一种罗氏链霉菌SF-14、其无菌发酵滤液及在防治西瓜枯萎病中的应用

本发明涉及植物病害生物防治，具体为一种罗氏链霉菌sf-14、其无菌发酵滤液及在防治西瓜枯萎病中的应用。

背景技术：

1、西瓜是我国重要的设施作物和经济作物。西瓜枯萎病是一种典型的土传病害，其主要病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型。该病害可造成西瓜植株萎蔫、枯死，在重病田中可造成较高的发病率，严重影响西瓜产量和品质。

2、目前，西瓜枯萎病的防治主要采用化学药剂防治和抗病品种选育等措施。长期使用化学药剂容易造成病原菌抗药性增强、土壤微生态环境受到影响以及农药残留等问题；抗病品种则可能受到病原菌生理小种、栽培环境和生产条件等因素的影响。因此，开发高效、环境友好的生物防治菌株及其发酵产物，对于西瓜枯萎病的绿色防控具有重要意义。

3、链霉菌属微生物能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物以及多种水解酶，在植物病害生物防治领域具有较好的应用潜力。罗氏链霉菌作为链霉菌属中的一种微生物资源，已被用于植物病原微生物拮抗研究。

4、与直接使用活菌相比，无菌发酵滤液不含活菌，其活性成分主要来源于菌株发酵过程中产生并释放到培养液中的代谢产物，因此便于进行活性评价、成分分析、质量控制以及后续制剂开发。

5、现有技术中已经公开了部分用于防治西瓜枯萎病的生防菌及其代谢产物，但现有技术中尚缺乏来源于连作西瓜大棚健康西瓜植株根际土壤、且对尖孢镰刀菌西瓜专化型具有较强拮抗作用，同时能够促进西瓜植株生长的罗氏链霉菌及其无菌发酵滤液。

6、因此，有必要筛选新的具有拮抗活性的微生物资源，并进一步开发其发酵产物在西瓜枯萎病防治中的应用。

技术实现思路

1、针对现有西瓜枯萎病生物防治菌株及其发酵产物资源不足的问题，本发明的目的在于提供一株具有拮抗活性的罗氏链霉菌sf-14。

2、本发明的另一目的在于提供所述罗氏链霉菌sf-14的无菌发酵滤液。

3、本发明的另一目的在于提供含有所述罗氏链霉菌sf-14和/或其无菌发酵滤液的生物防治菌剂。

4、本发明的另一目的在于提供所述无菌发酵滤液的制备方法。

5、本发明的另一目的在于提供所述罗氏链霉菌sf-14、无菌发酵滤液及生物防治菌剂在防治西瓜枯萎病和促进西瓜生长中的应用。

6、为实现上述目的，本发明提供一株罗氏链霉菌sf-14。

7、所述罗氏链霉菌sf-14由发明人从江苏省宿迁市连作西瓜大棚中健康西瓜植株的根际土壤中采集，经梯度稀释涂布分离、划线纯化，并通过平板对峙试验筛选获得。

8、所述罗氏链霉菌sf-14在高氏一号培养基上形成圆形、干燥、致密的菌落，初期菌落呈白色粉状，随着培养时间延长逐渐变为灰白色至浅灰色；气生菌丝发达，呈白色至浅灰色；基内菌丝呈乳白色至略带褐色；孢子丝呈螺旋形至波浪形；孢子呈椭圆形，表面光滑。

9、所述罗氏链霉菌sf-14具有产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和几丁质酶的能力。

10、所述菌株的16srrna基因序列长度为1385bp，与罗氏链霉菌（streptomycesrochei）mk166029.1的相似性为99.64%，并在系统发育树中与罗氏链霉菌模式菌株nrrlb-1559（nr_116078.1）聚于同一分支。

11、本发明还提供一种所述罗氏链霉菌sf-14的无菌发酵滤液。

12、所述无菌发酵滤液的制备方法包括：将罗氏链霉菌sf-14活化后接种于液体发酵培养基中进行振荡培养，获得发酵液；将发酵液离心，收集上清液；将所述上清液经微孔滤膜过滤除菌，得到无菌发酵滤液。

13、优选地，所述液体发酵培养基为高氏一号液体培养基。

14、优选地，液体发酵温度为25℃～30℃，振荡转速为120r/min～200r/min，培养时间为48h～120h。

15、优选地，发酵温度为28℃，振荡转速为180r/min，培养时间为72h。

16、优选地，所述发酵液在4℃条件下进行离心，离心转速为8000r/min～12000r/min，离心时间为5min～15min。

17、优选地，采用孔径不大于0.22μm的微孔滤膜对所得上清液进行过滤除菌。

18、本发明还提供一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂的活性成分包括所述罗氏链霉菌sf-14和/或所述无菌发酵滤液，并含有农业上可接受的载体和/或助剂。

19、所述生物防治菌剂可以根据实际使用需要制备为液体剂、悬浮剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或微胶囊剂。

20、本发明还提供所述罗氏链霉菌sf-14、无菌发酵滤液或生物防治菌剂在制备防治西瓜枯萎病的生物防治产品中的应用。

21、所述西瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型。

22、本发明还提供所述无菌发酵滤液或生物防治菌剂在制备西瓜促生产品中的应用。

23、本发明还提供一种防治西瓜枯萎病的方法，包括向西瓜种子、西瓜植株、西瓜植株根部和/或根际土壤施用有效量的罗氏链霉菌sf-14、所述无菌发酵滤液或所述生物防治菌剂。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

25、1.本发明提供的罗氏链霉菌sf-14来源于连作西瓜大棚健康西瓜植株根际土壤，经分离、纯化和拮抗活性筛选获得，对尖孢镰刀菌西瓜专化型具有较好的拮抗作用。

26、2.本发明提供的无菌发酵滤液无需直接施用活菌即可发挥抑菌作用。试验结果表明，所述无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长的抑制率达到62.3%。

27、3.盆栽试验结果表明，采用所述无菌发酵滤液处理后，西瓜枯萎病病情指数由58.67降低至22.67，防治效果达到61.37%；同时西瓜株高由11.33cm提高至13.70cm，植株干重由0.67g提高至0.69g，表明所述无菌发酵滤液同时具有病害防治和促进西瓜生长的作用。

28、4.本发明的无菌发酵滤液能够诱导尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝胞内活性氧积累，并对病原菌抗氧化防御系统产生影响。试验结果显示，无菌发酵滤液处理后，病原菌的cat、pod和gr等抗氧化相关酶活性受到影响，同时mda含量升高。

29、5.本发明进一步通过lc-ms/ms非靶向代谢组学分析获得无菌发酵滤液的代谢物变化特征，为后续活性物质分离、活性追踪、质量控制及制剂开发提供依据。

1.一种罗氏链霉菌sf-14，其特征在于：

2.一种罗氏链霉菌sf-14的无菌发酵滤液，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的无菌发酵滤液，其特征在于：

4.一种生物防治菌剂，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的生物防治菌剂，其特征在于：

6.一种制备权利要求2或3所述无菌发酵滤液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

9.权利要求1所述的罗氏链霉菌sf-14、权利要求2或3所述的无菌发酵滤液或者权利要求4或5所述的生物防治菌剂在制备防治西瓜枯萎病的生物防治产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

11.权利要求2或3所述的无菌发酵滤液或者权利要求4或5所述的生物防治菌剂在制备西瓜促生产品中的应用。

12.一种防治西瓜枯萎病的方法，其特征在于：

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：