一种高纯度低降解硫酸软骨素的制备方法、硫酸软骨素及其应用与流程

本技术涉及硫酸软骨素加工领域，更具体地说，它涉及一种高纯度低降解硫酸软骨素的制备方法、硫酸软骨素及其应用。

背景技术：

1、硫酸软骨素是一类天然高分子糖胺聚糖类多糖钠盐，具备优良的生物相容性、保湿性、关节养护及抗炎活性，应用场景极为广泛。

2、现有工业化制备工艺主要分为高温强碱水解法、单一酶解法、普通醇沉纯化法三类；但高温、强酸碱体系极易打断多糖糖苷键，产物降解严重，大量生成低分子碎片，有效高分子多糖占比低；常规提取体系选择性差，蛋白、油脂、色素杂质同步溶出，后续除杂压力大，成品纯度难以突破高端标准；钠盐转化过程多为直接强碱中和，ph突变剧烈，造成二次降解，产物稳定性差、分子量分布宽；缺少分级精制步骤，成品高低分子混杂，批次差异大。

3、因此，如何制备一种新的硫酸软骨素，同时具有低降解、高纯度、窄分布、高稳定性的优点，是一个亟需解决的问题。

技术实现思路

1、为了制备一种新的硫酸软骨素，同时具有低降解、高纯度、窄分布、高稳定性的优点，本技术提供一种高纯度低降解硫酸软骨素的制备方法、硫酸软骨素及其应用。

2、第一方面，本技术提供一种高纯度低降解硫酸软骨素，采用如下的技术方案：

3、一种高纯度低降解硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

4、s1、将动物软骨粉碎，通过松弛处理，得到预处理软骨原料；

5、s2、将预处理软骨原料置于水-醇双相体系中搅拌溶出处理，得初提液；

6、s3、对初提液进行等电点絮凝耦合微量助滤吸附处理，离心过滤，得透明澄清多糖液；

7、s4、透明澄清多糖液先采用醇沉处理、然后进行盐梯度分级处理，得到精制多糖液；

8、s5、精制多糖液采用钠盐置换定型处理，得到半成品；

9、s6、半成品经超滤、无菌过滤后冻干处理，得到成品。

10、通过采用上述技术方案，粉碎后的动物软骨经过松弛处理，可以温和打断蛋白聚糖非共价结合力，不易破坏多糖糖苷键，然后溶出处理过程中，依靠水-醇双相配合溶出硫酸软骨素多糖，抑制杂蛋白、脂溶性杂质溶出，配合后续絮凝、助滤吸附处理，特异性去除残留杂蛋白、多肽和色素前驱体，离心后得到清澈的硫酸软骨素多糖液，然后利用醇沉去除粗分，配合盐梯度分级处理的双效精制工艺，剔除低分子降解碎片与残留水溶性杂质，富集高分子完整多糖组分，得到窄分布精制多糖液；然后利用钠盐置换定型处理，温和完成硫酸软骨素的稳态转化，控制多糖降解，保证硫酸软骨素的收率，最后配合超滤处理，进一步提高硫酸软骨素的纯度，使硫酸软骨素具有低降解、高纯度、窄分布、高稳定性的优点。

11、优选的，所述松弛处理的具体步骤如下：采用质量分数0.3-0.8%的碳酸钠溶液，在18-25℃条件下恒温处理2-4h。

12、通过采用上述技术方案，采用0.3-0.8%低浓度碳酸钠溶液，在18-25℃低温条件下处理2-4h，远低于传统浓碱长时间提取的工艺条件，既可以温和打断硫酸软骨素与核心蛋白之间的o-糖苷键，又不会破坏多糖主链的β-1,3、β-1,4糖苷键，从源头避免多糖链断裂降解，保证硫酸软骨素的低降解、高稳定性的优点，并且多糖分子不易过度断裂，还能够硫酸软骨素分子量的均一分布；同时低浓度碳酸钠的温和处理，可先将软骨表面附着的脂肪、结缔组织等杂质初步皂化、溶出，避免这类杂质进入后续提取工序，从源头减少杂质夹带，可以提高硫酸软骨素的制备纯度。

13、优选的，所述水-醇双相体系中乙醇体积分数为12-22%，提取温度为22-30℃，搅拌溶出处理的时间为3-5h。

14、通过采用上述技术方案，限定乙醇体积分数以及温度，阻止硫酸软骨素中的多糖主链被破坏，限定溶出时间，缩短了有效成分在液相中的停留时间，具有低降解的优点；并且水-乙醇的双相体系能够保证目标多糖充分溶出，低温环境下杂蛋白溶解度进一步降低，降低杂蛋白、脂肪、色素等杂质的溶解度，保证硫酸软骨素的纯度；同时水-醇双相体系的低温处理，不易对硫酸软骨素的分子长链产生无规则剪切，保证分子链的完整，不易出现大量小分子片段，保证分子量均一性，具有窄分布的优点，还具有较高的结构稳定性。

