一种深共熔溶剂及其制备方法和在提取真菌几丁质中的应用

本发明涉及绿色溶剂化学与天然高分子提取，具体涉及一种深共熔溶剂及其制备方法和在提取真菌几丁质中的应用。

背景技术：

1、真菌细胞壁含有丰富的几丁质，含量通常占细胞壁干重的15%～45%，主要以β-几丁质晶型存在，与β-1,3-葡聚糖和蛋白质共同构成几丁质复合体，具有免疫调节、抗肿瘤辅助等生物活性及高韧性、生物相容性等材料性能。可利用的真菌来源包括双孢菇（

agaricus

bisporus）废弃物（黑曲霉、青霉等），均属农业/工业废弃物，资源化价值显著。中国是全球最大的双孢菇生产国，2022年双孢菇（

agaricus bisporus）栽培产量超过380万吨，约占全球总产量的80%。双孢菇加工过程中产生大量废弃物，包括菌柄、菌伞次等品及采后残余培养基，废弃物比例约占鲜菇质量的25%～35%，即每年产生约95～133万吨双孢菇废弃物。上述废弃物几丁质含量为鲜菇干基的10%～20%，据此估算全国双孢菇加工废弃物中可提取几丁质资源达5～10万吨/年，目前主流处置方式仍以堆肥或直接填埋为主，资源浪费严重且存在潜在的环境污染风险。将双孢菇废弃物作为几丁质原料来源，既可实现农业废弃物高值化利用，又可缓解现有甲壳类几丁质来源对海洋捕捞季节性制约的依赖，具有重要的产业化推广价值。

2、传统提取工艺存在严重缺陷：需使用1~5 mol/l naoh在90 ℃以上长时间处理（大量废碱液排放），几丁质聚合度下降30%～50%；工艺步骤多（通常4～6步）、能耗高；脱乙酰度难以精确控制；伴生β-葡聚糖等有益成分在强碱条件下被破坏。

3、深共熔溶剂（des）作为新一代绿色溶剂，由氢键受体（hba）和氢键供体（hbd）以特定摩尔比混合形成，具有原料天然、成本低、可生物降解、毒性低等优势。已有文献报道将des用于真菌来源几丁质或几丁质-葡聚糖复合体的分离，例如以氯化胆碱/有机酸、氯化胆碱/多元醇等二元des体系处理蘑菇、香菇等真菌原料。上述二元des能够在一定程度上溶胀真菌细胞壁并降低蛋白残留，但其氢键供体类型单一，对真菌细胞壁中几丁质-β-葡聚糖-蛋白质多重交联结构的选择性破坏能力不足，通常存在提取纯度不足、蛋白脱除率偏低、分子量保护与脱乙酰度调控难以兼顾、溶剂黏度较高导致传质效率低以及循环使用性能缺乏系统验证等问题。

4、本发明通过系统筛选，确定以草酸、柠檬酸、苹果酸或戊二酸作为第一氢键供体，以三种结构各异的天然氨基酸——脯氨酸（环状仲胺型）、丝氨酸（β-羟基型）、赖氨酸（ε-氨基型）——作为第二氢键供体，与氯化胆碱组合构成多元des体系。不同有机酸提供差异化酸性环境（草酸最强、戊二酸最温和），不同氨基酸提供差异化氢键网络（赖氨酸氢键位点丰富），两者协同作用，实现对真菌细胞壁几丁质-葡聚糖共价键的选择性破坏，所得几丁质复合体纯度可达87%以上，远优于传统工艺。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种深共熔溶剂及其制备方法与在提取真菌几丁质中的应用。本发明提供了一种以季铵盐、二元羧酸和含羟基/环状仲胺基团天然氨基酸为组分的多元des新型组合物，作为可完全替代强酸强碱的绿色溶剂，用于真菌几丁质复合体的高效、温和、可控提取。具体地，本发明提供了一种以氯化胆碱为氢键受体、以草酸、柠檬酸、苹果酸或戊二酸之一为第一氢键供体、以脯氨酸、丝氨酸或赖氨酸之一或两种为第二氢键供体制备的多元深共熔溶剂（des）及其用于真菌几丁质复合体绿色高效提取的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种深共熔溶剂及其制备方法与在提取真菌几丁质中的应用。具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种深共熔溶剂，其包括氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体；其中，

4、所述的氢键受体选自氯化胆碱（chcl）；所述的第一氢键供体选自草酸、柠檬酸、苹果酸和戊二酸中的任意一种；所述的草酸、柠檬酸、苹果酸和戊二酸均为食品级或以上规格，纯度不低于98%。所述的第二氢键供体选自l-脯氨酸、l-丝氨酸和l-赖氨酸中的任意一种或多种的组合；所述的l-脯氨酸（pro）为环状仲胺型天然氨基酸，含吡咯烷五元环结构；所述的l-丝氨酸（ser）为β-羟基型天然氨基酸，含β位羟基结构；所述的l-赖氨酸（lys）为ε-氨基型天然氨基酸，含ε位氨基结构。所述的l-脯氨酸、l-丝氨酸和l-赖氨酸均为食品级或以上规格，纯度不低于98%。

5、所述的深共熔溶剂在室温下呈液态。

6、其中，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:0.5~3:0.2~1.2。在本发明的一些实施方式中，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:0.5~1:0.3~0.5。

7、在本发明的另一些实施方式中，当所述的第一氢键供体选自草酸、苹果酸和戊二酸中的任意一种时，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:1:0.3~0.5；

