一种纳米酶生物传感器及其制备方法与应用

本发明属于纳米生物传感、食品微生物检测及分析化学，涉及一种纳米酶生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、目前针对金黄色葡萄球菌的常规检测手段包括平板培养法、聚合酶链式反应（pcr）、酶联免疫吸附试验（elisa）等，同时也逐步发展出电化学、光学等新型生物传感平台。传统化学发光（cl）体系多为闪光型发光，发光信号衰减速度快，对检测时序要求严苛，极大限制了信号采集灵活性与长时间成像能力。

3、纳米酶因具备多功能类酶催化特性，已成为双信号检测体系中极具潜力的纳米标记材料。具有类过氧化物酶（pod）、类氧化酶（oxd）活性的纳米酶可催化显色反应实现可视化快速筛查，也可催化鲁米诺-过氧化氢体系产生化学发光，实现多模式信号输出；同时纳米酶催化过程产生的活性氧（ros）可破坏细菌细胞膜，赋予纳米酶体系抑菌功能。

4、过氧化钙（cao2）可持续释放过氧化氢（h2o2），是构建长效化学发光体系的理想自供h2o2材料，但其自身分解速率难以调控，长期稳定性不佳。同时，现有多孔核壳纳米酶、金属有机框架、纳米多面体等材料虽可延长化学发光时长，但仍存在发光稳定性不足、检测模式单一、易出现假阳性结果、无同步抑菌功能等缺陷。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种纳米酶生物传感器及其制备方法与应用，本发明结合沸石咪唑酯骨架材料 zif-67、银纳米颗粒（ag nps）与cao2，构建zif-67@cao2-ag三元纳米酶，耦合熵驱动链置换反应（sdr）构建双模式生物传感器，实现金黄色葡萄球菌高灵敏、高特异性检测，同时兼具长效发光、交叉验证、细菌灭活功能，能够弥补现有检测技术的短板。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，一种三元纳米酶，以zif-67为基体，内部负载cao2、表面负载银纳米颗粒（ag nps）；所述三元纳米酶的结构为管状结构，且管状结构的宽度为60~65 nm；所述三元纳米酶的表面粗糙度比zif-67的表面粗糙度高。

4、本发明将cao2包覆于zif-67的纳米酶基质中，可兼顾h2o2持续释放与催化活性提升，在酸性条件下快速生成h2o2，中性环境中缓慢、长效释放h2o2。同时，负载ag nps形成三元纳米酶能够兼具协同类过氧化物酶活性、自供h2o2能力、超长余辉化学发光性能与抑菌性能。

5、第二方面，一种本发明第一方面所述的三元纳米酶的制备方法，包括如下步骤：

6、提供ag nps胶体溶液；

7、将cao2、甲醇、钴盐和所述ag nps胶体溶液混合均匀，获得第一分散液；

8、向第一分散液中加入聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，获得第二分散液；

9、向第三分散液中加入2-甲基咪唑溶液，混合均匀，室温静置反应20~28 h；

10、将反应后的物料固液分离，洗涤即得。

11、第三方面，一种纳米酶生物传感器，包括：

12、细菌识别单元，用于识别金黄色葡萄球菌并释放t链，其包括第一磁性纳米颗粒、适配体和t链，所述第一磁性纳米颗粒与适配体通过共价键连接，适配体与t链通过碱基互补杂交复合；所述适配体的序列如seq id no:1所示，t链的序列如seq id no:6所示；

13、熵驱动信号放大单元，用于t链引发熵驱动链置换反应并释放纳米酶，其包括第二磁性纳米颗粒、p1链、p2链、p3链、p4链以及本发明第一方面所述的三元纳米酶，第二磁性纳米颗粒与p3链通过共价键连接，p1链与所述三元纳米酶通过金属-巯基连接，p1链、p2链、p3链通过碱基互补杂交复合，p4链作为熵驱动链置换反应过程中燃料链参与循环反应；p1链的序列如seq id no:2所示，p2链的序列如seq id no:3所示，p3链的序列如seq id no:4所示，p4链的序列如seq id no:5所示；