15、优选的，所述等电点絮凝的ph为5.6-6.3，微量助滤吸附处理：采用辣木籽蛋白复合料作为絮凝剂配合硅藻土作为助滤剂，絮凝静置30-50min，离心转速8500-10000r/min。

16、通过采用上述技术方案，硫酸软骨素的初提液在ph5.6-6.3的条件下，杂蛋白、多肽带负电荷，辣木籽蛋白富含阳离子氨基酸残基，在该弱酸性条件下带正电，通过静电吸附吸引杂蛋白和多肽杂质，使杂质聚集絮凝辣；并且辣木籽蛋白分子链具有长链结构，可以同步吸附多个杂质微粒，实现杂质-蛋白-杂质的网状絮凝体，增大絮凝尺寸和沉降速度，配合硅藻土对絮凝体的束缚吸引，阻止小絮凝体穿过滤层，配合离心操作，进一步降低杂质含量，提高硫酸软骨素的纯度；同时辣木蛋白多肽链含疏水氨基酸片段，与杂质中脂肪微滴、疏水杂蛋白发生疏水相互作用，高效脱除脂溶性杂质，使硫酸软骨素具有纯度高的优点。

17、优选的，所述辣木籽蛋白复合料由质量比为1:0.5-1的季铵盐改性辣木籽蛋白、单宁改性细菌纤维素组成。

18、通过采用上述技术方案，辣木籽蛋白通过季铵盐实现表面电荷修饰，增强其与阴离子物质的静电吸附能力；杂蛋白、多肽和色素等杂质带负电，辣木籽蛋白表面的季铵盐带正电荷，季铵盐物质快速且稳定吸附杂质物质，解决天然辣木蛋白氨基质子化不足的问题，提高季铵盐改性辣木籽蛋白对负电荷杂质的吸附稳定性和吸附量，从而降低杂质含量。

19、单一辣木籽蛋白的分子链较短，利用季铵盐改性辣木籽蛋白的短柔性多肽链吸附多个脱稳微小杂质颗粒，形成微小絮凝体；然后配合单宁改性细菌纤维素的细菌纤维素超长纳米纤维结构提供长链桥联效果，形成多级交联絮团，形成纤维素网络缠绕连接形成体积大的絮凝体，束缚微小絮凝体，形成细菌纤维素作为连接桥梁串联微小絮凝体，离心处理，便于进一步降低杂质含量；同时细菌纤维素表面负载的大量单宁物质，可以进一步吸附杂质分子，并且单宁与辣木籽蛋白、杂质的连接，稳定絮凝体结构，不易出现絮凝物质二次分散的问题，使杂质含量进一步降低，提高硫酸软骨素的纯度。

20、单宁为多羟基多酚，单个单宁分子含多个羟基，细菌纤维素表面大量羟基可与单宁酚羟基形成多点多重氢键，细菌纤维素不仅能够大量负载单宁物质，而且能够提高细菌纤维素的结构致密度和交联密集点，细菌纤维素中松散大孔变为介孔、微孔等，便于束缚杂蛋白、多肽的小分子杂质，提高对小分子多肽的束缚效果，单宁不会破坏细菌纤维素连续纳米纤维骨架，仅作为填充交联组分，单宁对小分子多肽吸引，配合完整三维网络结构束缚小分子多肽，进一步提高硫酸软骨素的纯度。

21、优选的，所述硅藻土为载料硅藻土，载料硅藻土是由硅藻土经活化处理后采用硅烷偶联剂kh-560接枝然后负载β-环糊精处理得到，硅藻土、硅烷偶联剂kh-560与β-环糊精的质量比为100:1.5-2.5:25-35。

22、通过采用上述技术方案，硅藻土本身具备多孔、高比表面积的物理结构，可通过范德华力、物理筛分作用初步吸附体系中部分大颗粒色素杂质，为后续功能层负载提供充足位点，同时作为絮凝骨架提升整体沉降速度，避免细小色素颗粒悬浮分散；kh-570作为硅烷偶联剂，一端的三甲氧基硅基水解生成硅羟基，与硅藻土表面的羟基发生共价键合；另一端的甲基丙烯酰氧基双键，可通过交联反应与β-环糊精的活性羟基形成稳定连接，在无机硅藻土和有机β-环糊精之间搭建化学键桥梁，避免功能层在硫酸软骨素溶液中脱落，保障改性材料的结构稳定性；β-环糊精是由7个葡萄糖单元组成的环状分子，拥有约6å的疏水内腔，可将硫酸软骨素溶液中分子量匹配的脂溶性、疏水性色素分子包裹进入内腔，形成稳定的主客体包合物，将原本溶解分散的色素分子锚定在材料表面，实现从液相到固相的转移，束缚色素杂质。

