铈源，在碱性条件下混合，加入还原剂并在加热条件下反应，得到pdceb纳米酶；

4、（2）将所述pdceb纳米酶与氨基化试剂混合进行氨基化修饰，得到氨基化pdceb纳米酶；

5、（3）将所述氨基化pdceb纳米酶与铂前驱体混合使铂离子配位锚定，加入还原剂进行化学还原反应，使铂物种以单原子形式分散于pdceb表面，得到pt1/pdceb单原子纳米酶。

6、优选的，作为一种改进，所述表面活性剂为二十八烷基二甲基氯化铵，所述氟源为氟化铵，所述硼源为硼酸，所述钯源为四氯钯酸，所述铈源为硝酸铈，所述还原剂为硼烷二甲胺络合物；所述氨基化试剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；所述铂前驱体为六氯铂酸铵，所述还原剂为硼氢化钠。

7、目的二，本发明提供一种采用目的一所述方法制备得到的一种pt1/pdceb单原子纳米酶。

8、目的三，本发明还提供了一种用于血清her2检测的电致化学发光传感器，其为目的二所述pt1/pdceb单原子纳米酶联合crispr/cas12a级联放大的电致化学发光传感器，包括：

9、her2识别与信号转换体系：用于将her2蛋白识别信号转化为核酸激活链信号；

10、crispr/cas12a正反馈级联放大体系：包括至少两级cas12a反应体系，用于在无需对her2靶标进行预扩增的条件下放大检测信号；

11、探针修饰电极：其表面修饰有检测探针s2；

12、单原子纳米酶标记物pt1/pdceb-s1：为连接有核酸探针s1的pt1/pdceb单原子纳米酶；

13、电化学发光反应液：包含鲁米诺和溶解氧；

14、当待测样品中存在her2时，her2诱导释放第一核酸激活链，激活crispr/cas12a正反馈级联反应，切割电极表面的检测探针s2，使pt1/pdceb-s1在电极表面的结合量降低，引起鲁米诺/溶解氧体系的电致化学发光信号降低，实现对her2的定量检测。

15、优选的，作为一种改进，所述her2识别与信号转换体系包括适配体功能化磁珠，所述适配体功能化磁珠由链霉亲和素磁珠与生物素标记的her2适配体；her2存在时，适配体特异性结合her2并释放所述第一核酸激活链。

16、优选的，作为一种改进，所述crispr/cas12a正反馈级联放大体系包括：

17、crrna i/cas12a 复合物：包含cas12a蛋白和crrna i；

18、crrna ii/cas12a 复合物：包含cas12a蛋白和crrna ii；

19、单链 dna 探针和/或双环转换探针（dctp）的单链环状区域；

20、第一核酸激活链激活crrna i/cas12a 切割单链 dna 探针和/或双环转换探针（dctp）的单链环状区域转化得到第二核酸激活链，第二核酸激活链激活crrna ii/cas12a，形成正反馈级联放大。

21、优选的，作为一种改进，所述pt1/pdceb单原子纳米酶具有类氧化酶催化活性，用于催化溶解氧生成活性氧物种，增强鲁米诺电致化学发光响应。

22、目的四，本发明所述电致化学发光传感器在制备用于血清her2体外检测的试剂或试剂盒中的应用。

23、优选的，作为一种改进，所述传感器对血清her2的检测线性范围为10-3～104ng/ml，检测限为0.513 pg/ml；所述电化学发光反应液中鲁米诺的浓度为0.1 mm，ph为7.5。

24、目的五，本发明所述的电致化学发光传感器在制备用于乳腺癌辅助诊断、her2表达分层分析或靶向治疗动态监测的试剂或试剂盒中的应用。

25、本发明公开了一种基于pt1/pdceb单原子纳米酶联合crispr/cas12a级联放大系统的her2电致化学发光检测新方法，构建了一套可用于血清样本her2精准检测的新型电致化学发光传感器，有效攻克了复杂血清基质干扰、蛋白检测信号转导效率低、检测灵敏度不足等行业难题，为乳腺癌早期诊断、her2精准分型及治疗动态监测提供了便捷、灵敏、可靠的全新技术平台。

26、本发明的核心技术体系由三重技术的协同，各技术版块相互联动，实现了her2从特异性识别、信号放大到信号增强的完整高效检测流程。

27、其中，适配体功能化磁珠识别与信号转换体系通过将her2特异性适配体与磁珠结合，形成高特异性的磁性识别探针。靶标存在时，血清样本中的her2可与探针适配体发生特异性结合，引发探针结构改变并释放互补的核酸激活链，经磁分离实现目标蛋白分离及信号转换，该核心设计创新性地将her2蛋白识别的生物事件，高效转化为可被crispr/cas12a系统识别的核酸信号，为后续信号级联放大反应提供核心基础。。

28、crispr/cas12a正反馈级联扩增体系中，本发明摒弃传统pcr、等温扩增等额外预扩增步骤，依托内源性正反馈循环实现信号自主放大。磁珠识别过程所释放的核酸激活链，率先激活crrna i/cas12a复合物，启动反式切割活性，对体系中的单链dna探针和双环转换探针（dctp）的单链环状区域进行切割，切割后的dctp转化生成激活链ii，进一步激活crrnaii/cas12a复合物，形成持续循环的正反馈级联扩增效应，将体系中微量的初始核酸信号转化为持续增强的切割信号，显著提高her2的检测灵敏度。

29、pt1/pdceb单原子纳米酶的制备包括三步：（一）一锅法合成pdceb纳米酶，将dodac、氟化铵、硼酸、氯钯酸、硝酸铈等原料混合加热反应，制备得到分散性与基础催化性能优异的pdceb纳米材料；（二）氨基化修饰，在pdceb表面引入含氨基官能团，为铂物种提供锚定位点；（三）低温化学还原，引入铂前驱体，使铂物种以单原子形式稳定分散于pdceb表面。该纳米酶高效的催化体系中的溶解氧转化为活性氧，增强鲁米诺/溶解氧体系ecl响应，提升信号并有效的降低背景干扰。

30、综上所述，本发明创新性的融合以上三大核心技术，通过适配体磁珠实现sher2特异性识别与蛋白-核酸信号高效转换，通过crispr/cas12a正反馈级联体系完成核酸信号无外源扩增式放大，通过pt1/pdceb单原子纳米酶增强ecl输出，三重机制协同实现复杂血清样本中her2的高灵敏检测，具有操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强和适合动态监测等优势，为乳腺癌早期诊断、her2表达分层及个体化治疗监测提供了全新且可靠的技术支撑。