14、双模式信号检测单元，用于进行化学发光检测和比色检测。

15、第四方面，一种本发明第三方面所述的纳米酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

16、将羧基化的第一磁性纳米颗粒与3'端修饰氨基的适配体进行酰胺化反应，获得第一磁性纳米颗粒/适配体复合物；

17、将第一磁性纳米颗粒/适配体复合物与t链进行孵育，使得适配体与t链通过碱基互补杂交复合，获得第一磁性纳米颗粒/适配体/t链复合物；

18、将羧基化的第二磁性纳米颗粒与5'端修饰氨基的p3链进行酰胺化反应，获得第一磁性纳米颗粒/p3链复合物；

19、将所述三元纳米酶与5'端修饰氨基的p1链进行孵育，使得p1链与所述三元纳米酶通过金属-巯基连接，获得p1-mof复合物；

20、将第一磁性纳米颗粒/p3链复合物与p1-mof复合物、p2链进行孵育，使得p1链、p2链、p3链通过碱基互补杂交复合。

21、第五方面，一种本发明第三方面所述的纳米酶生物传感器在检测金黄色葡萄球菌或制备检测金黄色葡萄球菌的产品中的应用。

22、第六方面，一种本发明第三方面所述的纳米酶生物传感器在生物成像或长时间光学传感领域中的应用。

23、本发明的有益效果为：

24、本发明以zif-67为载体共负载过氧化钙与银纳米颗粒，制得兼具协同类过氧化物酶活性、长效自供 h2o2、超长余辉发光、抑菌多重功能的 zif-67@cao2-ag 纳米酶；该纳米酶催化鲁米诺体系发光 12 h 仅损失 7.5% 信号，克服传统闪光型化学发光信号快速衰减缺陷。本发明耦合金黄色葡萄球菌特异性适配体识别技术与熵驱动链置换信号放大电路，构建磁分离双信号检测体系：反应上清用于超长余辉化学发光定量，磁性沉淀实现无外源h2o2参与的tmb比色定量，两种信号变化趋势相反，可实现检测结果交叉验证，有效降低假阳性、假阴性干扰。本发明整套检测体系线性范围为10~108cfu/ml，化学模式检测限低至0.43cfu/ml，比色模式检测限0.83 cfu/ml，对大肠杆菌、沙门氏菌、各类氨基酸、蛋白、维生素等干扰物质无明显响应，特异性优异。zif-67@cao2-ag纳米酶可破坏金黄色葡萄球菌细胞壁，检测同步实现菌体灭活，避免样品二次污染；牛奶、雪碧等实际食品样本加标回收率处于80.69%~111.31%区间，检测准确度与精密度满足食品安全现场筛查需求。本发明纳米酶制备工艺温和易放大，传感体系操作简便、无需严格时序控制，可广泛应用于食品、临床、环境基质中金黄色葡萄球菌快速定量检测，同时可拓展至长时间生物成像、原位抗菌领域。

1.一种三元纳米酶，其特征是，以zif-67为基体，内部负载cao2、表面负载ag nps；所述三元纳米酶的结构为管状结构，且管状结构的宽度为60~65 nm；所述三元纳米酶的表面粗糙度比zif-67的表面粗糙度高。

2.一种权利要求1所述的三元纳米酶的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，将cao2、甲醇、钴盐和所述ag nps胶体溶液混合均匀的方法为涡旋；

4.一种纳米酶生物传感器，其特征是，包括：

5.一种权利要求4所述的纳米酶生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，羧基化的第一磁性纳米颗粒与3'端修饰氨基的适配体进行酰胺化反应的过程中，采用edc和nhs对第一磁性纳米颗粒的羧基进行活化；

7.一种权利要求4所述的纳米酶生物传感器在检测金黄色葡萄球菌或制备检测金黄色葡萄球菌的产品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

9.如权利要求7所述的应用，其特征是，金黄色葡萄球菌位于食品、环境或临床样本。

10.一种权利要求4所述的纳米酶生物传感器在生物成像或长时间光学传感领域中的应用。