8、当所述的第一氢键供体选自柠檬酸时，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:0.5:0.3~0.5；

9、当所述的第二氢键供体选自l-脯氨酸或l-丝氨酸时，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:0.5~1:0.5；

10、当所述的第二氢键供体选自l-赖氨酸时，所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体的摩尔比为1:0.5~1:0.3。

11、第二方面，本发明提供了第一方面所述的深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤，将所述的氢键受体、第一氢键供体和第二氢键供体按摩尔比混合，搅拌至完全熔融且液体均匀透明，得到室温下呈液态的深共熔溶剂。其中，所述的搅拌，搅拌温度为60～120 ℃，搅拌时间为30～120 min。在本发明的一些实施方式中，所述的制备过程中无需添加水或任何其它溶剂。

12、在本发明的一些实施方式中，所述的搅拌温度为100 ℃，搅拌时间为60~70 min。

13、第三方面，本发明提供了第一方面所述的深共熔溶剂在提取真菌几丁质复合体中的应用。

14、其中，所述的真菌包括双孢菇（

agaricus bisporus）废弃物。

15、在本发明的一些实施方式中，所述的几丁质复合体，为包括几丁质和β-葡聚糖在内的真菌细胞壁多糖共存产物。

16、在本发明的一些实施方式中，所述的深共熔溶剂在提取真菌几丁质中的应用可完全替代传统强酸强碱提取工艺，废液cod降低90%以上。

17、第四方面，本发明一种提取真菌几丁质复合体的方法，包括如下步骤，将真菌生物质原料与第一方面所述的深共熔溶剂（提取介质）混匀后进行提取，得到几丁质复合体。所述的几丁质复合体纯度不低于87%。在本发明的一些实施方式中，所述的真菌生物质原料经洗净烘干、粉碎研磨并过40~80目筛后再与所述的深共熔溶剂（提取介质）混匀进行提取。

18、其中，所述的真菌生物质原料包括双孢菇（

agaricus bisporus）废弃物。在本发明的一些实施方式中，所述的真菌生物质原料中几丁质含量不低于10%（干基）。

19、其中，所述的真菌生物质原料和深共熔溶剂的混合料液比为1:10~30 g/ml，即所述的深共熔溶剂的用量以每克真菌生物质原料使用10~30 ml的深共熔溶剂计，在本发明的一些实施方式中，所述的混合料液比为1:15~25 g/ml，即所述的深共熔溶剂的用量以每克真菌生物质原料使用15~25 ml的深共熔溶剂计。所述的提取，提取温度为60~120℃，提取时间为1~8 h；在本发明的一些实施方式中，所述的提取，提取温度为80~100℃，提取时间为3~5 h，搅拌速率为300~600 rpm。

20、在本发明的一些实施方式中，所述的方法包括深共熔溶剂回收，所述的深共熔溶剂回收，为提取结束后收集固液分离的上清液（液相），经减压浓缩后得到回收深共熔溶剂，以进行循环使用，所述的回收深共熔溶剂的循环使用次数不低于5次。在本发明的一些实施方式中，所述的深共熔溶剂回收，为将固液分离得到的液相于40~50 ℃减压蒸发浓缩至原体积15%~25%，于70~100℃搅拌均化后回收深共熔溶剂；所述深共熔溶剂回收率不低于85%，每次循环纯度下降幅度不超过5%。

21、在本发明的一些实施方式中，所述的混匀，利用超声辅助分散，所述的超声，超声条件为40 khz、60 w、10 min。

22、在本发明的一些实施方式中，将提取后得到的体系进行固液分离，收集固相，固相以去离子水洗涤至洗涤液电导率低于10 μs/cm、ph为6.5～7.5，干燥，得几丁质复合体。所述的固液分离，为3000~8000 rpm离心10~20 min；所述的干燥，为-50~-40 ℃冷冻干燥48h。

23、第五方面，本发明提供了第四方面所述的方法提取得到的几丁质复合体。几丁质复合体纯度不低于87%；傅里叶变换红外光谱（ft-ir）在1655±10 cm-1（酰胺i带）和1560±10 cm-1（酰胺ii带）处具有几丁质特征吸收峰；凝胶渗透色谱（gpc）测定重均分子量不低于1.0×105 da；蛋白质残留率不超过5%；灰分不超过3%。

24、有益效果：

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、（1）全组分天然绿色：氯化胆碱（食品添加剂）、草酸/柠檬酸/苹果酸/戊二酸（天然有机酸）、脯氨酸/丝氨酸/赖氨酸（天然氨基酸）均为gras级物质，完全取代hcl/naoh体系，废液cod降低90%以上，满足iso 14001绿色生产要求；

27、（2）高分子量保护：温和酸性环境选择性破坏细胞壁蛋白质-几丁质连接键而不攻击几丁质糖苷键，所得产物mw较传统碱法高1.5倍以上（des-a达1.32×105 da，较传统法0.65×105 da提高103%）；

28、（3）高纯度：所得几丁质复合体纯度不低于87%，傅里叶变换红外光谱确认几丁质酰胺特征峰完整，gpc测定重均分子量不低于1.0×105 da；

29、（4）脱乙酰度精确可控：通过调节氨基酸类型与比例，脱乙酰度在5%～25%范围内精确调控（偏差≤2%）；

30、（5）溶剂可循环：回收率≥85%，循环5次后性能损失<5%。