23、改性后的硅藻土材料表面保留大量活性羟基，部分未完全反应的氨基位点可与色素分子中的羧基、酚羟基等极性基团发生配位作用；同时可通过表面电荷调控，中和部分带负电的阴离子色素胶体，打破色素胶体在溶液中的稳定分散状态，促使微小色素颗粒脱稳聚集，形成可沉降的大絮体；并且负载了β-环糊精的硅藻土颗粒，在溶液中可作为絮凝核心，通过自身的长链有机改性层，将多个已被初步吸附的细小色素絮体相互连接架桥，最终形成体积更大、沉降性能更好的致密絮团，快速从硫酸软骨素体系中分离，避免色素重新返溶，提升脱色效率，减少杂质，保证硫酸软骨素的纯度。

24、优选的，所述醇沉处理采用体积分数35%～45%乙醇初步沉淀；盐梯度分级处理采用0.4～1.6mol/l氯化钠梯度分段处理。

25、通过采用上述技术方案，该乙醇浓度下可改变溶液极性，让硫酸软骨素这类大分子黏多糖优先从体系中析出，实现从稀提取液中的初步富集，大幅降低后续处理的料液体积；该低醇浓度不会让全部杂质沉淀，可先将部分溶解度更低的大分子杂蛋白、大颗粒胶体预先分离，避免高浓度醇沉时大量杂质共沉淀。

26、梯度盐洗过程中，可将与目标产物结合不牢固的杂蛋白、小分子色素、未完全去除的无机盐杂质分步洗脱，避免杂质残留在最终产品中，提升成品纯度。

27、优选的，所述钠盐置换定型处理过程中：控制体系ph6.8-7.4，滴加饱和钠盐溶液；超滤采用8～10kda超滤膜，冻干温度-18～-10℃，真空度0.08～0.1mpa。

28、通过采用上述技术方案，通过高浓度钠离子置换硫酸软骨素分子上的游离酸性基团，将其转化为性质更稳定的硫酸软骨素钠盐，大幅提升产品水溶性，同时固定分子的电荷分布，避免后续工序中出现分子聚集、沉淀等不稳定现象。

29、超滤可以去除残留的小分子杂蛋白、胶体碎片、小分子色素和多余盐分，进一步提升产品纯度。

30、第二方面，本技术提供一种高纯度低降解硫酸软骨素，采用如下的技术方案：

31、一种高纯度低降解硫酸软骨素，采用一种高纯度低降解硫酸软骨素的制备方法制备的硫酸软骨素。

32、通过采用上述技术方案，得到低降解、高纯度、窄分布、高稳定性的硫酸软骨素。

33、第三方面，本技术提供一种高纯度低降解硫酸软骨素的应用，采用如下的技术方案：

34、一种高纯度低降解硫酸软骨素的应用，硫酸软骨素在食品、保健品、化妆品或生物医药领域中的应用。

35、通过采用上述技术方案，在食品、保健品、化妆品或生物医保中发挥作用。

36、综上所述，本技术具有以下有益效果：

37、1、粉碎后的动物软骨经过松弛处理，可以温和打断蛋白聚糖非共价结合力，不易破坏多糖糖苷键，然后溶出处理过程中，依靠水-醇双相配合溶出硫酸软骨素多糖，抑制杂蛋白、脂溶性杂质溶出，配合后续絮凝、助滤吸附处理，特异性去除残留杂蛋白、多肽和色素前驱体，离心后得到清澈的硫酸软骨素多糖液，然后利用醇沉去除粗分，配合盐梯度分级处理的双效精制工艺，剔除低分子降解碎片与残留水溶性杂质，富集高分子完整多糖组分，得到窄分布精制多糖液；然后利用钠盐置换定型处理，温和完成硫酸软骨素的稳态转化，控制多糖降解，保证硫酸软骨素的收率，最后配合超滤处理，进一步提高硫酸软骨素的纯度，使硫酸软骨素具有低降解、高纯度、窄分布、高稳定性的优点。

38、2、硫酸软骨素的初提液在ph5.6-6.3的条件下，杂蛋白、多肽带负电荷，辣木籽蛋白富含阳离子氨基酸残基，在该弱酸性条件下带正电，通过静电吸附吸引杂蛋白和多肽杂质，使杂质聚集絮凝辣；并且辣木籽蛋白分子链具有长链结构，可以同步吸附多个杂质微粒，实现杂质-蛋白-杂质的网状絮凝体，增大絮凝尺寸和沉降速度，配合硅藻土对絮凝体的束缚吸引，阻止小絮凝体穿过滤层，配合离心操作，进一步降低杂质含量，提高硫酸软骨素的纯度；同时辣木蛋白多肽链含疏水氨基酸片段，与杂质中脂肪微滴、疏水杂蛋白发生疏水相互作用，高效脱除脂溶性杂质，使硫酸软骨素具有纯度高的优点。

39、3、辣木籽蛋白通过季铵盐实现表面电荷修饰，增强其与阴离子物质的静电吸附能力；杂蛋白、多肽和色素等杂质带负电，辣木籽蛋白表面的季铵盐带正电荷，季铵盐物质快速且稳定吸附杂质物质，解决天然辣木蛋白氨基质子化不足的问题，提高季铵盐改性辣木籽蛋白对负电荷杂质的吸附稳定性和吸附量，从而降低杂质含量。